真菌溶菌酶及其在食品工业中的应用

刘小杰

1, 2

　何国庆

(1. 杭州娃哈哈集团有限公司科委, 杭州　310018;

2. 浙江大学食品科学与营养系, 杭州　310029)

　　摘　要:真菌溶菌酶主要包括两大类:几丁质酶和β-葡聚糖酶。真菌溶菌酶作为天然防腐剂, 在食品工业中具有广泛的用途。本文综述了国内外近年来在这一领域的研究进展, 指出当前存在的问题, 并对应用真菌溶菌酶提出了一些设想。

关键词:溶菌酶; 几丁质酶; β-葡聚糖酶; 食品工业

Funga l l ysozy m e and its X i a 1, 2q i n g

(of W ahaha Gr oup Company L i m ited, Hangzhou 　310018; m Science and Nutriti on, Zhejiang University, Hangzhou 　310029)

Abstract:Fungal lys ozy me include chitinases and β-glucanases . A s natural f ood antisep tic agents, fungal lys ozy mes are app lied in f ood industry widely .

This article revie ws advance ment of research on fungal lys ozy me in and abr oad,

points out p r oble m of app licati on of fungal lys ozy me . This paper als o puts f or ward app licati on ideas of fungal lys ozy me . Key words:lys ozy me; chitinases; β-glucanases; food industry

溶菌酶(lys ozy me; EC31211117) 是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶, 又称细胞壁溶解酶。人们对溶菌酶的研究始于20世纪初, 英国细菌学家弗莱明发现人的唾液、眼泪中存在着溶解细菌细胞壁的酶, 并将其命名为溶菌酶。此后, 人们在动物、植物和微生物中都发现了溶菌酶的存在。随着研究的不断深入, 发现溶菌酶不仅对细菌细胞壁有作用, 还可作用于真菌细胞壁。根据来源不同, 溶菌酶可以分为以下三类:(1) 动物溶菌酶

鸡蛋白中约含有315%的溶菌酶, 可分解革兰氏阳性菌, 对革兰氏阴性菌不起作用, 其分子量为14000。此外, 从其它鸟类蛋白、哺乳动物乳汁及体液中也分离到了溶菌酶。

(2) 植物溶菌酶

Audy 等曾对116科410种植物进行普查, 发

现168种植物中含有溶菌酶

[1]

。其中木瓜、无花

果、大麦等植物中均可分离出溶菌酶, 其分子量较大, 约为

2400029000, 其对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋白溶菌酶的1/3。

(3) 微生物溶菌酶

人们从20世纪60年代发现微生物也产生溶菌酶, 按其作用对象可分为两大类, 即细菌溶菌酶和真菌溶菌酶。本文主要讨论真菌溶菌酶的种类、特性及其在食品工业中的应用。

1　真菌溶菌酶

111　几丁质酶

几丁质酶(EC31211114) 能够催化几丁质水解为几丁寡糖和N -乙酰氨基葡萄糖, 主要分为外几丁质酶和内几丁质酶。产生几丁质酶的真菌主要有:溜曲霉(A sperg illus tam arii )

、球孢白僵

　312

菌(B eauveria bussiana ) 、米曲霉(A sperg illus oryzae ) 和木霉(Trichoder m a harzianum ) 等。微

[2]

生物几丁质酶具有如下特点:

(1) 多样性不同微生物所产生的几丁质酶的类别、性质不尽相同。

(2) 诱导性

多数微生物在含有几丁质等诱导物的培养基中才能产生几丁质酶。

(3) 分泌性在诱导物存在的条件下, 微生物产生并向胞外分泌几丁质酶。虽然一些外几丁质酶也表现出抗真菌的特性, 但抗真菌的几丁质酶主要是内几

[34]

丁质酶。人们已经研究了许多来自于植物和微生物的几丁质酶, 并对有些几丁质酶抑制真菌

[3, 5]

