植物生理学通讯 第45卷 第1期,2009年1月67
磺胺比色法测定植物组织硝酸还原酶活性的改进
李忠光*, 龚明
云南师范大学生命科学学院, 昆明650092
“植物组织硝酸还原酶(NR)活性的测定”是植
物生理学矿质营养一章中必做的实验, 其目的是让学生掌握植物硝酸还原酶(nitrate reductase, NR, EC.1.6.6.1)活性测定的原理和技术方法, 进一步了解NR在植物氮素同化过程中的作用(白宝璋和汤学军1993; 李合生等2001; 郝建军等2007)。但是, 在实验教学中, 我们感到, 按照几种植物生理学实验指导书中介绍的方法(白宝璋和汤学军1993; 李合生等2001; 郝建军等2007)测定NR活性, 测得的NR活性很低, 有时甚至检测不出来。因此我们对此方法的显色液配方、显色时间、三氯乙酸对显色反应的影响和实验材料的取舍进行了探索, 取得了较好的实验效果。
1 显色液配方和显色时间的确定
磺胺比色法测定植物组织NR活性的原理, 是根据NR还原NO-3后所产生的NO-2在酸性条件下首先与磺胺发生重氮化反应形成重氮盐, 后者再进一步与α-萘胺发生偶联反应形成粉红色的偶氮化合物, 通过测定偶氮化合物形成的量来表示硝酸还原酶活性的大小, 因此常用到磺胺和α-萘胺2种显色剂。但是, 我们在实验中发现, 按照实验指导书
中的方法用25% HCl (V/V, 即3 mol·
L-1)分别配制磺胺和α-萘胺2种显色剂, 表现出溶解度小, 反应速度慢, 灵敏度低, 显色时间长(实验指导书中为30min)等缺点。在用磺胺比色法测定植物组织NR活性实验中, 酸度是影响重氮化反应和偶联反应的主要影响因素之一(张志良和瞿伟菁2003), 为了找出合适的显色液配方, 也就是合适的显色液酸度, 我
们除了用实验指导书中指定的配方, 即用3 mol·
L-1的HCl分别配制磺胺和α-萘胺2种显色剂外, 还用
相同浓度的H2SO4、H3PO4和HAc分别配制显色液,并在25 ℃下测试它们分别与5 µg·mL-1 NaNO2显色反应15 min和30 min的光密度A520, 得到表1的结果。从表1可以看出, 随着酸强度的增加, 2个显色时间的A520都呈现逐渐下降的趋势, 具体表现
为HAc>H-13PO4>HCl>H2SO4。此外, 以3 mol·L HAc为溶剂配制的显色液与5 µg·mL-1 NaNO2显色反应15 min, 其A520即可达到最大值, 而其余3种需显色30 min, A520才能达到最大值, 并且它们的A520始终小于HAc的, 说明用HAc配制的显色液其显色反应速度和灵敏度都明显高于分别以H2SO4、HCl和H3PO4为溶剂配制的。因此, 在植物组织NR活性
测定中, 以3 mol·
L-1 HAc为溶剂配制磺胺和α-萘胺2种显色剂, 不仅可提高显色反应的灵敏度, 而且还可以加快显色反应的速度并缩短显色反应的时
表1 几种配方的显色液对NO-2显色速度和灵敏度的影响
A520
配方
显色15 min 显色30 min
实验指导书中的配方3 mol·L-1 HCl0.228±0.0110.467±0.022改进和新增加的配方3 mol·L-1
H2SO4
0.182±0.0080.448±0.0173 mol·L-1 H3PO40.329±0.0130.561±0.025
3 mol·L-1 HAc
0.648±0.0310.654±0.030
表中数据为重复3次的平均值±标准误。
间, 显色反应时间仅为15 min, 光密度A520就可达到最大值, 达到事半功倍的效果。2 三氯乙酸对显色反应的影响
在用活体法测定植物组织NR活性时, 植物生理学实验指导书中常用终浓度为3% (184 mmol·L-1)的三氯乙酸(TCA)终止酶促反应(李合生等2001)。我们在实验中用上述2种显色液(即以3 mmol·L-1HCl或HAc为溶剂分别配制磺胺和α-萘胺)在25 ℃下分别测试了用蒸馏水或184 mmol·L-1 TCA配制的5 g·mL-1 NaNO2, 以及用TCA终止酶促反应法
(TCA终止法)测定蜀葵叶片中的NR活性(酶促反应
收稿2008-10-19
修定
2008-11-17
资助
云南师范大学综合性和设计性实验研究项目。
* E-mail: zhongguang_li@163.com; Tel: 0871-5517394
