意义未明的特发性血细胞减少症临床及实验室检测分析 意义未明的特发性血细胞减少症临床及实验室检测分析
陶朝欣1， 邢江涛1， 张玉娜1， 柳江超1， 郭丽改1， 许丽亚1， 朱 芸2
（1. 河北医科大学附属平安医院检验科，河北 石家庄 050021；2. 河北医科大学第二医院检验科，河北 石家庄 050000）
摘要：目的 对确诊为意义未明的特发性血细胞减少症（ICUS）患者进行探讨，了解其疾病的发展及归属。方法 收集ICUS患者骨髓涂片及外周血涂片、免疫抗原CD34检测、骨髓活检、染色体核型分析、融合基因WT1检测结果并进行综合分析。结果 15例ICUS患者病程均＞8个月，表现为1系以上的血细胞减少，有11例是在河北医科大学附属平安医院确诊的，其中2例曾在外院诊断为血小板减少性紫癜，后期因白细胞（WBC）、血红蛋白（Hb）减少，确诊为ICUS，4例是外院确诊后入住本院治疗。15例患者中有1例患者骨髓象表现为红系幼红细胞偶见病态造血，个别患者实验室检查原始细胞数、CD34抗原、融合基因WT1高于参考范围。结论 多种疾病可引起血细胞减少，结合临床表现及实验室检查，意义未明的特发性血细胞减少症最终是否进展为典型的骨髓增生异常综合征（MDS）、再生障碍性贫血（AA）或其他血细胞减少性疾病，目前仍需进行临床动态观察。
关键词：意义未明的特发性血细胞减少症；血细胞减少；骨髓增生异常综合征；病态造血；再生障碍性贫血
意义未明的特发性血细胞减少症[idiopathic cytopenia with uncertain（undetermined）significance，ICUS]，是一组＞6个月血细胞持续1系或多系减少的疾病，能排除血液系统和非血液系统疾病引起的血细胞减少。ICUS是一组尚不能明确诊断的血细胞减少性疾病的一种新的概念[1-2]，ICUS概念的提出得到了从事血液病工作的临床医师及实验室医师的广泛关注[3-5]，我们对确诊为ICUS的15例患者进行了总结分析，动态观察其疾病发展及归属。
材料和方法
一、对象
收集2010年10月至2014年10月河北医科大学附属平安医院15例ICUS患者标本进行临床及实验室观察。其中男10例，女5例，男女之比为2∶1，年龄4～53岁。
二、临床资料
病程均＞10个月，最长8年以上。观察骨髓次数2～5次，患者表现1系或多系血细胞减少而就诊，15例患者多表现为面色苍白、乏力，6例有皮肤出血点。
三、试剂和仪器
1.试剂 Ficoll淋巴细胞分离液（上海化学试剂研究所）；RNA提取试剂盒（北京百泰克公司）；ABL基因上游引物、下游引物、探针（上海生工生物公司合成）；WT1基因上游引物、下游引物、探针（上海生工生物公司合成）；2×Taq Man通用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）公共体系（北京百泰克公司）；藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的鼠抗人单抗CD34（美国Beckman-Coulter公司）。
2.仪器 Epics XL流式细胞仪（美国Beckman-Coulter公司）；ABI Prism 7300型PCR仪（美国ABI公司）；752紫外分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；数据分析使用EXPO32ADC软件；OLYMPUS CH31-CH51光学显微镜。
四、血细胞形态学观察
骨髓涂片、血涂片经瑞-吉氏复合染液染色后，在光学显微镜下观察血细胞形态。骨髓涂片计数200个有核细胞，计数各系血细胞所占比例，观察血细胞形态学有无异常改变，计数全片巨核细胞总数，并对巨核细胞进行分类，求各型巨核细胞的百分比。血涂片计数100个白细胞，计数各类血细胞所占百分比。组织细胞化学染色：对贫血患者进行铁染色，观察内外铁分布情况。细胞内铁：用油镜计数100个幼红细胞，记录铁粒幼细胞的百分数；细胞外铁：用低倍镜观察骨髓涂片细胞外铁的分布。
五、骨髓活检
取骨髓组织1.5～2.0 cm，用2 mL中性福尔马林固定2 h，盐酸福尔马林脱钙4～6 h，经过梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡浸透后，用石蜡包埋，切片3 μm制片，伊红-苏木素常规染色，在光学显微镜下低倍视野观察骨髓组织结构。
六、流式细胞仪CD34检测
抽取乙二胺四乙酸抗凝的骨髓液2 mL，按操作说明提取细胞悬液。采用CD45和侧向角散射（side scatter，SSC）双参数散点图设门识别原始细胞，血液病治疗及移植国际联合会（the International Society for Hematotherapy and Graft Engineering，ISHAGE）法检测CD34阳性细胞，计数CD34阳性细胞百分数。
七、染色体核型分析
取骨髓液2 mL肝素抗凝，接种到培养瓶，经24 h 培养后，收集细胞常规制片，G显带，根据《细胞遗传学国际命名体制（ ICSN1995） 》判定核型异常。
八、 融合基因WT1检测
取骨髓液2～3 mL肝素抗凝，按操作步骤分离单个核细胞提取RNA。制备ABL质粒标准品，稀释成不同浓度，制作标准曲线[6]。建立实时荧光定量PCR技术的实验条件，使PCR 扩增效率达到最佳并且使各基因扩增效率一致，利用ABL标准曲线计算WT1及ABL基因的拷贝数[7]，拷贝数＞1 000为阳性，每次实验均设置阴性对照焦磷酸二乙酯[（DEPC）水代替模板cDNA]和阳性对照（已知的阳性标本）。
结 果
一、血常规检测
初诊时血红蛋白（hemoglobin，Hb）减低11例（73%），其中轻度减低4例（26.7%），中度减低4例（26.7%），重度减低3例（20%），正常4例（26.7%）。初诊时白细胞（white blood cell，WBC）减低13例（86.7%），正常2例（13.3%）。血小板（platelet，PLT）减低13例（86.7%），正常2例（13.3%）。患者复诊Hb、 WBC、PLT检查结果与初诊结果比较，有初诊某项指标减低者，在治疗过程中可恢复到正常。有初诊某项指标正常者，复诊时随着疾病的进展，出现贫血、WBC或PLT减少的情况。见表1。
表1 15例ICUS外周血血细胞检测结果
注：RBC为red blood cell
