文章编号：1674－5566（2012）05－0756－07
应用dsRNA 测序技术检测草鱼呼肠孤病毒的混合感染
王
土，许
丹，吕利群
（上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海201306）
摘要：从草鱼（Ctenopharyngodon idellus ）出血病疑似病料研究亮点：草鱼呼肠孤病毒是危害草鱼养殖最为严重的病原之一，由于其基因组dsRNA 组成的复杂性和不同毒株间的较全基因组序列的测序难度较大。大差异性，
应用简化的FLAC 技术可以快速扩增出病料中GCRV 病毒的部分基因组片段，对扩增效率较高的基因组片段进行测序分析可以确定GCRV 流行的株系特征。本研究运用此方法揭示了在江西地区收集到的病料中存在草鱼呼肠孤病毒两种毒株的混合感染，为草鱼出血病的免疫学防控提供了科学参考。
关键词：dsRNA 测序；检测；草鱼呼肠孤病毒；混合感染
中图分类号：S 917；S 941．41文献标志码：A
提取物感染的草鱼肾细胞（CIK ）中提取病毒基因组dsRNA ，电泳显示出水生呼肠孤病毒基因组的典型特征。length amplification of cDNA ）技术扩应用简化的FLAC （full-增得到病毒的4个全长基因组片段进行测序分析。核酸序873第列BLAST 分析表明：其中3个基因组片段与GCRV-5、9、10片段高度同源，HZ08另外1个基因组片段与GCRV-第11片段高度同源；因此推测病料中同时存在两种不同的病毒核酸，但也可能存在一种杂合病毒。根据已发表的GCRV-HZ08第5、9、10片段设计了3对引物对分离的病毒PCR 检测并测序，总RNA 进行RT-结果显示这3个片段与GCRV-HZ08第5、9、10片段均具有99%同源性，表明是由于混合感染而存在两株不同病毒的核酸dsRNA ，两株病毒JX01和GCRV-JX02。首次运用dsRNA 分别命名为GCRV-测序法检测出了GCRV 病毒的混合感染，为草鱼呼肠孤病毒的流行病学和防控提供了一种新的技术选择。
我国草鱼养殖量约为淡水养殖总量的23%，每年因病害导致的损失占草鱼总养殖量30%以上。在草鱼所有病原中，草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus ，GCRV ）危害最大，其感染导致的草鱼出血病是一种高传染性、高致死性的病毒性疾病，成为我国淡水养殖中最为突出的问题之一。草鱼呼肠孤病毒是无囊膜的具有双层衣壳的正二十面体粒子，核酸由11条分节段的双链RNA 组成，隶属于水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus ，ARV ），是该属成员中毒力最强的病毒。现确定GCRV 基因组共编码7个结构蛋白，根据分子量由大到小依次定义为VP1 VP7；其中VP2（病毒特异性RNA 聚合酶）和VP4（病毒特异性NTP 酶
收稿日期：2012-02-12
12）
作者简介：王
修回日期：2012-03-20
调节蛋白）属基因组结合蛋白。构成病毒内外两
VP5和VP7组成病层蛋白质外壳的5种蛋白中，
VP3和VP6构成病毒的毒粒子的外层蛋白衣壳，
VP1蛋白则横跨内外蛋白衣壳内层蛋白衣壳，层
［1－2］
。
草鱼呼肠孤病毒3' 无PolyA 尾结构，各个毒
同源性较低，无法采用设计株间序列差异较大，
PCR 的方法扩增病毒全基因组，引物进行RT-研究其基因组结构和功能的进展缓慢。MAAN 等
［3］
［4］
在SPAT 技术基础上改进的FLAC （full-
length amplification of cDNA ）技术，可以对未知基
但是因序列的dsRNA 病毒基因组序列进行扩增，研究表明其成功性受制于很多因素。在已知的
46-基金项目：国家自然科学基金（31072244）；上海市浦江人才计划（10PJ1404800）；现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-mail ：tutumissyou@163．com 土（1987—），男，硕士研究生，研究方向为水产病原学。E-
mail ：lqlv@shou．edu．cn 通讯作者：吕利群，E-
5期王土，等：应用dsRNA
测序技术检测草鱼呼肠孤病毒的混合感染757
873和GCRV-草鱼呼肠孤病毒中，只有GCRV-GD108完成了全基因组测序，难于测序的片段还需要借助传统方法破解。本研究发现部分基因
组序列利用此方法容易快速测定，且重复性好。基于此发现，我们运用简化的FLAC 技术揭示了在江西草鱼养殖区草鱼呼肠孤病毒不同毒株在
可以为研究病毒同一批病料中的混合感染现象，
性草鱼出血病病原变异和分型提供参考。本文进一步探讨了基于该技术在草鱼呼肠孤病毒流
行性调查中进行应用的可能性。
4ħ 反应过夜。
1．5．2连接产物的纯化
连接产物的纯化方法按照RNeasy kit 说明书步骤进行。1．5．3
cDNA 的合成
纯化得到的dsRNA 逆转录过程参考PrimerScripit 逆转录酶说明书。1．5．4
单引物PCR 扩增
PCR 体系参考iproof HF Polymerase 说明书。
62ħ 反应条件为：98ħ 预变性3min ；98ħ 10s ，
1
1．1
材料与方法
实验材料
30s ，72ħ 2min ，共35个循环；最后72ħ 延伸
10min 。1．6
PCR 产物T-A 克隆
PCR 产物纯化后进行3' 加dATP 反应，与载
T 连接，体pMD19-转化E．coli DH5α，涂布于含有氨苄西林的LB 固体培养基培养，进行蓝白斑筛
选，阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。1．7
GCRV M6片段的特异性PCR 检测
F /R 的设计和特异性检测引物Detection-
草鱼肾细胞（CIK ）由本实验室保存；草鱼呼