68植物生理学通讯 第45卷 第1期,2009年1月
时间到后, 立即把被测液从含有实验材料的反应体系中取出的方法称为隔离法), 显色30 min后分别测定其光密度A520, 得到表2的结果。从表中可以看出, 与以蒸馏水为溶剂配制NaNO2相比, 用TCA配制(相当于用TCA终止酶促反应)明显降低了A520; 类似地, 用TCA终止法所测出的A520也明显低于隔离法。这些结果说明TCA降低了磺胺比色法测定NO-2的灵敏度, 其原因可能是外加TCA后导致反应体系的酸度变大, 从而影响重氮化反应和偶联反应的速度(张志良和瞿伟菁2003; 表1)。这些结果表明在植物组织NR活性测定中, 用TCA终止反应是不适合的, 否则测定结果将明显偏低, 实验指导书中用TCA终止反应值得商榷。为了更准确地测定NR活性, 酶促反应结束后, 立即将所测液从含有实验材料的反应体系中取出(隔离法), 从而使底物和NR分离, 仍可达到终止酶促反应的目的。
表2 TCA对磺胺比色法测定NR活性显色反应的影响
A520
测定内容和方法
3 mol·L-1
HCl 3 mol·L-1
HAc5 µg·mL-1
NaNO2水溶液0.467±0.0220.654±0.0305 µg·mL-1 NaNO2 TCA溶液0.354±0.0160.512±0.024隔离法0.538±0.0200.752±0.026TCA终止法
0.406±0.018
0.588±0.021
表中数据为重复3次的平均值±标准误。
3 实验材料的取舍
由于不同实验材料中NR活性差别较大, 有的实验材料甚至检测不出NR活性, 因此在植物组织NR活性测定中, 选择合适的实验材料成为实验成功与否的关键。为了筛选出适合于NR活性测定的实验材料, 我们结合实验教学实际, 除了用上述3 mol·L-1 HAc分别配制磺胺和α-萘胺2种显色剂,测定实验指导书中介绍的水培2周的水稻(Oryzasativa L.)、小麦(Triticum aestivum L.)、玉米(Zeamays L.)、豌豆(Pisum sativum L.)和烟草(Nicotianatabacum L.)等几种植物叶片中的NR活性以外, 还以校园植物如法国梧桐(Platanus orientalis L.)、天
竺葵(Pelargonium hortorum Bailey)、向日葵(Helianthus annuus L.)、蓖麻(Ricinus communisL.)和蜀葵(Althaea rosea Linn.)等植物叶片为实验材料进行了NR活性的测定, 得到表3的结果。从表3可以看出, 实验指导书中介绍的几种实验材料的NR活性在4.5 ̄32.6 µg·g-1 (FW)·h-1之间, 平均值为14.78 µg·g-1 (FW)·h-1, 而新测定的几种植物实验材料的NR活性在44 ̄206.6 µg·g-1 (FW)·h-1之间,平均值为125 µg·g-1 (FW)·h-1, NR活性大约是前者的8.5倍, 表现出很高的NR活性。
表3 几种实验材料中的NR活性比较
实验材料 酶活性/µg·g-1 (FW)·h-1实验指导书中的实验材料
水稻
14.5±0.3小麦 26.1±1.0玉米 52.5±1.5豌豆 39.2±1.2烟草
105.6±4.3改进和新增加的实验材料
法国梧桐145.2±5.5天竺葵264.3±7.5向日葵390.6±11.5蓖麻570.4±12.1蜀葵
688.5±15.2
表中植物叶片的取材时间为下午2点, 数据为重复3次的平均值±标准误。
综上所述, 在植物组织NR活性测定中, 我们
建议广大同行在选用合适的实验材料, 如向日葵、蓖麻和蜀葵等植物叶片, 尤其以蜀葵叶片为最佳的基础上, 以3 mol·L-1 HAc为溶剂分别配制磺胺和α-萘胺两种显色剂, 不仅可以提高显色反应的灵敏度, 而且还可以加快显色反应的速度并缩短显色反应的时间, 达到事半功倍的效果, 对于实验指导书中用TCA终止NR酶促反应的方法值得商榷。
参考文献
白宝璋, 汤学军(1993). 植物生理学测试技术. 北京: 科学技术出
版社, 24 ̄25
郝建军, 康宗利, 于洋(2007). 植物生理学实验技术. 北京: 化学
工业出版社, 62 ̄64
李合生, 赵世杰, 张文华(2001). 植物生理生化实验原理和技术.