WBC分类血细胞减少所属系列中性淋巴单核例1女452.792.[1**********]47初诊：2系血细胞减少（Hb、WBC）4.713.83109200复诊：1系血细胞减少（Hb）例2女111.863.[1**********]4初诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）2.304.[1**********]4复诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）例3男232.552.[1**********]4初诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）4.113.[1**********]6复诊：1系血细胞减少（PLT）例4男 85.762.[1**********]初诊：2系血细胞减少（Hb、PLT）3.123.499095复诊：3系血细胞减少2.503.[1**********]复诊：3系血细胞减少例5男263.053.[1**********]4初诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）6.522.741028复诊：3系血细胞减少例6男271.081.725467初诊：3系血细胞减少1.781.[1**********]复诊：3系血细胞减少2.702.166867复诊：3系血细胞减少例7女112.201.807226初诊：3系血细胞减少2.872.3382324456复诊：3系血细胞减少3.222.[1**********]6复诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）4.083.[1**********]1复诊：1系血细胞减少（PLT）4.202.[1**********]3复诊：2系血细胞减少（Hb、PLT）例8男 55.973.[1**********]3初诊：1系血细胞减少（PLT）7.633.[1**********]7复诊：2系血细胞减少（Hb、PLT）例9男531.061.[1**********]5初诊：2系血细胞减少（WBC、Hb）1.991.[1**********]2复诊：2系血细胞减少（WBC、Hb）例10男252.062.[1**********]初诊：3系血细胞减少2.644.[1**********]复诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）4.004.[1**********]6复诊：（治疗后正常）4.503.[1**********]7复诊：1系血细胞减少（PLT）例11男261.383.[1**********]8初诊：3系血细胞减少1.433.[1**********]复诊：3系血细胞减少例12女111.131.87686初诊：3系血细胞减少1.251.[1**********]复诊：3系血细胞减少2.493.[1**********]4复诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）例13女272.001.5450105248初诊：3系血细胞减少2.303.[1**********]复诊：3系血细胞减少例14男361.402.[1**********]初诊：3系血细胞减少4.611.[1**********]复诊：2系血细胞减少（Hb、PLT）例15男302.803.[1**********]12初诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）3.403.6713185复诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）4.712.1682328702复诊：2系血细胞减少（Hb、PLT）病例性别年龄WBC（×109/L）（×1012/L）Hb（g/L）PLT（×109/L）RBC
二、观察骨髓2～5次初诊骨髓增生程度
增生活跃11例（73%），增生明显活跃3例（20%），增生减低1例（6.7%）。初诊粒系比例正常5例（33.3%），减低7例（46.7%），轻度增高3例（20%），原始细胞比例14例患者0.0%～1.5%，例7患者共做过5次骨穿，第3次幼红细胞增生，原始细胞稍多见（2%）。初诊红系比例正常1例（6.7%），减低5例（33.3%），轻度增高～明显增高9例（60%）。初诊时粒红比值正常3例（20%），减低9例（60%），增高3例（20%）。初诊时巨核细胞数：正常3例（20%），减低10例（66.7%），增多2例（13.3%）。复诊骨穿各项指标（有核细胞增生程度、粒系增生情况、红系增生情况、粒红比值、巨核细胞数量），与初诊骨穿结果比较，复诊骨穿结果会出现有核细胞增生或减低，粒系比例表现减低或正常者多见，增生者少见。红系比例以轻度增多和明显增多为主，增生减低者少见。巨核细胞数量与初诊骨穿结果比较，有减低、正常或增生。组织细胞化学染色：细胞内铁为35%～78%，细胞外铁为+～+++。见表2、表3。
表2 15例ICUS患者骨髓血细胞检查结果
病例性别年龄增生程度粒系总和（%）红系总和（%）粒红比值原始细胞（%）巨核细胞（个/片）例1女45活跃54.0～57.030.5～31.01.77～1.87068～81例2女11活跃～极度35.6～47.629.2～38.80.90～1.630.4～0.815～252例3男23活跃25.5～32.535.5～42.50.72～0.760.5～1.00～4例4男 8活跃～明显38.5～69.04.5～31.51.46～15.330～1.550～74例5男26活跃～明显35.5～40.035.0～40.00.89～1.1401～5例6男27活跃～减低12.0～38.57.0～27.01.28～1.880～10～1例7女11活跃～减低25.5～44.50.5～41.00.62～2.960～20～14例8男 5活跃47.0～49.212.8～16.52.85～3.840～0.520～21例9男53活跃～明显68.5～74.014.5～17.54.23～4.720～17～58例10男25活跃～明显28.0～45.534.5～68.00.90～1.320.5～1.51～141例11男26活跃～明显44.5～59.524.0～51.00.87～2.480～0.523～226例12女11活跃21.5～33.038.5～41.00.56～0.6704～6例13女27活跃～明显19.5～43.542.0～43.50.45～1.000～0.51～4例14男36活跃34.5～49.028.5～53.00.65～1.270～0.50～33例15男30活跃～明显54.0～62.511.5～32.41.67～5.430～1.50～194
表3 15例ICUS患者骨髓血细胞形态学检查结果