生长/裂解真菌细胞的作用进行了研究用, 原体。、杆菌, 但在大多数产几丁质酶的真菌中, 此酶主要用于真菌细胞壁的成型过程。只有在一些特定的寄生霉菌中, 如哈茨木霉(T richoder m a ha rzianum ) 、白扁丝霉(A phano 2cladium album ) 和绿黏帚霉(Gliocladium virens ) 中, 胞外几丁质酶和β-葡聚糖酶用来附着和降解目的菌丝。这些抗真菌的几丁质酶与植物几丁质酶相似, 多为内几丁质酶。由于肽聚糖和甲壳质的糖骨架具有相似的结构, 因此, 一些几丁质酶也具有溶菌酶活性。

β-葡聚糖酶112　

β-葡聚糖酶(EC31211139) 主要包括内β-1, 3葡聚糖酶、内β-1, 4葡聚糖酶、外β-1, 3葡聚糖酶和外β-1, 4葡聚糖酶。该酶对水解大麦、黑麦中的β-葡聚糖有重要的作用, 主要用于饲料工业和酿酒工业。目前, 生产β-葡聚糖酶的微生物主要有芽孢杆菌、瘤胃微生物和

[9]

少数真菌。β-葡聚糖酶具有抗真菌作用主要是因为它能水解β(1→3) 糖苷键。研究表明:β(1→3) 葡聚糖酶对几丁质酶降解真菌细胞壁具有显著的协同作用。如将纯化的几丁质酶和β-葡聚糖酶合用, 抗灰色葡萄孢(Botrytis cinera )

[8]

[4, 6

的作用提高了10倍。内葡聚糖酶与外葡聚糖酶、不同内葡聚糖酶间也具有协同抗真菌作[10]

用。因为许多植物性食品中含有β-葡聚糖成分, 它对维持产品的组织性、黏度和外观都有重要作用, 将β-葡聚糖酶加入这类食品, 可能会引起不良影响。真菌的细胞壁主要组分为几丁质和β-葡聚糖, 但一些真菌和大多数酵母细胞壁含有其它类型的多糖(甘露聚糖、α-葡聚糖和纤维素) , 因此, 甘露聚糖酶、α-葡聚糖酶也可作为抗真菌的酶类应用于食品工业。

[5]

2　[1117]

, , 能, , , 它可以广泛地应用于乳制、肉制品、酿酒和饮料等食品工业中。211　溶菌酶在乳制品中的应用

人乳中含有大量的溶菌酶, 而牛乳中则很少, 将溶菌酶添加到牛乳及其制品中, 可使牛乳人乳化; 研究还表明, 溶菌酶是双歧杆菌增殖因子, 有防止肠炎和变态反应的作用, 对婴、幼儿的肠道菌群有平衡作用; 在干酪生产中添加溶菌酶, 可以代替硝酸盐等抑制丁酸菌的污染, 防止干酪产气, 并对干酪的感官质量有明显改善作用。212　溶菌酶在海产品、水产品和肉类制品中的应用

研究表明溶菌酶、氯化钠和亚硝酸盐联合应用到肉制品中, 可以延长肉制品的保质期, 其防腐效果比单独使用时效果更好。对于一些新鲜的海产品和水产品, 经溶菌酶处理后均可延长储存期。此外, 徐国武等研究了β-葡聚糖酶对鲤鱼生长性能及饲料消化率的影响, 发现能提高鲤鱼的增重率和降低饵料系数, 提高饵料粗蛋白、粗

[17]

脂肪、干物质的消化率。213　溶菌酶在酒类和饮料中的应用

在低度酒中添加20mg/kg 的溶菌酶, 不仅对酒的风味无任何不良影响, 还可防止产酸菌的生长, 同时受酒类澄清剂的影响很小, 是低度酒类较好的防腐剂,

如日本就把溶菌酶用于清酒的防

　313

腐。将β-葡聚糖酶应用于啤酒生产中, 可解决因大麦中难降解、黏度大的β-葡聚糖引起的麦

[18]

汁和啤酒过滤速度慢的问题。溶菌酶在葡萄酒生产中应用的研究始于20世纪90年代后期, 最初只是利用其对革兰氏阳性菌的溶解作用, 但随着研究发现, 它可以作为S O 2的优良替代物或补充。国外有专利报道, 利用葡聚糖酶和蛋白酶作为稳定剂, 可以稳定葡萄酒中的蛋白质。茶饮料是低酸性饮料, pH 值一般在