肠孤病毒由发病草鱼分离得到；Medium 199培养液购自杭州四季青公司；Trizol Reagent 购自Invitrogen 公司；引物均由上海生工生物工程有限公司合成；PrimerScripit 逆转录酶购自TaKaRa 公司；T 4RNA 连接酶购自NEB 公司；iProof High-Rad 公司；RNeasy Kit Fidelity polymerase 购自Bio-购自Qiagen 公司；其余试剂（分析纯）均购自北京
鼎国生物公司。1．2
样品的采集与保存
发病的草鱼于2011年8月采自江西南昌地
症状突出表现为鳍区疑似草鱼出血病发病池塘，
PCR 反应条件均参考SENG 等［7］和郝贵杰等［8］。1．8
验证存在两株GCRV 病毒
HZ08的第5、根据GenBank 上提交的GCRV-9、10节段序列，运用软件Primer Premier 5．0设计S5-F /R、HZ08-S9-F /R、HZ08-S10-F /引物HZ08-R ，目的扩增片段约为500bp 。PCR 反应条件：94ħ 预变性3min ；94ħ 30s ，58ħ 30s ，72ħ 1min ，35个循环；最后72ħ 延伸10min 。
1．9序列分析
将测序得到的序列用SEQMAN 软件（Lasergene ，DNAstar ）拼接，分别将核苷酸序列进X 1．81对JX01行BLAST 搜索。并用CLUSTAL-segment 9和JX02segment 11的氨基酸序列进行比对分析，用MEGA 5软件构建系统进化树。
表1扩增所用的引物序列
Tab．1Primer sequences for amplification
名称anchor-primer 5-15-1Detection-F
Detection-R
HZ08-S5-F
HZ08-S5-R
HZ08-S9-F
HZ08-S9-R
HZ08-S10-F
HZ08-S10-R
序列（5' －3' ）
p-GACCTCTGAGGATTCTAAAC /isp9/TCCAGTTTAGAATCC-OH （Bam H I ）GAGGGATCCAGTTTAGAAT CCTCAGAGGTC
ATCCCGTATATCTATGGCTT TTGGAGACGAACATAGACGC
TACCTAAGTCCGTTCTAACTGCTAC CACGTCAGTCGGACTCGGAT TTGGACATCTGATCGGCTCAGCT CAACTGGATCAGTCCAGGGGAG AATGGTCGTGGATTCGATGTGCT TAAGCGGAGCAGAAAACGCATCAAG
基、鳃盖、眼眶明显充血，局部皮肤块状充血，带回实验室－80ħ 保存。1．3
病毒的分离与培养
［5］［6］
综合柯丽华等和毛树坚等方法，研磨组织制成均匀的悬液。8000r /min离心30min ，收
微孔滤膜过滤，将滤液（即为病毒液）集上清液，
于4ħ 保存。取病毒液感染CIK 细胞，观察细胞至出现明显的细胞病变效应（CPE ），收集上清，于－20ħ 保存。
1．4病毒基因组提取
病毒基因组dsRNA 的提取参考MAAN ［3］等，并且于1%琼脂糖凝胶电泳作快速分析。1．5
FLAC 技术的应用与简化
［3］
根据MAAN 等的FLAC 技术扩增出病毒基因组全长cDNA 。
1．5．1dsRNA 3' 加接头
500 1000ng 纯化的dsRNA 与500ng anchor-primer 在T 4RNA ligase （10U ）的作用下，
758上海海洋大学学报21
卷
2
2．1
结果
采集病毒样品感染草鱼肾细胞
（CPE ）。表现为部分细胞凋亡，细胞空洞化且中央可见凋亡小体（图1中2所示）。同时还观察到感染细胞融合成一个大细胞（图1中3所示）。根据这些症状初步确认病料中含有GCRV
。
将病鱼分离得到的病毒样品感染CIK 细胞，连续观察2d ，出现了明显的病毒性细胞病变
图1Fig．1
病毒感染CIK 细胞后的细胞病变效应（ˑ 10）
Cytopathic effect after virus infection in CIK （ˑ 10）
1．正常细胞；2-3．分别为病毒感染细胞后出现凋亡和融合现象。
2．2
病毒基因组琼脂糖凝胶分析
病毒基因组dsRNA 用1%琼脂糖凝胶电泳胞中提取总RNA ，用GCRV M6片段特异性检测
PCR 扩增，引物（detection F /R）进行RT-均扩增出与目的片段一致的条带，大小约为500bp （图
3），确认江西南昌地区草鱼发病鱼感染了GCRV
。
进行快速鉴定，结果显示：分离到的病毒基因组
显示出典型的水生呼肠孤病毒组基因特征，由于每个部分中各节段的分子量接近，难以分离，因此按照电泳迁移率大小主要显出大（L ）、中（M ）、小（S ）3个部分的节段（图2），参考张超等这种节
［9］
段共移现象在水生呼肠孤病毒中普遍存在。
图3Fig．3
病毒基因组M6片段的PCR 检测Detection of GCRV M6by PCR
1．DL5000分子量标准；2－3．分别为RT-PCR 检测病鱼组织和病毒感染的细胞；4．阴性对照。
2．4
图2
Fig．2
病毒基因组电泳图谱of GCRV
利用FLAC 技术扩增病毒基因组的cDNA FLAC-PCR 结果显示，使用Taq 聚合酶扩增
Electrophoresis of the genomic dsRNAs
出较多非特异条带，而未能得到目的基因组。采
用iproof HF 聚合酶成功扩增出病毒的基因组节段，且非特异性扩增减少（图4）。因此iproof HF
PCR 扩增酶。聚合酶可作为有效的FLAC-
2．3GCRV M6片段的PCR 检测
分别从病鱼组织和采集病料感染的CIK 细
5期王土，等：应用dsRNA
测序技术检测草鱼呼肠孤病毒的混合感染759
2．5
部分基因组全片段测序结果分析
FLAC 技术所得全基因组片段中，有4个基因片段的测序结果相对易得，且重复性高。对这
4个片段测序的结果进行分析，发现其5' 和3' 具有草鱼呼肠孤病毒基因组的典型序列特征（表2）。BLAST 结果表明，其中3个基因的核酸序列
873的S5、S9和S10相应序列同源性高与GCRV-1个基因的核酸序列与GCRV-HZ08的达99%，