病例性别年龄检查次数 骨髓形态学病态造血情况例1女451骨髓象无特异性改变（WBC减少症）无2骨髓象无特异性改变（WBC减少症）无例2女111粒系增生减低无2巨核细胞增生无例3男231幼红细胞增生活跃、巨核细胞减少无2幼红细胞增生活跃、巨核细胞缺如红系偶见病态例4男81外诊ITP治疗后骨髓象显示红巨2系增生减低无2红巨2系增生活跃、巨核细胞成熟受阻无3红巨2系增生减低无例5男261巨核细胞缺如红系偶见病态2幼红细胞增生活跃、巨核细胞减少无例6男271巨核细胞缺如无2粒红2系增生减低、巨核细胞缺如、淋巴细胞增多无3巨核细胞增生减低无
注：ITP为特发性PLT减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura）
病例性别年龄检查次数 骨髓形态学病态造血情况例7女111有核细胞增生减低、红巨2系受抑无2巨核细胞减少无3幼红细胞增生活跃红系偶见病态4粒巨2系增生减低无5巨核细胞缺如、淋巴细胞比例增高无例8男51幼红细胞增生稍低无2骨髓象无明显异常改变无例9男531粒系嗜酸粒细胞稍多见粒系偶见病态2嗜酸粒细胞稍多见无例10男251幼红细胞增生、巨核细胞减少无2幼红细胞增生无3巨核细胞增生无4巨核细胞增生活跃无例11男261粒巨2系成熟受阻无2粒巨2系成熟受阻、红巨2系增生无例12女111幼红细胞增生、粒巨2系增生减低红系偶见病态2粒巨2系增生减低红系偶见病态3粒巨2系增生减低无例13女271幼红细胞增生，粒巨2系增减低红系偶见病态2巨核细胞增生减低红系偶见病态例14男361幼红细胞增生活跃，巨核细胞缺如红系偶见病态2幼红细胞增生活跃红系偶见病态例15男301幼红细胞增生稍低、巨核细胞缺如无2巨核细胞成熟受阻无3巨核细胞增生无
三、ICUS患者骨髓象活检结果
骨髓有核细胞增生程度：大致正常～较活跃11例（73.33%），增生低下3例（20%），极度低下1例（6.7%）。13例未见幼稚前体细胞异常定位（abnormal localization of immature precursor，ALIP）及幼稚细胞簇，2例偶见原早期细胞。粒系比例正常3例（20%），粒系轻度减少6例（40%），明显减少4例（26.67%），粒系比例增高2例（13.33%）。红系幼红细胞增生正常10例（66.67%），减少1例（6.7%）， 增多4例（26.67%），以中晚期细胞为主。巨核细胞数量、形态正常6例（40%），减少或缺如9例（60%）。组织化学染色：铁染色（-）；银染色（-）～（+）。骨髓活检增生程度、粒系、红系、巨核细胞增生情况无明显差异。
四、流式细胞仪CD34检测
CD34表达为0.60%～2.22%，例10患者CD34表达稍高（2.22%）。见表4。
表4 15例ICUS患者染色体核型与WT1融合基因检查结果
（%）染色体核型WT1融合基因检测例1女450.7646，XX[7]-例2女110.8346，XX[5]-例3男230.1646，XY5]-例4男81.38未见分裂相-例5男260.3646，XY[4]-例6男270.1246，XY8]-例7女110.6046，XX[5]3.6×103例8男50.4046，XY8]-例9男531.6546，XY6]-例10男252.2246，XY[5]-例11男261.7746，XY[6]-例12女111.4046，XX[4]-47，XX，+C[1]例13女271.0046，XX[7]-例14男360.1346，XY[6]-例15男300.8046，XY[13]-病例性别年龄CD34
五、染色体核型分析
例12患者C组多1条染色体（46，XX［4］，47，XX +C［1］），C组是6～12号染色体，但分辨不清具体是哪条染色体，其他均无特异性染色体。见表4。
六、WT1融合基因检测
例7患者 WT1检测结果为3.6×103，其他均阴性。见表4。
讨 论
ICUS是一组尚不能归类为既往已知的血细胞减少症，2008年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）正式引入了ICUS的概念[1-2]：（1）1系或多系持续血细胞减少（＞6月）；（2）血细胞减少标准为Hb＜110 g/L，中性粒细胞＜1.5×109/L，PLT＜100×109/L；（3）不符合骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）的最低诊断标准；（4）除外其他血液系统和非血液系统疾病导致的血细胞减少；（5）定期随访，动态观察骨髓检查；（6）完善必要检查如骨髓活检、免疫组织化学、铁染色、血涂片染色。以往凡是骨髓有核细胞增生不减低者，无法归类于其他血细胞减少的患者，多数被诊断为MDS，使MDS的诊断比较泛滥。自2000年以来，WHO在欧美多位血液病专家充分讨论的基础上，在法美英白血病协作组（French-American-British Cooperative Group，FAB）MDS诊断的基础上，多次对MDS诊断标准进行了修正、补充和细化，严格规范了MDS最低诊断标准[1-2]：（1）至少1系（RBC、粒细胞或PLT）持续出现（＞6个月）明显减少；（2）具有1项或1项以上的MDS特异性骨髓特征（1系或多系增生异常的细胞≥10%、环形铁幼粒细胞≥15%、原粒细胞≥5%或具有MDS相关的核型）。严格规范了MDS的诊断标准，使MDS诊断标准更具体、更严格和更完善。
本研究中的15例ICUS患者初诊表现为1系或多系血细胞减少，以2系以上血细胞减少为主（表1），其中1系血细胞减少症1例（6.6%），2系血细胞减少症7例（46.7%），3系血细胞减少症7例（46.7%）。有的患者初期仅表现为PLT减少，巨核细胞成熟受阻，往往被诊断为ITP， ITP是一种免疫性PLT破坏过多造成的疾病，一般临床表现为有出血现象，PLT数量减少，大部分患者不累及粒系、红系血细胞改变，只有少数患者因长期有出血现象，可出现轻度贫血。PLT减少也是多种疾病的临床表现，有的PLT减少是血液系统疾病的首发表现，如例4、例11曾在外院诊断为ITP，随着时间的延长，已累及到红系、粒系血细胞减少。目前，例4、例11患者3系血细胞减少，已不符合ITP的诊断，确诊为ICUS；例10患者初诊3系血细胞减少，治疗后血细胞逐渐恢复正常，但有反复；例7、例10患者多次骨髓穿刺，只有1次实验室检查，原始细胞数、CD34抗原、融合基因WT1高于参考范围（表2、表4）。流式细胞检测广泛应用于血液系统疾病，为血液系统疾病的诊断和治疗提供了可靠依据[8-10]，但是确认原始细胞数，应以骨髓中原始细胞数为准，不应以流式CD34抗原表达为准。WT1融合基因在原始细胞增多时有高表达，比如急性髓系白血病、MDS，在其他血细胞减少的疾病中表达水平低，主要在MDS、再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA ）鉴别诊断中有重要的临床意义。骨髓活检和骨髓形态学检查同时应用于ICUS诊断及临床观察，二者能相互补充、相互印证，能够更早和更全面地发现疾病病理变化。综观本研究中15例ICUS患者实验室检查结果及临床表现，原始细胞不增多，部分患者红系幼红细胞偶见病态造血，达不到MDS最低诊断标准，而不能归入MDS，目前仍属于动态观察的范畴。