57之间, 引起茶饮料变质的微生物主要是细菌, 为了保证茶饮料的安全性, 必须对其进行杀菌处理, 而一般的杀菌工艺对其感官品质影响很大, 溶菌酶作用一种防腐手段, 可以应用于茶饮料的生产中。此外, 溶菌酶还可用于pH61

0715的饮料和果汁的防腐。214　溶菌酶在食品配料生产中的应用目前, 理脱去乙酰基而完成的, 的研究, , 轻污染, , 程, 。

在制糖工业中, 由于肠膜明串珠菌污染的蔗汁产生高黏性的葡聚糖, 造成糖分损失, 并导致堵塞管道, 同时给浓缩、结晶等操作带来诸多困难, 添加β-葡聚糖酶可以部分解决这些问题。215　溶菌酶在其它食品中的应用

奶油蛋糕是容易腐败变质的食品之一, 在糕点中加入溶菌酶, 可防止微生物的繁殖, 起到防腐作用。曲海泳等研究了木霉菌的筛选和对草莓灰霉病菌的作用机制, 提示其分泌的几丁质酶可

[19]

以用于草莓生产。章银良研究了溶菌酶对草莓的保鲜作用, 发现将溶菌酶与甘氨酸联用, 保鲜

[20]

效果更佳。由于处于酵母细胞壁中的蛋白质利用率很低, 所以利用溶菌酶破坏酵母细胞壁, 可制成微生物蛋白质, 提高酵母蛋白质的利用率。用含放线菌体的溶菌酶处理酵母液可生产出含有5’-肌苷酸、5’-鸟苷酸及其它呈味物质。将溶菌酶固定化在食品包装材料上, 生产出有抗菌功效的食品包装材料, 以达到抗菌保鲜功能。

防腐剂, 但在实际应用中还存在如下几个问题:(1) 溶菌酶的投入/效率低, 这就限制了它们的广泛使用; (2) 溶菌酶具有特异性, 只能抑制某些细菌, 降解真菌细胞壁的酶类还没有用作食品防腐剂。

将溶菌酶联用, 如把不同的溶菌酶混合, 或者将抗微生物酶与其它保藏手段结合使用, 可能会扩展它们的使用范围, 但这方面的研究报道还不多。在微生物中异质表达溶菌酶为今后获得新的酶类, 并将其纯化, 及大量用于食品工业提供了可能。

参考文献

[1]P, D L, al . for m s of

in vari ous p . Phyt oche m isty, 1990, :

1143

45.

[2], , 蒋千里等. 几丁质酶的研究概况. 山东科

学, 2000, 13(4) :

[3]Sahai A S, Mannocha M S . Chitinases of fungi and p lants:their

involvement in mor phogenesis and host -parasite interacti on . FE MS M icr obi ol Rev, 1993, (11) :

317

338.

Endochitinase Phyt opathol o 2

[4]D i Pietr o A, Lorit o M , Ha man, G E, et al .

tic antifungal activity in combinati on with gli ot oxin . gy, 1993, (83) :

302Pathogen contr ol strategies . 392

394.

307.

Trends B i otechnol, 1992,

(10) :

fr om Gli ocladium virens:is olati on, characterizati on and synergis 2

[5]Oppenhei m A B, Chet I . Cl oned chitinases in fungal Plant -

[6]B laiseau P, Laffay J. Pri m ary structure of a chitinase -encoding

gene (chi1) fr om the fila ment ous fungus Aphanocladium album:si m ilarity t o bacterial chitinases . 248.

[7]D i Pietr o A, Lorit o M , Hayes C K, et al .

Endochitinase fr om

Mol Plant

Gli ocladium virens:is olati on, characterizati on, and synergistic antifungal activity in combinati on with gli ot oxin . Pathol, 1993, (83) :

308

313.

Plant and bacterial chitinases

[8]Roberts W K, Selitrennikoff C P .

169

176.

50. Enzy me

Gene, 1992, 120(2) :

243

differ in antifungal activity . M icr obi ol ogy, 1988, 134(11) :

[9]郑毅, 陈接锋, 马石金等. 黑曲霉FS25产β-葡聚糖酶发

酵特性的研究. 微生物学通报, 2001, 28(4)

gal beta -glucanases:their physi ol ogy and regulati on . M icr ob Technol, 1993, (15) :

178(10) :

10.