S11序列同源性达到99%，873与而GCRV-GCRV-HZ08的序列差异性比较大［8］，初步分析病料中同时存在2个毒株，也可能是这两种病毒的杂合病毒。将FLAC 法测序得到的4个基因片S5/S9/S10和JX02-S11。段命名为JX01-序列分析
图4FLAC 技术扩增得到的病毒基因组电泳图谱
Fig．4Electrophoresis of the viral genome
generated by FLAC
1．DL5000分子量标准；2－3．分别为用Taq 聚合酶和iproof HF 聚合酶PCR 扩增病毒基因组。
表2Tab．2
毒株
基因片段segment 5（S5）
JX01JX02
segment 9（S9）segment 10（S10）segment 11（S11）
长度/bp[**************]
sequences analysis
序列
5'NCR
3'NCR
开放阅读框（ORF ）长度/bp[1**********]930
氨基酸残基数目
[1**********]0
5'GUUAUUU …AUCAUC 3' 5'GUUAUUU …AUCAUC 3' 5'GUUAUUU …UUCAUC 3' 5'GUAAUUU …UUCAUC 3'
2．6用PCR 测序技术分析采集病料中是否存
在两株病毒
873和为了确认病料中是否存在GCRV-GCRV-HZ08两种病毒株，根据GenBank 中
GCRV-HZ08的第5、9、10节段序列，设计引物对PCR ，采集病料样品进行RT-结果均显示出与目的片段一致的条带，大小都约为500bp （图5）。PCR 产物测序后经BLAST 比对，显示这3个片段
873高度的序列与FLAC 法测序所得的与GCRV-S9和S10全长序列差异较大，同源的S5、却分别
HZ08的第5、9、10节段的同源性均高与GCRV-达99%。至此，我们确认采集病料总dsRNA 中，
873和GCRV-HZ08基因组包含了分别与GCRV-核酸高度同源的2套病毒基因组，并将这两株病
JX01和GCRV-JX02。毒分别命名为GCRV-2．7
基于测序结果构建系统进化树
2．7．1JX01进化树分析
基于JX01第9基因组片段的序列构建的系
JX01病毒株与GCRV-统进化树分析结果表明，
873自然聚类，亲缘关系最近，而与其他的水生呼肠孤病毒相差较远（图6）
。
图5
GCRV-HZ08毒株的5、9和10片段的PCR 检测Fig．5
Detection of 5，9，10fragment of GCRV-HZ08strain
1．DL5000分子量标准；2－4．分别为引物HZ08-S5-F /R、HZ08-S9-F /R、HZ08-S10-F /RPCR 扩增；5．阴性对照。
2．7．2
JX02进化树分析
基于JX02的第11基因组片段序列构建的系
JX02病毒株与GCRV-统进化树分析结果表明，HZ08自然聚类，亲缘关系最近，而与其他的水生呼肠孤病毒相差较远（图7）。
3讨论
草鱼呼肠孤病毒是我国分离鉴定的第一株
760上海海洋大学学报21卷
鱼类病毒，可导致草鱼鱼种大批死亡，还能感染
［2］
麦穗鱼（Pseudorasbora parva ）等。青鱼（Piceus ）、
目前我国缺乏病毒性草鱼出血病的治疗手段，各
地正在推广疫苗的免疫防控技术。由于草鱼呼肠孤病毒不同株系间同源性低，免疫交叉保护性差，因此对不同地区流行株系的实时监控是采用疫苗控制草鱼出血病爆发的前提。本研究通过
PCR 检测，细胞学观察和特异性引物进行RT-证
实病鱼感染了草鱼呼肠孤病毒。在此基础上进
一步利用FLAC 技术得到病毒部分基因组片段的全序列，序列分析表明在该地区同时流行两种GCRV 病毒，分别命名为JX01和JX02。由于迄今未见草鱼呼肠孤病毒不同株系间存在重组杂合病毒的报道，本研究也未分离出杂合病毒，故确定在江西养殖区存在两株GCRV 病毒混合感染
。
图6
Fig．6
S9序列构建的系统进化树基于JX01-
Phylogenetic trees based on the amino sequence of JX01segment
9with counterpart segmentsfrom other reoviruses
873：AF403395．1；Grass carp 采用邻位相邻法，步长为1000。各病毒GenBank 登录号如下：Grass carp reovirus strain GCRV-hemorrhagic virus ：AF284504．1；Golden shiner reovirus ：AF403406．1；American grass carp reovirus strain AGCRV _PB01-155：EF589106．1；American grass carp reovirus ：NC_010592．1；Grass carp reovirus strain GCRV-GD108：HQ231205．1
。
图7
Fig．7
S11序列构建的系统进化树基于JX02-
Phylogenetic trees based on the amino sequence of JX02segment11
with counterpart segmentsfrom other reoviruses
873：AF403397．1；Grass carp hemorrhagic 采用邻位相邻法，步长为1000。各病毒GenBank 登录号如下：Grass carp reovirus GCRV-virus ：AF234321．1；Golden shiner reovirus ：AF403408．1；American grass carp reovirus strain AGCRV _PB01-155：EF589108．1；American grass carp reovirus ：NC_010594．1；Grass carp reovirus strain HZ08：GU350748．1。
SPAT （single primer amplification technique ）技术
