质粒大量提取试剂盒(离心柱型)
一、试剂盒组成、储存、稳定性
试剂盒组成RNase A(10mg/ml)
溶液Ⅰ溶液Ⅱ溶液Ⅲ漂洗液W1漂洗液W2洗脱缓冲液EB 吸附柱AC 收集管（50ml）
保存－20℃4℃室温室温室温室温室温室温室温
5次（SP021）
300µl30ml 30ml 40ml 55ml 65ml
10次（SP022）
600µl60ml 60ml 80ml 110ml 130ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
10ml 5个5个
20ml 10个10个
本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。
注意事项
1．第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A 加入溶液Ⅰ后（终浓度100μg/ml）置于4℃保存。如
果溶液Ⅰ中RNase A 失活，提取的质粒可能会有混杂有微量RNA 残留，这时可在溶液Ⅰ中补加RNase A 即可。
2．第一次使用前请先在漂洗液W2瓶中加入与W2相同体积无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打
钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
3．环境温度低时溶液Ⅱ中SDS 可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，
不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
4．避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
二、原理简介
本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐，低PH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐，高PH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA 从硅基质膜上洗脱。
三、试剂盒特点
1．离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了
国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2．不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速，方便，从100-200ml 大肠杆
菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.5-1.5mg 纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达85%左右。
3．获得的质粒产量高，超螺旋比例高，纯度好，直接可以用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序
等各种分子生物学实验。
四、注意事项（实验前必须首先阅读这部分！）
1．所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到至少5,000g，带50ml转头的
台式离心机。
2．溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、W1含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。
若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的用量，洗脱缓冲液应在70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。
3．得到的质粒DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大
约50μg/mlDNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA 条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
4．要知道质粒DNA 确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA 分子
量Marker 才可以知道，处
于环状或者超螺旋状态的的质粒泳动位置不确定，是无法通过电泳知道确切大小的。5．洗脱液EB 不含有螯合剂EDTA, 不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确
保PH 大于7.5, PH 过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA 如果需要长期保存，可以用TE 缓冲液洗脱（10mMTris-HCl，1mM EDTA，PH8.0），但是EDTA 可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。
6．洗脱液EB 不含有螯合剂EDTA, 不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确
保PH 大于7.5, PH 过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA 如果需要长期保存，可以用TE 缓冲液洗脱（10mMTris-HCl，1mM EDTA，PH8.0），但是EDTA 可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。
五、操作步骤
*第一次使用前请先在漂洗液W2瓶中加入与W2相同体积的无水乙醇!*将RNase A 全部加入溶液Ⅰ中，混匀，每次使用后置于2－8℃保存。*将溶液Ⅲ放在冰上预冷。
1．取100-200毫升过夜培养的菌液，6000g，离心5-10分钟，弃上清，收集菌体，尽可能的倒干上清。
处理超过50毫升菌液可以离心弃上清后，在同一个50ml 管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。
2．用5ml 溶液Ⅰ重悬菌体沉淀，移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3．加5ml 的溶液Ⅱ，温和地上下翻转4－7次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA 剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
4. 加7ml 溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转4-7次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。冰上静置10分钟，4℃，至少5000g 离心10分钟(加大离心力可相应缩短离心时间)，小心取上清，避免吸取到
漂浮白色沉淀。加入溶液Ⅲ后应该立即混匀，以免产生SDS 的局部沉淀，如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
5. 可选步骤：4℃，5000g再次离心10分钟，小心取上清。