192.

[10]Pits on SM, Sevi our R J, Mc Dougall B M. Noncellul olytic fun 2

[11]朱奇, 陈彦. 溶菌酶及其应用. 生物学通报, 1998, 33

3　存在的问题及展望

虽然溶菌酶作为天然防腐剂, 可以替代传统

(下转第289页

)

　314

213　对三种脱蛋白方法的讨论

脱蛋白效果, 三氯乙酸法次之, 盐酸法最差。

参考文献

[1]房玉玲, 秦明珠. 乌饭树的研究进展[J ].上海中医药杂

本实验中脱蛋白可以达到5617%, 通过后续的实验可知, 此含量的蛋白已经对乌饭树叶中黑

[2]

色素和多糖的测定没有影响。

在我们的研究中Sevag 法脱蛋白效果较好, 但是其仍存在进一步改进的空间, 因为Sevag 法作为一种较难控制的方法, 可能存在振荡剧烈程度不够以及振荡时间不充分等问题, 同时由于有机相和水相互不相溶, 可能会由于混合不均匀而出现分层的现象。Sevag 法在脱去蛋白的同时使提取液中的糖类、黑色素有较大的损失, Sevag 法脱蛋白的次数越多, 脱蛋白率必然越大, 这就需要我们在实验先测定糖类、黑色素的原始含量, 否责就会出现乌饭树叶中黑色素和多糖的含量报道差异很多的情况, 因为目前文献报道脱蛋白方法基本采用Sevag 法。

, 想, , 、结果稳定的优点。此外三氯乙酸法比较温和, 它能在除蛋白的过程中能很好的保证多糖类的活性, 总之, 在选择某一具体的脱蛋白方法时应考虑所需产物的具体要求, 来进行实验方法的取舍, 这样才能达到预期的实验目的和结果。

志, 2003, 37(5) :

5961.

49.

[2]姜萍, 程从球, 胡志杰. 乌饭树也色素提取工艺及色素特性

的研究[J ].中国野生植物资源, 1999, 18(3) :

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[3]周兆祥, 郭维华. 乌饭树色素的研究[J ].食品与发酵工[4]龚盛昭, 黄小凤, 李中林. 天然乌饭树果色素的提取和理化

性质研究[J ].广州食品工业科技. 2003, 13(3) :

33.

[5]汪显阳, 姚春艳, 张佩文. 六味地黄丸中多糖含量测定研究

[J ].中医药研究, 2000, 16(4) :

[6]李淑惠, , [J ]., 111) :14.

[7]孙莲, . [J ]., 2000, (4) :

297

298.

[8, , 胡宝坤等. 几种测定灰树花多糖中蛋白质含

[J ].中国食用菌, 2003, 22(1) :

30.

[9]丰朝霞, 张鸿. 分光光度法测定茯苓中多糖总糖含量[J ].

时珍国医国药, 2000, 11(2) :

109110.

57.

[10]李瑞, 赵浩如, 陈乃林. 白花蛇舌草多糖除蛋白的方法研

究[J ].江苏中医药, 2003, 24(10) :

[11]郭敏亮, 姜永明. 考马斯亮蓝显色液组分对蛋白质测定的

影响[J ].生物化学与生物物理进展, 1996, 23(6) :

558

561.

[12]徐杰伟, 温少磊, 蔡早育. 考马斯亮蓝法测定微量蛋白的

条件讨论[J ].江西医学检验, 2003, 21(5) :

353

354.

[13]王多宁, 赵雁武, 田芙蓉. 考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋

3　结论

经过本实验比较, 盐酸法、三氯乙酸法和Sevag 法这三种脱蛋白方法, Sevag 法具有较好的(上接第314页)

[12]刘仲敏, 何伯安. 溶菌酶及其在食品工业中的应用. 食品

白质含量[J ].第四军医大学学报, 2001, 22(6) :

528

529.

[17]徐国武, 许民强. β-葡聚糖酶对鲤鱼生长性能及饲料消

化率的影响. 饲料工业, 2000, 21(3) :

2324.

与发酵工业, 1995, (5) :

(3) :

22.

82.