［4］
9、10和11损失，提高了对特异性基因组片段（5、片段）的检测效率和成功率。此方法虽然不能在短时间内扩增得到病毒全基因组序列，只能测出其中部分节段的全序列，但不失为一种检测草鱼呼肠孤病毒及其株型较为快速、高效的方法。
对JX01的3个基因组片段的核苷酸序列分S5、S9、S10全长分别为2239bp 、2184析表明，
对dsRNA 病毒测序准确率和成功率都不
高。FLAC 技术将一个可折叠的锚状引物连接在病毒dsRNA 3' 两端，提高了逆转录的效率和准确率，从而能够扩增出基因组全长cDNA 。本研究采用高效的RNA 纯化试剂盒，替代了传统RNA 电泳割胶回收的方法，有效减少了RNA 降解和
5期王土，等：应用dsRNA
测序技术检测草鱼呼肠孤病毒的混合感染
［3］
761
bp 、1130bp ，都含有唯一的开放阅读框，分别编
352、276个氨基酸残基。经比对，3个片码727、
873相应片段一段两端的保守序列均与GCRV-S11核苷酸序列分析表明，S11全长致。对JX02-1104bp ，含有唯一开放阅读框，编码310个氨基
HZ08一致。酸残基，其两端的保守序列与GCRV-研究表明水生呼肠孤病毒同属之间的末端保守
序列相似，故两端保守序列的确定也可以作为鉴。别呼肠孤病毒的重要依据
为了统一PCR 扩增的反应条件和效率，在确HZ08定是否为GCRV 混合感染时，针对GCRV-S9、S10引物设计中将其目标扩增序列的的S5、
长度都确定为约500bp 。扩增产物测序结果进
HZ08一步表明，同一病料中也能够扩增出GCRV-9、10相应目标片段，的5、据此推测这批病料中同
时存在这两株不同的病毒，属于混合感染。PCR 鉴定技术本研究已用无限稀释法和RT-纯化分离了这两株GCRV 病毒，下一步将测定这两株病毒全基因组序列，研究它们的基因组结构和复制特性。我们的研究既能够为分析病毒变毒株分类和流行分布情况奠定基础，也能为异、
该地区草鱼出血病的免疫学防控提供科学参考。参考文献：
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762上海海洋大学学报21
卷
Detection of the co-infection of different grass carp reovirus strains using
dsRNA sequencing technology
WANG Tu ，XU Dan ，L Li-qun
（Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources ，Ministry of Agriculture ，Shanghai Ocean University ，Shanghai 201306，China ）
Abstract ：Viral genomic dsRNAs were extracted from Ctenopharyngodon idellus kidney （CIK ）cells inoculated by diseased grass carp visceral organs with hemorrhagic symptom ，and analyzed by agarose gel to show the typical genomic pattern of Aquareovirus．The purified viral pathogen caused typical cytopathic effects in CIK cells．A simplified dsRNA sequencing technology modified from FLAC （full-length amplification of cDNA ）method was employed to sequencing the partial viral dsRNA genomic fragments．Four full-length dsRNA genomic fragments of the amplified cDNA fragments were successfully sequenced．Phylogenetic analysis was performed to identify two different viral strains in our sample ，which indicated that there were two GCRV strains ，named as JX01and JX02respectively ，causing disease in grass carp in Jiangxi province．The data further suggested that we could monitor the pandemic viral strains using our simplified dsRNA sequencing technology．Our research thus provides a new technical method for the prevention ，control and epidemiology of grass carp reovirus disease．
Key words ：dsRNA sequence ；detection ；grass carp reovirus ；co-infection 檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿殨
檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿殨
檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿殨
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檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿殨
文章编号：1674－5566（2012）05－0756－07
应用dsRNA 测序技术检测草鱼呼肠孤病毒的混合感染
王
土，许
丹，吕利群
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摘要：从草鱼（Ctenopharyngodon idellus ）出血病疑似病料研究亮点：草鱼呼肠孤病毒是危害草鱼养殖最为严重的病原之一，由于其基因组dsRNA 组成的复杂性和不同毒株间的较全基因组序列的测序难度较大。大差异性，
应用简化的FLAC 技术可以快速扩增出病料中GCRV 病毒的部分基因组片段，对扩增效率较高的基因组片段进行测序分析可以确定GCRV 流行的株系特征。本研究运用此方法揭示了在江西地区收集到的病料中存在草鱼呼肠孤病毒两种毒株的混合感染，为草鱼出血病的免疫学防控提供了科学参考。
关键词：dsRNA 测序；检测；草鱼呼肠孤病毒；混合感染
中图分类号：S 917；S 941．41文献标志码：A
提取物感染的草鱼肾细胞（CIK ）中提取病毒基因组dsRNA ，电泳显示出水生呼肠孤病毒基因组的典型特征。length amplification of cDNA ）技术扩应用简化的FLAC （full-增得到病毒的4个全长基因组片段进行测序分析。核酸序873第列BLAST 分析表明：其中3个基因组片段与GCRV-5、9、10片段高度同源，HZ08另外1个基因组片段与GCRV-第11片段高度同源；因此推测病料中同时存在两种不同的病毒核酸，但也可能存在一种杂合病毒。根据已发表的GCRV-HZ08第5、9、10片段设计了3对引物对分离的病毒PCR 检测并测序，总RNA 进行RT-结果显示这3个片段与GCRV-HZ08第5、9、10片段均具有99%同源性，表明是由于混合感染而存在两株不同病毒的核酸dsRNA ，两株病毒JX01和GCRV-JX02。首次运用dsRNA 分别命名为GCRV-测序法检测出了GCRV 病毒的混合感染，为草鱼呼肠孤病毒的流行病学和防控提供了一种新的技术选择。
我国草鱼养殖量约为淡水养殖总量的23%，每年因病害导致的损失占草鱼总养殖量30%以上。在草鱼所有病原中，草鱼呼肠孤病毒（grass carp reovirus ，GCRV ）危害最大，其感染导致的草鱼出血病是一种高传染性、高致死性的病毒性疾病，成为我国淡水养殖中最为突出的问题之一。草鱼呼肠孤病毒是无囊膜的具有双层衣壳的正二十面体粒子，核酸由11条分节段的双链RNA 组成，隶属于水生呼肠孤病毒属（Aquareovirus ，ARV ），是该属成员中毒力最强的病毒。现确定GCRV 基因组共编码7个结构蛋白，根据分子量由大到小依次定义为VP1 VP7；其中VP2（病毒特异性RNA 聚合酶）和VP4（病毒特异性NTP 酶
收稿日期：2012-02-12
12）
作者简介：王
修回日期：2012-03-20
调节蛋白）属基因组结合蛋白。构成病毒内外两
VP5和VP7组成病层蛋白质外壳的5种蛋白中，
VP3和VP6构成病毒的毒粒子的外层蛋白衣壳，
VP1蛋白则横跨内外蛋白衣壳内层蛋白衣壳，层
［1－2］
。
草鱼呼肠孤病毒3' 无PolyA 尾结构，各个毒
同源性较低，无法采用设计株间序列差异较大，
PCR 的方法扩增病毒全基因组，引物进行RT-研究其基因组结构和功能的进展缓慢。MAAN 等
［3］
［4］
在SPAT 技术基础上改进的FLAC （full-
length amplification of cDNA ）技术，可以对未知基
但是因序列的dsRNA 病毒基因组序列进行扩增，研究表明其成功性受制于很多因素。在已知的
46-基金项目：国家自然科学基金（31072244）；上海市浦江人才计划（10PJ1404800）；现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-mail ：tutumissyou@163．com 土（1987—），男，硕士研究生，研究方向为水产病原学。E-
mail ：lqlv@shou．edu．cn 通讯作者：吕利群，E-
5期王土，等：应用dsRNA
测序技术检测草鱼呼肠孤病毒的混合感染757
873和GCRV-草鱼呼肠孤病毒中，只有GCRV-GD108完成了全基因组测序，难于测序的片段还需要借助传统方法破解。本研究发现部分基因
组序列利用此方法容易快速测定，且重复性好。基于此发现，我们运用简化的FLAC 技术揭示了在江西草鱼养殖区草鱼呼肠孤病毒不同毒株在
可以为研究病毒同一批病料中的混合感染现象，
性草鱼出血病病原变异和分型提供参考。本文进一步探讨了基于该技术在草鱼呼肠孤病毒流
行性调查中进行应用的可能性。
4ħ 反应过夜。
1．5．2连接产物的纯化
连接产物的纯化方法按照RNeasy kit 说明书步骤进行。1．5．3
cDNA 的合成
纯化得到的dsRNA 逆转录过程参考PrimerScripit 逆转录酶说明书。1．5．4
单引物PCR 扩增
PCR 体系参考iproof HF Polymerase 说明书。
62ħ 反应条件为：98ħ 预变性3min ；98ħ 10s ，
1
1．1
材料与方法
实验材料
30s ，72ħ 2min ，共35个循环；最后72ħ 延伸
10min 。1．6
PCR 产物T-A 克隆
PCR 产物纯化后进行3' 加dATP 反应，与载
T 连接，体pMD19-转化E．coli DH5α，涂布于含有氨苄西林的LB 固体培养基培养，进行蓝白斑筛
选，阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。1．7
GCRV M6片段的特异性PCR 检测
F /R 的设计和特异性检测引物Detection-
草鱼肾细胞（CIK ）由本实验室保存；草鱼呼