以往对ICUS的认识，在不同学者之间多有争议，2007年MDS修改方案中已把ICUS作为MDS诊断过程中必须排除的一种新型疾病。2008年WHO正式提出ICUS的诊断标准，并得到了国内外大多数学者的认同，承认还有新的未被认知的血细胞减少症，这对于全血细胞减少的规范化诊断、发病机制的研究和靶向治疗均具有十分重要的意义。血细胞减少是由许多疾病反应在外周血血细胞检查中的共同表现[11-12]。临床常见病因主要由造血系统疾病引起，占74.49%～83.10%[13-14]。造血系统引起的血细胞减少性疾病，常见于MDS、AA、巨幼细胞贫血、急性白血病。大部分病例诊断较容易，少部分病例由于临床症状重叠，骨髓形态学不典型而难以明确诊断。如MDS亚型中MDS不能分类（myelodysplastic syndromeunclassifiable，MDS-U），该亚型表现为血细胞减少，病态造血＜10%，不能归入MDS任何一型，与ICUS鉴别较困难。ICUS与MDS-U比较：有血细胞减少，但无病态造血。AA由于骨髓衰竭，骨髓表现有核细胞增生减低，粒、红、巨3系血细胞减少，非造血细胞增多而确诊。但是在早期AA或慢性AA时，由于形态学不典型，并不能在短期内明确诊断。ICUS患者有的表现为有核细胞增生减低，淋巴细胞比例增高，但由于巨核细胞不减少而不能诊断为AA。非造血系统疾病引起的血细胞减少性疾病占16.9%～22.1%[13-14]，如急性和慢性肝病、肾功能衰竭、恶性肿瘤、免疫性结缔组织病，免疫性疾病多累及外周血1系或多系血细胞减少[15-17]，引起全血细胞减少的主要机制是患者体内产生自身抗体，破坏血细胞，主要累及外周血，临床表现为相关免疫性疾病的症状，实验室可检测到相关疾病的抗体。ICUS最终的归属，在疾病的发展过程中会不会出现病态造血，李秋柏[5]提出，ICUS是一类血细胞减少疾病的“临时”诊断，是否为MDS的更早阶段， ICUS和MDS从本质上究竟是同属恶性单克隆疾病，还是属于临床表现上有交集但本质不同的二类疾病，是否最终可被诊断为MDS，还是一种独立的血细胞减少症，可能需要临床较长的观察过程。邵宗鸿等[3]提出，应建立中国ICUS病例登记库，加强实验室间合作，进行ICUS临床及生物学特征大样本研究。
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（本文编辑：范基农）
Clinical and laboratory determination analysis of idiopathic cytopenia with uncertain（undetermined）significance
TAO Chaoxin1，XING Jiangtao1，ZHANG Yuna1，LIU Jiangchao1，GUO Ligai1，XU Liya1，ZHU Yun2.
（1. Department of Clinical Laboratory，Ping'an Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050021，Hebei，China； 2. Department of Clinical Laboratory，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，Hebei，China）
Abstract：Objective To investigate idiopathic cytopenia with uncertain（undetermined） significance（ICUS） and its development. Methods ICUS patients were observed for their bone marrow smears and peripheral blood smears. CD34 antigen，bone marrow biopsy，karyotype analysis and fusion gene WT1 were also determined. Results The durations of 15 ICUS patients were ＞8 months，and they showed a series of blood cell reducing. There were 11 cases diagnosed in Hebei Medical University Ping'an Hospital. The 2 cases of them had been diagnosed as idiopathic thrombocytopenic purpura in other hospitals，and then they were diagnosed as ICUS because of white blood cell（WBC） and hemoglobin（Hb） reducing later. The other 4 cases were treated in Hebei Medical University Ping'an Hospital after being diagnosed in other hospitals. Some of the 15 patients' bone marrow showed occasional dyshaematopoiesis in erythroid normoblast. Some patients' primitive cells，CD34 antigen and fusion gene WT1 were higher than related reference ranges. Conclusions Various diseases can lead to blood cell reducing. Combined with clinical manifestations and laboratory examinations，whether ICUS will have progress to typical myelodysplastic syndrome（MDS），aplastic anemia（AA），or other blood cell reducing diseases，it still requires dynamic clinical observation.