[18]郑毅, 陈接锋, 吴松刚. 黑曲霉(A spergillus niger ) 产β-

[13]李冬梅. 溶菌酶及在食品中的应用. 食品工业, 1999, [14]刘宗柱, 楚慧民, 宋宪君等. 溶菌酶的应用前景和提取工

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10.

[19]屈海泳, 罗曼, 蒋立科等. T90-1木霉菌的筛选和对草莓

艺. 农牧产品开发, 1996, (4) :

16(12) :

31.

灰霉病菌作用机制的研究. 微生物学报, 2004, 44(2) :

244

247.

33.

[20]章银良. 溶菌酶对草莓的保鲜效果. 食品工业科技, 1999,

20(1) :

[15]谢宪章. 天然防腐剂溶菌酶有待开发. 食品科学, 1995, [16]刘小杰, 蒋雪红, 秦翠群. 抗微生物酶在食品工业中的应

用. 食品工业科技, 2002, 23(3) :

8082.

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真菌溶菌酶及其在食品工业中的应用

刘小杰

1, 2

　何国庆

(1. 杭州娃哈哈集团有限公司科委, 杭州　310018;

2. 浙江大学食品科学与营养系, 杭州　310029)

关键词:溶菌酶; 几丁质酶; β-葡聚糖酶; 食品工业

Funga l l ysozy m e and its X i a 1, 2q i n g

(of W ahaha Gr oup Company L i m ited, Hangzhou 　310018; m Science and Nutriti on, Zhejiang University, Hangzhou 　310029)

Abstract:Fungal lys ozy me include chitinases and β-glucanases . A s natural f ood antisep tic agents, fungal lys ozy mes are app lied in f ood industry widely .

This article revie ws advance ment of research on fungal lys ozy me in and abr oad,

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(2) 植物溶菌酶

Audy 等曾对116科410种植物进行普查, 发

现168种植物中含有溶菌酶

[1]

。其中木瓜、无花

果、大麦等植物中均可分离出溶菌酶, 其分子量较大, 约为

2400029000, 其对溶壁小球菌的溶菌活性不超过鸡蛋白溶菌酶的1/3。

(3) 微生物溶菌酶

1　真菌溶菌酶

111　几丁质酶

、球孢白僵

　312

菌(B eauveria bussiana ) 、米曲霉(A sperg illus oryzae ) 和木霉(Trichoder m a harzianum ) 等。微

[2]

生物几丁质酶具有如下特点:

(1) 多样性不同微生物所产生的几丁质酶的类别、性质不尽相同。

(2) 诱导性

多数微生物在含有几丁质等诱导物的培养基中才能产生几丁质酶。

(3) 分泌性在诱导物存在的条件下, 微生物产生并向胞外分泌几丁质酶。虽然一些外几丁质酶也表现出抗真菌的特性, 但抗真菌的几丁质酶主要是内几

[34]

丁质酶。人们已经研究了许多来自于植物和微生物的几丁质酶, 并对有些几丁质酶抑制真菌

[3, 5]

β-葡聚糖酶112　

[9]

[8]

[4, 6

的作用提高了10倍。内葡聚糖酶与外葡聚糖酶、不同内葡聚糖酶间也具有协同抗真菌作[10]

[5]

2　[1117]

, , 能, , , 它可以广泛地应用于乳制、肉制品、酿酒和饮料等食品工业中。211　溶菌酶在乳制品中的应用

[17]

脂肪、干物质的消化率。213　溶菌酶在酒类和饮料中的应用

在低度酒中添加20mg/kg 的溶菌酶, 不仅对酒的风味无任何不良影响, 还可防止产酸菌的生长, 同时受酒类澄清剂的影响很小, 是低度酒类较好的防腐剂,

如日本就把溶菌酶用于清酒的防

　313

腐。将β-葡聚糖酶应用于啤酒生产中, 可解决因大麦中难降解、黏度大的β-葡聚糖引起的麦

[18]

0715的饮料和果汁的防腐。214　溶菌酶在食品配料生产中的应用目前, 理脱去乙酰基而完成的, 的研究, , 轻污染, , 程, 。

[19]

以用于草莓生产。章银良研究了溶菌酶对草莓的保鲜作用, 发现将溶菌酶与甘氨酸联用, 保鲜

[20]

参考文献

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[2], , 蒋千里等. 几丁质酶的研究概况. 山东科

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[3]Sahai A S, Mannocha M S . Chitinases of fungi and p lants:their

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317

338.