肠孤病毒由发病草鱼分离得到；Medium 199培养液购自杭州四季青公司；Trizol Reagent 购自Invitrogen 公司；引物均由上海生工生物工程有限公司合成；PrimerScripit 逆转录酶购自TaKaRa 公司；T 4RNA 连接酶购自NEB 公司；iProof High-Rad 公司；RNeasy Kit Fidelity polymerase 购自Bio-购自Qiagen 公司；其余试剂（分析纯）均购自北京
鼎国生物公司。1．2
样品的采集与保存
发病的草鱼于2011年8月采自江西南昌地
症状突出表现为鳍区疑似草鱼出血病发病池塘，
PCR 反应条件均参考SENG 等［7］和郝贵杰等［8］。1．8
验证存在两株GCRV 病毒
HZ08的第5、根据GenBank 上提交的GCRV-9、10节段序列，运用软件Primer Premier 5．0设计S5-F /R、HZ08-S9-F /R、HZ08-S10-F /引物HZ08-R ，目的扩增片段约为500bp 。PCR 反应条件：94ħ 预变性3min ；94ħ 30s ，58ħ 30s ，72ħ 1min ，35个循环；最后72ħ 延伸10min 。
1．9序列分析
将测序得到的序列用SEQMAN 软件（Lasergene ，DNAstar ）拼接，分别将核苷酸序列进X 1．81对JX01行BLAST 搜索。并用CLUSTAL-segment 9和JX02segment 11的氨基酸序列进行比对分析，用MEGA 5软件构建系统进化树。
表1扩增所用的引物序列
Tab．1Primer sequences for amplification
名称anchor-primer 5-15-1Detection-F
Detection-R
HZ08-S5-F
HZ08-S5-R
HZ08-S9-F
HZ08-S9-R
HZ08-S10-F
HZ08-S10-R
序列（5' －3' ）
p-GACCTCTGAGGATTCTAAAC /isp9/TCCAGTTTAGAATCC-OH （Bam H I ）GAGGGATCCAGTTTAGAAT CCTCAGAGGTC
ATCCCGTATATCTATGGCTT TTGGAGACGAACATAGACGC
TACCTAAGTCCGTTCTAACTGCTAC CACGTCAGTCGGACTCGGAT TTGGACATCTGATCGGCTCAGCT CAACTGGATCAGTCCAGGGGAG AATGGTCGTGGATTCGATGTGCT TAAGCGGAGCAGAAAACGCATCAAG
基、鳃盖、眼眶明显充血，局部皮肤块状充血，带回实验室－80ħ 保存。1．3
病毒的分离与培养
［5］［6］
综合柯丽华等和毛树坚等方法，研磨组织制成均匀的悬液。8000r /min离心30min ，收
微孔滤膜过滤，将滤液（即为病毒液）集上清液，
于4ħ 保存。取病毒液感染CIK 细胞，观察细胞至出现明显的细胞病变效应（CPE ），收集上清，于－20ħ 保存。
1．4病毒基因组提取
病毒基因组dsRNA 的提取参考MAAN ［3］等，并且于1%琼脂糖凝胶电泳作快速分析。1．5
FLAC 技术的应用与简化
［3］
根据MAAN 等的FLAC 技术扩增出病毒基因组全长cDNA 。
1．5．1dsRNA 3' 加接头
500 1000ng 纯化的dsRNA 与500ng anchor-primer 在T 4RNA ligase （10U ）的作用下，
758上海海洋大学学报21
卷
2
2．1
结果
采集病毒样品感染草鱼肾细胞
（CPE ）。表现为部分细胞凋亡，细胞空洞化且中央可见凋亡小体（图1中2所示）。同时还观察到感染细胞融合成一个大细胞（图1中3所示）。根据这些症状初步确认病料中含有GCRV
。
将病鱼分离得到的病毒样品感染CIK 细胞，连续观察2d ，出现了明显的病毒性细胞病变
图1Fig．1
病毒感染CIK 细胞后的细胞病变效应（ˑ 10）
Cytopathic effect after virus infection in CIK （ˑ 10）
1．正常细胞；2-3．分别为病毒感染细胞后出现凋亡和融合现象。
2．2
病毒基因组琼脂糖凝胶分析
病毒基因组dsRNA 用1%琼脂糖凝胶电泳胞中提取总RNA ，用GCRV M6片段特异性检测
PCR 扩增，引物（detection F /R）进行RT-均扩增出与目的片段一致的条带，大小约为500bp （图
3），确认江西南昌地区草鱼发病鱼感染了GCRV
。
进行快速鉴定，结果显示：分离到的病毒基因组
显示出典型的水生呼肠孤病毒组基因特征，由于每个部分中各节段的分子量接近，难以分离，因此按照电泳迁移率大小主要显出大（L ）、中（M ）、小（S ）3个部分的节段（图2），参考张超等这种节
［9］
段共移现象在水生呼肠孤病毒中普遍存在。
图3Fig．3
病毒基因组M6片段的PCR 检测Detection of GCRV M6by PCR
1．DL5000分子量标准；2－3．分别为RT-PCR 检测病鱼组织和病毒感染的细胞；4．阴性对照。
2．4
图2
Fig．2
病毒基因组电泳图谱of GCRV
利用FLAC 技术扩增病毒基因组的cDNA FLAC-PCR 结果显示，使用Taq 聚合酶扩增
Electrophoresis of the genomic dsRNAs
出较多非特异条带，而未能得到目的基因组。采
用iproof HF 聚合酶成功扩增出病毒的基因组节段，且非特异性扩增减少（图4）。因此iproof HF
PCR 扩增酶。聚合酶可作为有效的FLAC-
2．3GCRV M6片段的PCR 检测
分别从病鱼组织和采集病料感染的CIK 细
5期王土，等：应用dsRNA
测序技术检测草鱼呼肠孤病毒的混合感染759
2．5
部分基因组全片段测序结果分析
FLAC 技术所得全基因组片段中，有4个基因片段的测序结果相对易得，且重复性高。对这
4个片段测序的结果进行分析，发现其5' 和3' 具有草鱼呼肠孤病毒基因组的典型序列特征（表2）。BLAST 结果表明，其中3个基因的核酸序列
873的S5、S9和S10相应序列同源性高与GCRV-1个基因的核酸序列与GCRV-HZ08的达99%，