北京: 高等教育出版社, 125 ̄128
张志良, 瞿伟菁(2003). 植物生理学实验指导(第3版). 北京: 高
等教育出版社, 42
植物生理学通讯 第45卷 第1期,2009年1月67
磺胺比色法测定植物组织硝酸还原酶活性的改进
李忠光*, 龚明
云南师范大学生命科学学院, 昆明650092
“植物组织硝酸还原酶(NR)活性的测定”是植
物生理学矿质营养一章中必做的实验, 其目的是让学生掌握植物硝酸还原酶(nitrate reductase, NR, EC.1.6.6.1)活性测定的原理和技术方法, 进一步了解NR在植物氮素同化过程中的作用(白宝璋和汤学军1993; 李合生等2001; 郝建军等2007)。但是, 在实验教学中, 我们感到, 按照几种植物生理学实验指导书中介绍的方法(白宝璋和汤学军1993; 李合生等2001; 郝建军等2007)测定NR活性, 测得的NR活性很低, 有时甚至检测不出来。因此我们对此方法的显色液配方、显色时间、三氯乙酸对显色反应的影响和实验材料的取舍进行了探索, 取得了较好的实验效果。
1 显色液配方和显色时间的确定
磺胺比色法测定植物组织NR活性的原理, 是根据NR还原NO-3后所产生的NO-2在酸性条件下首先与磺胺发生重氮化反应形成重氮盐, 后者再进一步与α-萘胺发生偶联反应形成粉红色的偶氮化合物, 通过测定偶氮化合物形成的量来表示硝酸还原酶活性的大小, 因此常用到磺胺和α-萘胺2种显色剂。但是, 我们在实验中发现, 按照实验指导书
中的方法用25% HCl (V/V, 即3 mol·
L-1)分别配制磺胺和α-萘胺2种显色剂, 表现出溶解度小, 反应速度慢, 灵敏度低, 显色时间长(实验指导书中为30min)等缺点。在用磺胺比色法测定植物组织NR活性实验中, 酸度是影响重氮化反应和偶联反应的主要影响因素之一(张志良和瞿伟菁2003), 为了找出合适的显色液配方, 也就是合适的显色液酸度, 我
们除了用实验指导书中指定的配方, 即用3 mol·
L-1的HCl分别配制磺胺和α-萘胺2种显色剂外, 还用
相同浓度的H2SO4、H3PO4和HAc分别配制显色液,并在25 ℃下测试它们分别与5 µg·mL-1 NaNO2显色反应15 min和30 min的光密度A520, 得到表1的结果。从表1可以看出, 随着酸强度的增加, 2个显色时间的A520都呈现逐渐下降的趋势, 具体表现
为HAc>H-13PO4>HCl>H2SO4。此外, 以3 mol·L HAc为溶剂配制的显色液与5 µg·mL-1 NaNO2显色反应15 min, 其A520即可达到最大值, 而其余3种需显色30 min, A520才能达到最大值, 并且它们的A520始终小于HAc的, 说明用HAc配制的显色液其显色反应速度和灵敏度都明显高于分别以H2SO4、HCl和H3PO4为溶剂配制的。因此, 在植物组织NR活性
测定中, 以3 mol·
L-1 HAc为溶剂配制磺胺和α-萘胺2种显色剂, 不仅可提高显色反应的灵敏度, 而且还可以加快显色反应的速度并缩短显色反应的时
表1 几种配方的显色液对NO-2显色速度和灵敏度的影响
A520
配方
显色15 min 显色30 min
实验指导书中的配方3 mol·L-1 HCl0.228±0.0110.467±0.022改进和新增加的配方3 mol·L-1
H2SO4
0.182±0.0080.448±0.0173 mol·L-1 H3PO40.329±0.0130.561±0.025
3 mol·L-1 HAc
0.648±0.0310.654±0.030
表中数据为重复3次的平均值±标准误。
间, 显色反应时间仅为15 min, 光密度A520就可达到最大值, 达到事半功倍的效果。2 三氯乙酸对显色反应的影响
在用活体法测定植物组织NR活性时, 植物生理学实验指导书中常用终浓度为3% (184 mmol·L-1)的三氯乙酸(TCA)终止酶促反应(李合生等2001)。我们在实验中用上述2种显色液(即以3 mmol·L-1HCl或HAc为溶剂分别配制磺胺和α-萘胺)在25 ℃下分别测试了用蒸馏水或184 mmol·L-1 TCA配制的5 g·mL-1 NaNO2, 以及用TCA终止酶促反应法
(TCA终止法)测定蜀葵叶片中的NR活性(酶促反应
收稿2008-10-19
修定
2008-11-17
资助
云南师范大学综合性和设计性实验研究项目。
* E-mail: zhongguang_li@163.com; Tel: 0871-5517394