6. 将上一步所得上清液加入吸附柱AC 中（吸附柱放入收集管中），静置2分钟，5000g 离心3分钟（为了保护膜最好慢启动），倒掉收集管中的废液。如果上清体积超过20ml,可以分多次过柱。7．加入10ml 漂洗液W1，5000g离心3分钟，弃掉废液。
8．加入12ml 漂洗液W2（请先检查是否已加入无水乙醇!），5000g离心3分钟（为了保护膜最好慢启动），弃掉废液。9．重复操作步骤8一次。
10．将吸附柱AC 放回空收集管中，最高速（最好大于8，000g）离心5-10分钟以干燥膜基质残留乙
醇，用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇，室温或者烘箱晾干几分钟。
该步骤为彻底去除吸附柱中残留乙醇，残留乙醇抑制下游反应并且严重降低洗脱效率，降低质粒产量。如果洗脱产量低，则必须加做步骤11。11．可选步骤：选择以下两种方法干燥柱子：
ａ.取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空15分钟；ｂ．将柱子放置于65℃真空干燥箱或烘箱中，放置10-15分钟。
12. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加1.5ml 洗脱缓冲液EB（洗脱
缓冲液事先在65-70℃水浴中预热），室温放置2分钟，5000g离心3分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心2分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于1ml，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。
六、疑难解答（Trouble shooting ）
出现的问题
可能的原因
培养基中忘加抗生素，非质粒转化细胞过度生长
细菌培养时间太长，老化细菌开始裂解
建议解决方法
确保固体，液体培养基中都加入了适当的抗生素。
接种适量的起始菌液于加了合适抗生素的培养基中培养12-16个小时
质粒DNA 产量低
使用了低拷贝数质粒
建议使用高拷贝数质粒，低拷贝数质粒应该适当加大处理体积。
细菌培养时间过短，菌液内细菌浓度过低
细菌细胞裂解不完全
细菌培养到[A600]吸光值为2 -4的时候收集菌体。
使用建议的菌体处理量处理菌体，不要过量；涡旋或者吹打，确保菌
体充分重悬于溶液Ⅰ中，不应该见到未散开的细菌团块；加入裂解液P2裂解后，应该是粘稠和透明的。
质粒DNA 产量使用分光光度计定量不准确洗脱效率不高
分光光度计定量常常偏高，使用琼脂糖电泳/EB染色定量
请阅读实验步骤10-12和注意事项6
漂洗液W2中忘记加无水乙醇
第一次实验时，在漂洗液W2中加入与W2相同体积无水乙醇
未提取到质粒DNA
质粒洗脱液含有较多乙醇，琼脂糖电泳/EB染色定量时质粒DNA 漂出上样孔
忘记做步骤10，乙醇抑制了酶切反应
质粒DNA 下游酶切不
让残留乙醇挥发。
能切开或者酶切不
一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑
完全
制了酶切反应
混杂有基因组DNA 污染
质粒DNA 上缺口或者电泳上超螺旋带前出现变性质粒带产物中含有RNA 污染
第一次做实验时候，忘记将RNase A 加入溶液Ⅰ，RNaseA 失活或者起始处理量过量
第一次实验前确保将RNase
A 加
裂解步骤3时间过长在裂解时基因组被剪切打断了
再离心一分钟，小心取上清使用，做步骤3时轻柔的通过颠倒混匀，不要涡旋或者剧烈震荡。裂解时间不要超过5分钟。将洗脱的质粒DNA 溶液13，000rpm 确保已经做了步骤10，将离心吸附柱的乙醇残留去除；或者适当提高上样缓冲液浓度。
做步骤10，然后空气中晾几分钟，
入了溶液Ⅰ;溶液Ⅰ超过3个月的,可加入一些新RNase A 在溶液P1；处理量不要过量；菌体重悬于溶液Ⅰ后可放置几分钟让RNase A 充分起作用后再进行下一步。
质粒大量提取试剂盒(离心柱型)
一、试剂盒组成、储存、稳定性
试剂盒组成RNase A(10mg/ml)
溶液Ⅰ溶液Ⅱ溶液Ⅲ漂洗液W1漂洗液W2洗脱缓冲液EB 吸附柱AC 收集管（50ml）
保存－20℃4℃室温室温室温室温室温室温室温
5次（SP021）
300µl30ml 30ml 40ml 55ml 65ml
10次（SP022）
600µl60ml 60ml 80ml 110ml 130ml
第一次使用前按说明加指定量乙醇
10ml 5个5个
20ml 10个10个
本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。
注意事项
1．第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A 加入溶液Ⅰ后（终浓度100μg/ml）置于4℃保存。如
果溶液Ⅰ中RNase A 失活，提取的质粒可能会有混杂有微量RNA 残留，这时可在溶液Ⅰ中补加RNase A 即可。
2．第一次使用前请先在漂洗液W2瓶中加入与W2相同体积无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打
钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
3．环境温度低时溶液Ⅱ中SDS 可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，
不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。
4．避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
二、原理简介
本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐，低PH 值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐，高PH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA 从硅基质膜上洗脱。
三、试剂盒特点
1．离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了
国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2．不需要使用有毒的苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速，方便，从100-200ml 大肠杆
菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.5-1.5mg 纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达85%左右。
3．获得的质粒产量高，超螺旋比例高，纯度好，直接可以用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序
等各种分子生物学实验。
四、注意事项（实验前必须首先阅读这部分！）
1．所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到至少5,000g，带50ml转头的
台式离心机。
2．溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、W1含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。
若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的用量，洗脱缓冲液应在70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。