S11序列同源性达到99%，873与而GCRV-GCRV-HZ08的序列差异性比较大［8］，初步分析病料中同时存在2个毒株，也可能是这两种病毒的杂合病毒。将FLAC 法测序得到的4个基因片S5/S9/S10和JX02-S11。段命名为JX01-序列分析
图4FLAC 技术扩增得到的病毒基因组电泳图谱
Fig．4Electrophoresis of the viral genome
generated by FLAC
1．DL5000分子量标准；2－3．分别为用Taq 聚合酶和iproof HF 聚合酶PCR 扩增病毒基因组。
表2Tab．2
毒株
基因片段segment 5（S5）
JX01JX02
segment 9（S9）segment 10（S10）segment 11（S11）
长度/bp[**************]
sequences analysis
序列
5'NCR
3'NCR
开放阅读框（ORF ）长度/bp[1**********]930
氨基酸残基数目
[1**********]0
5'GUUAUUU …AUCAUC 3' 5'GUUAUUU …AUCAUC 3' 5'GUUAUUU …UUCAUC 3' 5'GUAAUUU …UUCAUC 3'
2．6用PCR 测序技术分析采集病料中是否存
在两株病毒
873和为了确认病料中是否存在GCRV-GCRV-HZ08两种病毒株，根据GenBank 中
GCRV-HZ08的第5、9、10节段序列，设计引物对PCR ，采集病料样品进行RT-结果均显示出与目的片段一致的条带，大小都约为500bp （图5）。PCR 产物测序后经BLAST 比对，显示这3个片段
873高度的序列与FLAC 法测序所得的与GCRV-S9和S10全长序列差异较大，同源的S5、却分别
HZ08的第5、9、10节段的同源性均高与GCRV-达99%。至此，我们确认采集病料总dsRNA 中，
873和GCRV-HZ08基因组包含了分别与GCRV-核酸高度同源的2套病毒基因组，并将这两株病
JX01和GCRV-JX02。毒分别命名为GCRV-2．7
基于测序结果构建系统进化树
2．7．1JX01进化树分析
基于JX01第9基因组片段的序列构建的系
JX01病毒株与GCRV-统进化树分析结果表明，
873自然聚类，亲缘关系最近，而与其他的水生呼肠孤病毒相差较远（图6）
。
图5
GCRV-HZ08毒株的5、9和10片段的PCR 检测Fig．5
Detection of 5，9，10fragment of GCRV-HZ08strain
1．DL5000分子量标准；2－4．分别为引物HZ08-S5-F /R、HZ08-S9-F /R、HZ08-S10-F /RPCR 扩增；5．阴性对照。
2．7．2
JX02进化树分析
基于JX02的第11基因组片段序列构建的系
JX02病毒株与GCRV-统进化树分析结果表明，HZ08自然聚类，亲缘关系最近，而与其他的水生呼肠孤病毒相差较远（图7）。
3讨论
草鱼呼肠孤病毒是我国分离鉴定的第一株
760上海海洋大学学报21卷
鱼类病毒，可导致草鱼鱼种大批死亡，还能感染
［2］
麦穗鱼（Pseudorasbora parva ）等。青鱼（Piceus ）、
目前我国缺乏病毒性草鱼出血病的治疗手段，各
地正在推广疫苗的免疫防控技术。由于草鱼呼肠孤病毒不同株系间同源性低，免疫交叉保护性差，因此对不同地区流行株系的实时监控是采用疫苗控制草鱼出血病爆发的前提。本研究通过
PCR 检测，细胞学观察和特异性引物进行RT-证
实病鱼感染了草鱼呼肠孤病毒。在此基础上进
一步利用FLAC 技术得到病毒部分基因组片段的全序列，序列分析表明在该地区同时流行两种GCRV 病毒，分别命名为JX01和JX02。由于迄今未见草鱼呼肠孤病毒不同株系间存在重组杂合病毒的报道，本研究也未分离出杂合病毒，故确定在江西养殖区存在两株GCRV 病毒混合感染
。
图6
Fig．6
S9序列构建的系统进化树基于JX01-
Phylogenetic trees based on the amino sequence of JX01segment
9with counterpart segmentsfrom other reoviruses
873：AF403395．1；Grass carp 采用邻位相邻法，步长为1000。各病毒GenBank 登录号如下：Grass carp reovirus strain GCRV-hemorrhagic virus ：AF284504．1；Golden shiner reovirus ：AF403406．1；American grass carp reovirus strain AGCRV _PB01-155：EF589106．1；American grass carp reovirus ：NC_010592．1；Grass carp reovirus strain GCRV-GD108：HQ231205．1
。
图7
Fig．7
S11序列构建的系统进化树基于JX02-
Phylogenetic trees based on the amino sequence of JX02segment11
with counterpart segmentsfrom other reoviruses
873：AF403397．1；Grass carp hemorrhagic 采用邻位相邻法，步长为1000。各病毒GenBank 登录号如下：Grass carp reovirus GCRV-virus ：AF234321．1；Golden shiner reovirus ：AF403408．1；American grass carp reovirus strain AGCRV _PB01-155：EF589108．1；American grass carp reovirus ：NC_010594．1；Grass carp reovirus strain HZ08：GU350748．1。
SPAT （single primer amplification technique ）技术
［4］