68植物生理学通讯 第45卷 第1期,2009年1月
时间到后, 立即把被测液从含有实验材料的反应体系中取出的方法称为隔离法), 显色30 min后分别测定其光密度A520, 得到表2的结果。从表中可以看出, 与以蒸馏水为溶剂配制NaNO2相比, 用TCA配制(相当于用TCA终止酶促反应)明显降低了A520; 类似地, 用TCA终止法所测出的A520也明显低于隔离法。这些结果说明TCA降低了磺胺比色法测定NO-2的灵敏度, 其原因可能是外加TCA后导致反应体系的酸度变大, 从而影响重氮化反应和偶联反应的速度(张志良和瞿伟菁2003; 表1)。这些结果表明在植物组织NR活性测定中, 用TCA终止反应是不适合的, 否则测定结果将明显偏低, 实验指导书中用TCA终止反应值得商榷。为了更准确地测定NR活性, 酶促反应结束后, 立即将所测液从含有实验材料的反应体系中取出(隔离法), 从而使底物和NR分离, 仍可达到终止酶促反应的目的。
表2 TCA对磺胺比色法测定NR活性显色反应的影响
A520
测定内容和方法
3 mol·L-1
HCl 3 mol·L-1
HAc5 µg·mL-1
NaNO2水溶液0.467±0.0220.654±0.0305 µg·mL-1 NaNO2 TCA溶液0.354±0.0160.512±0.024隔离法0.538±0.0200.752±0.026TCA终止法
0.406±0.018
0.588±0.021
表中数据为重复3次的平均值±标准误。
3 实验材料的取舍
由于不同实验材料中NR活性差别较大, 有的实验材料甚至检测不出NR活性, 因此在植物组织NR活性测定中, 选择合适的实验材料成为实验成功与否的关键。为了筛选出适合于NR活性测定的实验材料, 我们结合实验教学实际, 除了用上述3 mol·L-1 HAc分别配制磺胺和α-萘胺2种显色剂,测定实验指导书中介绍的水培2周的水稻(Oryzasativa L.)、小麦(Triticum aestivum L.)、玉米(Zeamays L.)、豌豆(Pisum sativum L.)和烟草(Nicotianatabacum L.)等几种植物叶片中的NR活性以外, 还以校园植物如法国梧桐(Platanus orientalis L.)、天
竺葵(Pelargonium hortorum Bailey)、向日葵(Helianthus annuus L.)、蓖麻(Ricinus communisL.)和蜀葵(Althaea rosea Linn.)等植物叶片为实验材料进行了NR活性的测定, 得到表3的结果。从表3可以看出, 实验指导书中介绍的几种实验材料的NR活性在4.5 ̄32.6 µg·g-1 (FW)·h-1之间, 平均值为14.78 µg·g-1 (FW)·h-1, 而新测定的几种植物实验材料的NR活性在44 ̄206.6 µg·g-1 (FW)·h-1之间,平均值为125 µg·g-1 (FW)·h-1, NR活性大约是前者的8.5倍, 表现出很高的NR活性。
表3 几种实验材料中的NR活性比较
实验材料 酶活性/µg·g-1 (FW)·h-1实验指导书中的实验材料
水稻
14.5±0.3小麦 26.1±1.0玉米 52.5±1.5豌豆 39.2±1.2烟草
105.6±4.3改进和新增加的实验材料
法国梧桐145.2±5.5天竺葵264.3±7.5向日葵390.6±11.5蓖麻570.4±12.1蜀葵
688.5±15.2
表中植物叶片的取材时间为下午2点, 数据为重复3次的平均值±标准误。
综上所述, 在植物组织NR活性测定中, 我们
建议广大同行在选用合适的实验材料, 如向日葵、蓖麻和蜀葵等植物叶片, 尤其以蜀葵叶片为最佳的基础上, 以3 mol·L-1 HAc为溶剂分别配制磺胺和α-萘胺两种显色剂, 不仅可以提高显色反应的灵敏度, 而且还可以加快显色反应的速度并缩短显色反应的时间, 达到事半功倍的效果, 对于实验指导书中用TCA终止NR酶促反应的方法值得商榷。
参考文献
白宝璋, 汤学军(1993). 植物生理学测试技术. 北京: 科学技术出
版社, 24 ̄25
郝建军, 康宗利, 于洋(2007). 植物生理学实验技术. 北京: 化学
工业出版社, 62 ̄64
李合生, 赵世杰, 张文华(2001). 植物生理生化实验原理和技术.
北京: 高等教育出版社, 125 ̄128
张志良, 瞿伟菁(2003). 植物生理学实验指导(第3版). 北京: 高
等教育出版社, 42