Endochitinase Phyt opathol o 2

[4]D i Pietr o A, Lorit o M , Ha man, G E, et al .

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302Pathogen contr ol strategies . 392

394.

307.

Trends B i otechnol, 1992,

(10) :

fr om Gli ocladium virens:is olati on, characterizati on and synergis 2

[5]Oppenhei m A B, Chet I . Cl oned chitinases in fungal Plant -

[6]B laiseau P, Laffay J. Pri m ary structure of a chitinase -encoding

gene (chi1) fr om the fila ment ous fungus Aphanocladium album:si m ilarity t o bacterial chitinases . 248.

[7]D i Pietr o A, Lorit o M , Hayes C K, et al .

Endochitinase fr om

Mol Plant

Gli ocladium virens:is olati on, characterizati on, and synergistic antifungal activity in combinati on with gli ot oxin . Pathol, 1993, (83) :

308

313.

Plant and bacterial chitinases

[8]Roberts W K, Selitrennikoff C P .

169

176.

50. Enzy me

Gene, 1992, 120(2) :

243

differ in antifungal activity . M icr obi ol ogy, 1988, 134(11) :

[9]郑毅, 陈接锋, 马石金等. 黑曲霉FS25产β-葡聚糖酶发

酵特性的研究. 微生物学通报, 2001, 28(4)

gal beta -glucanases:their physi ol ogy and regulati on . M icr ob Technol, 1993, (15) :

178(10) :

10.

192.

[10]Pits on SM, Sevi our R J, Mc Dougall B M. Noncellul olytic fun 2

[11]朱奇, 陈彦. 溶菌酶及其应用. 生物学通报, 1998, 33

3　存在的问题及展望

虽然溶菌酶作为天然防腐剂, 可以替代传统

(下转第289页

)

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213　对三种脱蛋白方法的讨论

脱蛋白效果, 三氯乙酸法次之, 盐酸法最差。

参考文献

[1]房玉玲, 秦明珠. 乌饭树的研究进展[J ].上海中医药杂

本实验中脱蛋白可以达到5617%, 通过后续的实验可知, 此含量的蛋白已经对乌饭树叶中黑

[2]

色素和多糖的测定没有影响。

志, 2003, 37(5) :

5961.

49.

[2]姜萍, 程从球, 胡志杰. 乌饭树也色素提取工艺及色素特性

的研究[J ].中国野生植物资源, 1999, 18(3) :

47业, 1989.

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[6]李淑惠, , [J ]., 111) :14.

[7]孙莲, . [J ]., 2000, (4) :

297

298.

[8, , 胡宝坤等. 几种测定灰树花多糖中蛋白质含

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30.

[9]丰朝霞, 张鸿. 分光光度法测定茯苓中多糖总糖含量[J ].

时珍国医国药, 2000, 11(2) :

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57.

[10]李瑞, 赵浩如, 陈乃林. 白花蛇舌草多糖除蛋白的方法研

究[J ].江苏中医药, 2003, 24(10) :

[11]郭敏亮, 姜永明. 考马斯亮蓝显色液组分对蛋白质测定的

影响[J ].生物化学与生物物理进展, 1996, 23(6) :

558

561.

[12]徐杰伟, 温少磊, 蔡早育. 考马斯亮蓝法测定微量蛋白的

条件讨论[J ].江西医学检验, 2003, 21(5) :

353

354.

[13]王多宁, 赵雁武, 田芙蓉. 考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋

3　结论

经过本实验比较, 盐酸法、三氯乙酸法和Sevag 法这三种脱蛋白方法, Sevag 法具有较好的(上接第314页)

[12]刘仲敏, 何伯安. 溶菌酶及其在食品工业中的应用. 食品

白质含量[J ].第四军医大学学报, 2001, 22(6) :

528

529.

[17]徐国武, 许民强. β-葡聚糖酶对鲤鱼生长性能及饲料消

化率的影响. 饲料工业, 2000, 21(3) :

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与发酵工业, 1995, (5) :

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22.

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真菌溶菌酶及其在食品工业中的应用

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