9、10和11损失，提高了对特异性基因组片段（5、片段）的检测效率和成功率。此方法虽然不能在短时间内扩增得到病毒全基因组序列，只能测出其中部分节段的全序列，但不失为一种检测草鱼呼肠孤病毒及其株型较为快速、高效的方法。
对JX01的3个基因组片段的核苷酸序列分S5、S9、S10全长分别为2239bp 、2184析表明，
对dsRNA 病毒测序准确率和成功率都不
高。FLAC 技术将一个可折叠的锚状引物连接在病毒dsRNA 3' 两端，提高了逆转录的效率和准确率，从而能够扩增出基因组全长cDNA 。本研究采用高效的RNA 纯化试剂盒，替代了传统RNA 电泳割胶回收的方法，有效减少了RNA 降解和
5期王土，等：应用dsRNA
测序技术检测草鱼呼肠孤病毒的混合感染
［3］
761
bp 、1130bp ，都含有唯一的开放阅读框，分别编
352、276个氨基酸残基。经比对，3个片码727、
873相应片段一段两端的保守序列均与GCRV-S11核苷酸序列分析表明，S11全长致。对JX02-1104bp ，含有唯一开放阅读框，编码310个氨基
HZ08一致。酸残基，其两端的保守序列与GCRV-研究表明水生呼肠孤病毒同属之间的末端保守
序列相似，故两端保守序列的确定也可以作为鉴。别呼肠孤病毒的重要依据
为了统一PCR 扩增的反应条件和效率，在确HZ08定是否为GCRV 混合感染时，针对GCRV-S9、S10引物设计中将其目标扩增序列的的S5、
长度都确定为约500bp 。扩增产物测序结果进
HZ08一步表明，同一病料中也能够扩增出GCRV-9、10相应目标片段，的5、据此推测这批病料中同
时存在这两株不同的病毒，属于混合感染。PCR 鉴定技术本研究已用无限稀释法和RT-纯化分离了这两株GCRV 病毒，下一步将测定这两株病毒全基因组序列，研究它们的基因组结构和复制特性。我们的研究既能够为分析病毒变毒株分类和流行分布情况奠定基础，也能为异、
该地区草鱼出血病的免疫学防控提供科学参考。参考文献：
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762上海海洋大学学报21
卷
Detection of the co-infection of different grass carp reovirus strains using
dsRNA sequencing technology
WANG Tu ，XU Dan ，L Li-qun
（Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources ，Ministry of Agriculture ，Shanghai Ocean University ，Shanghai 201306，China ）
Abstract ：Viral genomic dsRNAs were extracted from Ctenopharyngodon idellus kidney （CIK ）cells inoculated by diseased grass carp visceral organs with hemorrhagic symptom ，and analyzed by agarose gel to show the typical genomic pattern of Aquareovirus．The purified viral pathogen caused typical cytopathic effects in CIK cells．A simplified dsRNA sequencing technology modified from FLAC （full-length amplification of cDNA ）method was employed to sequencing the partial viral dsRNA genomic fragments．Four full-length dsRNA genomic fragments of the amplified cDNA fragments were successfully sequenced．Phylogenetic analysis was performed to identify two different viral strains in our sample ，which indicated that there were two GCRV strains ，named as JX01and JX02respectively ，causing disease in grass carp in Jiangxi province．The data further suggested that we could monitor the pandemic viral strains using our simplified dsRNA sequencing technology．Our research thus provides a new technical method for the prevention ，control and epidemiology of grass carp reovirus disease．
Key words ：dsRNA sequence ；detection ；grass carp reovirus ；co-infection 檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿殨
檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿殨
檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿殨
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檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿檿殨