Key words：Idiopathic cytopenia with uncertain（undetermined） significance；Blood cell reducing；Myelodysplastic syndrome；Dyshaematopoiesis；Aplastic anemia
文章编号：1673-8640（2016）011-0929-07
中图分类号：R446.1
文献标志码：A
DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2016.011.001
作者简介：陶朝欣，女，1981年生，学士，主管技师，主要从事血液病诊断研究。
通讯作者：朱 芸，联系电话：0311-67802256。
收稿日期：（2015-12-22）
意义未明的特发性血细胞减少症临床及实验室检测分析 意义未明的特发性血细胞减少症临床及实验室检测分析
陶朝欣1， 邢江涛1， 张玉娜1， 柳江超1， 郭丽改1， 许丽亚1， 朱 芸2
（1. 河北医科大学附属平安医院检验科，河北 石家庄 050021；2. 河北医科大学第二医院检验科，河北 石家庄 050000）
摘要：目的 对确诊为意义未明的特发性血细胞减少症（ICUS）患者进行探讨，了解其疾病的发展及归属。方法 收集ICUS患者骨髓涂片及外周血涂片、免疫抗原CD34检测、骨髓活检、染色体核型分析、融合基因WT1检测结果并进行综合分析。结果 15例ICUS患者病程均＞8个月，表现为1系以上的血细胞减少，有11例是在河北医科大学附属平安医院确诊的，其中2例曾在外院诊断为血小板减少性紫癜，后期因白细胞（WBC）、血红蛋白（Hb）减少，确诊为ICUS，4例是外院确诊后入住本院治疗。15例患者中有1例患者骨髓象表现为红系幼红细胞偶见病态造血，个别患者实验室检查原始细胞数、CD34抗原、融合基因WT1高于参考范围。结论 多种疾病可引起血细胞减少，结合临床表现及实验室检查，意义未明的特发性血细胞减少症最终是否进展为典型的骨髓增生异常综合征（MDS）、再生障碍性贫血（AA）或其他血细胞减少性疾病，目前仍需进行临床动态观察。
关键词：意义未明的特发性血细胞减少症；血细胞减少；骨髓增生异常综合征；病态造血；再生障碍性贫血
意义未明的特发性血细胞减少症[idiopathic cytopenia with uncertain（undetermined）significance，ICUS]，是一组＞6个月血细胞持续1系或多系减少的疾病，能排除血液系统和非血液系统疾病引起的血细胞减少。ICUS是一组尚不能明确诊断的血细胞减少性疾病的一种新的概念[1-2]，ICUS概念的提出得到了从事血液病工作的临床医师及实验室医师的广泛关注[3-5]，我们对确诊为ICUS的15例患者进行了总结分析，动态观察其疾病发展及归属。
材料和方法
一、对象
收集2010年10月至2014年10月河北医科大学附属平安医院15例ICUS患者标本进行临床及实验室观察。其中男10例，女5例，男女之比为2∶1，年龄4～53岁。
二、临床资料
病程均＞10个月，最长8年以上。观察骨髓次数2～5次，患者表现1系或多系血细胞减少而就诊，15例患者多表现为面色苍白、乏力，6例有皮肤出血点。
三、试剂和仪器
1.试剂 Ficoll淋巴细胞分离液（上海化学试剂研究所）；RNA提取试剂盒（北京百泰克公司）；ABL基因上游引物、下游引物、探针（上海生工生物公司合成）；WT1基因上游引物、下游引物、探针（上海生工生物公司合成）；2×Taq Man通用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）公共体系（北京百泰克公司）；藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的鼠抗人单抗CD34（美国Beckman-Coulter公司）。
2.仪器 Epics XL流式细胞仪（美国Beckman-Coulter公司）；ABI Prism 7300型PCR仪（美国ABI公司）；752紫外分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；数据分析使用EXPO32ADC软件；OLYMPUS CH31-CH51光学显微镜。
四、血细胞形态学观察
骨髓涂片、血涂片经瑞-吉氏复合染液染色后，在光学显微镜下观察血细胞形态。骨髓涂片计数200个有核细胞，计数各系血细胞所占比例，观察血细胞形态学有无异常改变，计数全片巨核细胞总数，并对巨核细胞进行分类，求各型巨核细胞的百分比。血涂片计数100个白细胞，计数各类血细胞所占百分比。组织细胞化学染色：对贫血患者进行铁染色，观察内外铁分布情况。细胞内铁：用油镜计数100个幼红细胞，记录铁粒幼细胞的百分数；细胞外铁：用低倍镜观察骨髓涂片细胞外铁的分布。
五、骨髓活检
取骨髓组织1.5～2.0 cm，用2 mL中性福尔马林固定2 h，盐酸福尔马林脱钙4～6 h，经过梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡浸透后，用石蜡包埋，切片3 μm制片，伊红-苏木素常规染色，在光学显微镜下低倍视野观察骨髓组织结构。
六、流式细胞仪CD34检测
抽取乙二胺四乙酸抗凝的骨髓液2 mL，按操作说明提取细胞悬液。采用CD45和侧向角散射（side scatter，SSC）双参数散点图设门识别原始细胞，血液病治疗及移植国际联合会（the International Society for Hematotherapy and Graft Engineering，ISHAGE）法检测CD34阳性细胞，计数CD34阳性细胞百分数。
七、染色体核型分析
取骨髓液2 mL肝素抗凝，接种到培养瓶，经24 h 培养后，收集细胞常规制片，G显带，根据《细胞遗传学国际命名体制（ ICSN1995） 》判定核型异常。
八、 融合基因WT1检测
取骨髓液2～3 mL肝素抗凝，按操作步骤分离单个核细胞提取RNA。制备ABL质粒标准品，稀释成不同浓度，制作标准曲线[6]。建立实时荧光定量PCR技术的实验条件，使PCR 扩增效率达到最佳并且使各基因扩增效率一致，利用ABL标准曲线计算WT1及ABL基因的拷贝数[7]，拷贝数＞1 000为阳性，每次实验均设置阴性对照焦磷酸二乙酯[（DEPC）水代替模板cDNA]和阳性对照（已知的阳性标本）。
结 果
一、血常规检测