3．得到的质粒DNA 可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大
约50μg/mlDNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA 条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
4．要知道质粒DNA 确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA 分子
量Marker 才可以知道，处
于环状或者超螺旋状态的的质粒泳动位置不确定，是无法通过电泳知道确切大小的。5．洗脱液EB 不含有螯合剂EDTA, 不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确
保PH 大于7.5, PH 过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA 如果需要长期保存，可以用TE 缓冲液洗脱（10mMTris-HCl，1mM EDTA，PH8.0），但是EDTA 可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。
6．洗脱液EB 不含有螯合剂EDTA, 不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确
保PH 大于7.5, PH 过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA 如果需要长期保存，可以用TE 缓冲液洗脱（10mMTris-HCl，1mM EDTA，PH8.0），但是EDTA 可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。
五、操作步骤
*第一次使用前请先在漂洗液W2瓶中加入与W2相同体积的无水乙醇!*将RNase A 全部加入溶液Ⅰ中，混匀，每次使用后置于2－8℃保存。*将溶液Ⅲ放在冰上预冷。
1．取100-200毫升过夜培养的菌液，6000g，离心5-10分钟，弃上清，收集菌体，尽可能的倒干上清。
处理超过50毫升菌液可以离心弃上清后，在同一个50ml 管内加入更多的菌液，重复步骤1，直到收集到足够的菌体。
2．用5ml 溶液Ⅰ重悬菌体沉淀，移液器吹打或者涡旋振荡至彻底悬浮。
如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3．加5ml 的溶液Ⅱ，温和地上下翻转4－7次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。
温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA 剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步，不是一定要准确的5分钟。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
4. 加7ml 溶液Ⅲ，立即温和地上下翻转4-7次，充分混匀此时会出现白色絮状沉淀。冰上静置10分钟，4℃，至少5000g 离心10分钟(加大离心力可相应缩短离心时间)，小心取上清，避免吸取到
漂浮白色沉淀。加入溶液Ⅲ后应该立即混匀，以免产生SDS 的局部沉淀，如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清。
5. 可选步骤：4℃，5000g再次离心10分钟，小心取上清。
6. 将上一步所得上清液加入吸附柱AC 中（吸附柱放入收集管中），静置2分钟，5000g 离心3分钟（为了保护膜最好慢启动），倒掉收集管中的废液。如果上清体积超过20ml,可以分多次过柱。7．加入10ml 漂洗液W1，5000g离心3分钟，弃掉废液。
8．加入12ml 漂洗液W2（请先检查是否已加入无水乙醇!），5000g离心3分钟（为了保护膜最好慢启动），弃掉废液。9．重复操作步骤8一次。
10．将吸附柱AC 放回空收集管中，最高速（最好大于8，000g）离心5-10分钟以干燥膜基质残留乙
醇，用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇，室温或者烘箱晾干几分钟。
该步骤为彻底去除吸附柱中残留乙醇，残留乙醇抑制下游反应并且严重降低洗脱效率，降低质粒产量。如果洗脱产量低，则必须加做步骤11。11．可选步骤：选择以下两种方法干燥柱子：
ａ.取下柱子放置于真空容器中，密封真空容器，提供真空15分钟；ｂ．将柱子放置于65℃真空干燥箱或烘箱中，放置10-15分钟。
12. 取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加1.5ml 洗脱缓冲液EB（洗脱
缓冲液事先在65-70℃水浴中预热），室温放置2分钟，5000g离心3分钟。如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心2分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于1ml，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。
六、疑难解答（Trouble shooting ）
出现的问题
可能的原因
培养基中忘加抗生素，非质粒转化细胞过度生长
细菌培养时间太长，老化细菌开始裂解
建议解决方法
确保固体，液体培养基中都加入了适当的抗生素。
接种适量的起始菌液于加了合适抗生素的培养基中培养12-16个小时
质粒DNA 产量低
使用了低拷贝数质粒
建议使用高拷贝数质粒，低拷贝数质粒应该适当加大处理体积。
细菌培养时间过短，菌液内细菌浓度过低
细菌细胞裂解不完全
细菌培养到[A600]吸光值为2 -4的时候收集菌体。
使用建议的菌体处理量处理菌体，不要过量；涡旋或者吹打，确保菌
体充分重悬于溶液Ⅰ中，不应该见到未散开的细菌团块；加入裂解液P2裂解后，应该是粘稠和透明的。
质粒DNA 产量使用分光光度计定量不准确洗脱效率不高
分光光度计定量常常偏高，使用琼脂糖电泳/EB染色定量
请阅读实验步骤10-12和注意事项6
漂洗液W2中忘记加无水乙醇
第一次实验时，在漂洗液W2中加入与W2相同体积无水乙醇
未提取到质粒DNA
质粒洗脱液含有较多乙醇，琼脂糖电泳/EB染色定量时质粒DNA 漂出上样孔
忘记做步骤10，乙醇抑制了酶切反应
质粒DNA 下游酶切不
让残留乙醇挥发。
能切开或者酶切不
一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑
完全
制了酶切反应
混杂有基因组DNA 污染
质粒DNA 上缺口或者电泳上超螺旋带前出现变性质粒带产物中含有RNA 污染
第一次做实验时候，忘记将RNase A 加入溶液Ⅰ，RNaseA 失活或者起始处理量过量
第一次实验前确保将RNase
A 加
裂解步骤3时间过长在裂解时基因组被剪切打断了
再离心一分钟，小心取上清使用，做步骤3时轻柔的通过颠倒混匀，不要涡旋或者剧烈震荡。裂解时间不要超过5分钟。将洗脱的质粒DNA 溶液13，000rpm 确保已经做了步骤10，将离心吸附柱的乙醇残留去除；或者适当提高上样缓冲液浓度。
做步骤10，然后空气中晾几分钟，
入了溶液Ⅰ;溶液Ⅰ超过3个月的,可加入一些新RNase A 在溶液P1；处理量不要过量；菌体重悬于溶液Ⅰ后可放置几分钟让RNase A 充分起作用后再进行下一步。