初诊时血红蛋白（hemoglobin，Hb）减低11例（73%），其中轻度减低4例（26.7%），中度减低4例（26.7%），重度减低3例（20%），正常4例（26.7%）。初诊时白细胞（white blood cell，WBC）减低13例（86.7%），正常2例（13.3%）。血小板（platelet，PLT）减低13例（86.7%），正常2例（13.3%）。患者复诊Hb、 WBC、PLT检查结果与初诊结果比较，有初诊某项指标减低者，在治疗过程中可恢复到正常。有初诊某项指标正常者，复诊时随着疾病的进展，出现贫血、WBC或PLT减少的情况。见表1。
表1 15例ICUS外周血血细胞检测结果
注：RBC为red blood cell
WBC分类血细胞减少所属系列中性淋巴单核例1女452.792.[1**********]47初诊：2系血细胞减少（Hb、WBC）4.713.83109200复诊：1系血细胞减少（Hb）例2女111.863.[1**********]4初诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）2.304.[1**********]4复诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）例3男232.552.[1**********]4初诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）4.113.[1**********]6复诊：1系血细胞减少（PLT）例4男 85.762.[1**********]初诊：2系血细胞减少（Hb、PLT）3.123.499095复诊：3系血细胞减少2.503.[1**********]复诊：3系血细胞减少例5男263.053.[1**********]4初诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）6.522.741028复诊：3系血细胞减少例6男271.081.725467初诊：3系血细胞减少1.781.[1**********]复诊：3系血细胞减少2.702.166867复诊：3系血细胞减少例7女112.201.807226初诊：3系血细胞减少2.872.3382324456复诊：3系血细胞减少3.222.[1**********]6复诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）4.083.[1**********]1复诊：1系血细胞减少（PLT）4.202.[1**********]3复诊：2系血细胞减少（Hb、PLT）例8男 55.973.[1**********]3初诊：1系血细胞减少（PLT）7.633.[1**********]7复诊：2系血细胞减少（Hb、PLT）例9男531.061.[1**********]5初诊：2系血细胞减少（WBC、Hb）1.991.[1**********]2复诊：2系血细胞减少（WBC、Hb）例10男252.062.[1**********]初诊：3系血细胞减少2.644.[1**********]复诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）4.004.[1**********]6复诊：（治疗后正常）4.503.[1**********]7复诊：1系血细胞减少（PLT）例11男261.383.[1**********]8初诊：3系血细胞减少1.433.[1**********]复诊：3系血细胞减少例12女111.131.87686初诊：3系血细胞减少1.251.[1**********]复诊：3系血细胞减少2.493.[1**********]4复诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）例13女272.001.5450105248初诊：3系血细胞减少2.303.[1**********]复诊：3系血细胞减少例14男361.402.[1**********]初诊：3系血细胞减少4.611.[1**********]复诊：2系血细胞减少（Hb、PLT）例15男302.803.[1**********]12初诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）3.403.6713185复诊：2系血细胞减少（WBC、PLT）4.712.1682328702复诊：2系血细胞减少（Hb、PLT）病例性别年龄WBC（×109/L）（×1012/L）Hb（g/L）PLT（×109/L）RBC
二、观察骨髓2～5次初诊骨髓增生程度
增生活跃11例（73%），增生明显活跃3例（20%），增生减低1例（6.7%）。初诊粒系比例正常5例（33.3%），减低7例（46.7%），轻度增高3例（20%），原始细胞比例14例患者0.0%～1.5%，例7患者共做过5次骨穿，第3次幼红细胞增生，原始细胞稍多见（2%）。初诊红系比例正常1例（6.7%），减低5例（33.3%），轻度增高～明显增高9例（60%）。初诊时粒红比值正常3例（20%），减低9例（60%），增高3例（20%）。初诊时巨核细胞数：正常3例（20%），减低10例（66.7%），增多2例（13.3%）。复诊骨穿各项指标（有核细胞增生程度、粒系增生情况、红系增生情况、粒红比值、巨核细胞数量），与初诊骨穿结果比较，复诊骨穿结果会出现有核细胞增生或减低，粒系比例表现减低或正常者多见，增生者少见。红系比例以轻度增多和明显增多为主，增生减低者少见。巨核细胞数量与初诊骨穿结果比较，有减低、正常或增生。组织细胞化学染色：细胞内铁为35%～78%，细胞外铁为+～+++。见表2、表3。
表2 15例ICUS患者骨髓血细胞检查结果
病例性别年龄增生程度粒系总和（%）红系总和（%）粒红比值原始细胞（%）巨核细胞（个/片）例1女45活跃54.0～57.030.5～31.01.77～1.87068～81例2女11活跃～极度35.6～47.629.2～38.80.90～1.630.4～0.815～252例3男23活跃25.5～32.535.5～42.50.72～0.760.5～1.00～4例4男 8活跃～明显38.5～69.04.5～31.51.46～15.330～1.550～74例5男26活跃～明显35.5～40.035.0～40.00.89～1.1401～5例6男27活跃～减低12.0～38.57.0～27.01.28～1.880～10～1例7女11活跃～减低25.5～44.50.5～41.00.62～2.960～20～14例8男 5活跃47.0～49.212.8～16.52.85～3.840～0.520～21例9男53活跃～明显68.5～74.014.5～17.54.23～4.720～17～58例10男25活跃～明显28.0～45.534.5～68.00.90～1.320.5～1.51～141例11男26活跃～明显44.5～59.524.0～51.00.87～2.480～0.523～226例12女11活跃21.5～33.038.5～41.00.56～0.6704～6例13女27活跃～明显19.5～43.542.0～43.50.45～1.000～0.51～4例14男36活跃34.5～49.028.5～53.00.65～1.270～0.50～33例15男30活跃～明显54.0～62.511.5～32.41.67～5.430～1.50～194
表3 15例ICUS患者骨髓血细胞形态学检查结果
病例性别年龄检查次数 骨髓形态学病态造血情况例1女451骨髓象无特异性改变（WBC减少症）无2骨髓象无特异性改变（WBC减少症）无例2女111粒系增生减低无2巨核细胞增生无例3男231幼红细胞增生活跃、巨核细胞减少无2幼红细胞增生活跃、巨核细胞缺如红系偶见病态例4男81外诊ITP治疗后骨髓象显示红巨2系增生减低无2红巨2系增生活跃、巨核细胞成熟受阻无3红巨2系增生减低无例5男261巨核细胞缺如红系偶见病态2幼红细胞增生活跃、巨核细胞减少无例6男271巨核细胞缺如无2粒红2系增生减低、巨核细胞缺如、淋巴细胞增多无3巨核细胞增生减低无
注：ITP为特发性PLT减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura）
病例性别年龄检查次数 骨髓形态学病态造血情况例7女111有核细胞增生减低、红巨2系受抑无2巨核细胞减少无3幼红细胞增生活跃红系偶见病态4粒巨2系增生减低无5巨核细胞缺如、淋巴细胞比例增高无例8男51幼红细胞增生稍低无2骨髓象无明显异常改变无例9男531粒系嗜酸粒细胞稍多见粒系偶见病态2嗜酸粒细胞稍多见无例10男251幼红细胞增生、巨核细胞减少无2幼红细胞增生无3巨核细胞增生无4巨核细胞增生活跃无例11男261粒巨2系成熟受阻无2粒巨2系成熟受阻、红巨2系增生无例12女111幼红细胞增生、粒巨2系增生减低红系偶见病态2粒巨2系增生减低红系偶见病态3粒巨2系增生减低无例13女271幼红细胞增生，粒巨2系增减低红系偶见病态2巨核细胞增生减低红系偶见病态例14男361幼红细胞增生活跃，巨核细胞缺如红系偶见病态2幼红细胞增生活跃红系偶见病态例15男301幼红细胞增生稍低、巨核细胞缺如无2巨核细胞成熟受阻无3巨核细胞增生无
三、ICUS患者骨髓象活检结果
骨髓有核细胞增生程度：大致正常～较活跃11例（73.33%），增生低下3例（20%），极度低下1例（6.7%）。13例未见幼稚前体细胞异常定位（abnormal localization of immature precursor，ALIP）及幼稚细胞簇，2例偶见原早期细胞。粒系比例正常3例（20%），粒系轻度减少6例（40%），明显减少4例（26.67%），粒系比例增高2例（13.33%）。红系幼红细胞增生正常10例（66.67%），减少1例（6.7%）， 增多4例（26.67%），以中晚期细胞为主。巨核细胞数量、形态正常6例（40%），减少或缺如9例（60%）。组织化学染色：铁染色（-）；银染色（-）～（+）。骨髓活检增生程度、粒系、红系、巨核细胞增生情况无明显差异。
四、流式细胞仪CD34检测
CD34表达为0.60%～2.22%，例10患者CD34表达稍高（2.22%）。见表4。
表4 15例ICUS患者染色体核型与WT1融合基因检查结果
（%）染色体核型WT1融合基因检测例1女450.7646，XX[7]-例2女110.8346，XX[5]-例3男230.1646，XY5]-例4男81.38未见分裂相-例5男260.3646，XY[4]-例6男270.1246，XY8]-例7女110.6046，XX[5]3.6×103例8男50.4046，XY8]-例9男531.6546，XY6]-例10男252.2246，XY[5]-例11男261.7746，XY[6]-例12女111.4046，XX[4]-47，XX，+C[1]例13女271.0046，XX[7]-例14男360.1346，XY[6]-例15男300.8046，XY[13]-病例性别年龄CD34
五、染色体核型分析
例12患者C组多1条染色体（46，XX［4］，47，XX +C［1］），C组是6～12号染色体，但分辨不清具体是哪条染色体，其他均无特异性染色体。见表4。
六、WT1融合基因检测
例7患者 WT1检测结果为3.6×103，其他均阴性。见表4。
讨 论
ICUS是一组尚不能归类为既往已知的血细胞减少症，2008年世界卫生组织（World Health Organization，WHO）正式引入了ICUS的概念[1-2]：（1）1系或多系持续血细胞减少（＞6月）；（2）血细胞减少标准为Hb＜110 g/L，中性粒细胞＜1.5×109/L，PLT＜100×109/L；（3）不符合骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome，MDS）的最低诊断标准；（4）除外其他血液系统和非血液系统疾病导致的血细胞减少；（5）定期随访，动态观察骨髓检查；（6）完善必要检查如骨髓活检、免疫组织化学、铁染色、血涂片染色。以往凡是骨髓有核细胞增生不减低者，无法归类于其他血细胞减少的患者，多数被诊断为MDS，使MDS的诊断比较泛滥。自2000年以来，WHO在欧美多位血液病专家充分讨论的基础上，在法美英白血病协作组（French-American-British Cooperative Group，FAB）MDS诊断的基础上，多次对MDS诊断标准进行了修正、补充和细化，严格规范了MDS最低诊断标准[1-2]：（1）至少1系（RBC、粒细胞或PLT）持续出现（＞6个月）明显减少；（2）具有1项或1项以上的MDS特异性骨髓特征（1系或多系增生异常的细胞≥10%、环形铁幼粒细胞≥15%、原粒细胞≥5%或具有MDS相关的核型）。严格规范了MDS的诊断标准，使MDS诊断标准更具体、更严格和更完善。
本研究中的15例ICUS患者初诊表现为1系或多系血细胞减少，以2系以上血细胞减少为主（表1），其中1系血细胞减少症1例（6.6%），2系血细胞减少症7例（46.7%），3系血细胞减少症7例（46.7%）。有的患者初期仅表现为PLT减少，巨核细胞成熟受阻，往往被诊断为ITP， ITP是一种免疫性PLT破坏过多造成的疾病，一般临床表现为有出血现象，PLT数量减少，大部分患者不累及粒系、红系血细胞改变，只有少数患者因长期有出血现象，可出现轻度贫血。PLT减少也是多种疾病的临床表现，有的PLT减少是血液系统疾病的首发表现，如例4、例11曾在外院诊断为ITP，随着时间的延长，已累及到红系、粒系血细胞减少。目前，例4、例11患者3系血细胞减少，已不符合ITP的诊断，确诊为ICUS；例10患者初诊3系血细胞减少，治疗后血细胞逐渐恢复正常，但有反复；例7、例10患者多次骨髓穿刺，只有1次实验室检查，原始细胞数、CD34抗原、融合基因WT1高于参考范围（表2、表4）。流式细胞检测广泛应用于血液系统疾病，为血液系统疾病的诊断和治疗提供了可靠依据[8-10]，但是确认原始细胞数，应以骨髓中原始细胞数为准，不应以流式CD34抗原表达为准。WT1融合基因在原始细胞增多时有高表达，比如急性髓系白血病、MDS，在其他血细胞减少的疾病中表达水平低，主要在MDS、再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA ）鉴别诊断中有重要的临床意义。骨髓活检和骨髓形态学检查同时应用于ICUS诊断及临床观察，二者能相互补充、相互印证，能够更早和更全面地发现疾病病理变化。综观本研究中15例ICUS患者实验室检查结果及临床表现，原始细胞不增多，部分患者红系幼红细胞偶见病态造血，达不到MDS最低诊断标准，而不能归入MDS，目前仍属于动态观察的范畴。
以往对ICUS的认识，在不同学者之间多有争议，2007年MDS修改方案中已把ICUS作为MDS诊断过程中必须排除的一种新型疾病。2008年WHO正式提出ICUS的诊断标准，并得到了国内外大多数学者的认同，承认还有新的未被认知的血细胞减少症，这对于全血细胞减少的规范化诊断、发病机制的研究和靶向治疗均具有十分重要的意义。血细胞减少是由许多疾病反应在外周血血细胞检查中的共同表现[11-12]。临床常见病因主要由造血系统疾病引起，占74.49%～83.10%[13-14]。造血系统引起的血细胞减少性疾病，常见于MDS、AA、巨幼细胞贫血、急性白血病。大部分病例诊断较容易，少部分病例由于临床症状重叠，骨髓形态学不典型而难以明确诊断。如MDS亚型中MDS不能分类（myelodysplastic syndromeunclassifiable，MDS-U），该亚型表现为血细胞减少，病态造血＜10%，不能归入MDS任何一型，与ICUS鉴别较困难。ICUS与MDS-U比较：有血细胞减少，但无病态造血。AA由于骨髓衰竭，骨髓表现有核细胞增生减低，粒、红、巨3系血细胞减少，非造血细胞增多而确诊。但是在早期AA或慢性AA时，由于形态学不典型，并不能在短期内明确诊断。ICUS患者有的表现为有核细胞增生减低，淋巴细胞比例增高，但由于巨核细胞不减少而不能诊断为AA。非造血系统疾病引起的血细胞减少性疾病占16.9%～22.1%[13-14]，如急性和慢性肝病、肾功能衰竭、恶性肿瘤、免疫性结缔组织病，免疫性疾病多累及外周血1系或多系血细胞减少[15-17]，引起全血细胞减少的主要机制是患者体内产生自身抗体，破坏血细胞，主要累及外周血，临床表现为相关免疫性疾病的症状，实验室可检测到相关疾病的抗体。ICUS最终的归属，在疾病的发展过程中会不会出现病态造血，李秋柏[5]提出，ICUS是一类血细胞减少疾病的“临时”诊断，是否为MDS的更早阶段， ICUS和MDS从本质上究竟是同属恶性单克隆疾病，还是属于临床表现上有交集但本质不同的二类疾病，是否最终可被诊断为MDS，还是一种独立的血细胞减少症，可能需要临床较长的观察过程。邵宗鸿等[3]提出，应建立中国ICUS病例登记库，加强实验室间合作，进行ICUS临床及生物学特征大样本研究。
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（本文编辑：范基农）
Clinical and laboratory determination analysis of idiopathic cytopenia with uncertain（undetermined）significance
TAO Chaoxin1，XING Jiangtao1，ZHANG Yuna1，LIU Jiangchao1，GUO Ligai1，XU Liya1，ZHU Yun2.
（1. Department of Clinical Laboratory，Ping'an Hospital，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050021，Hebei，China； 2. Department of Clinical Laboratory，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，Hebei，China）
Abstract：Objective To investigate idiopathic cytopenia with uncertain（undetermined） significance（ICUS） and its development. Methods ICUS patients were observed for their bone marrow smears and peripheral blood smears. CD34 antigen，bone marrow biopsy，karyotype analysis and fusion gene WT1 were also determined. Results The durations of 15 ICUS patients were ＞8 months，and they showed a series of blood cell reducing. There were 11 cases diagnosed in Hebei Medical University Ping'an Hospital. The 2 cases of them had been diagnosed as idiopathic thrombocytopenic purpura in other hospitals，and then they were diagnosed as ICUS because of white blood cell（WBC） and hemoglobin（Hb） reducing later. The other 4 cases were treated in Hebei Medical University Ping'an Hospital after being diagnosed in other hospitals. Some of the 15 patients' bone marrow showed occasional dyshaematopoiesis in erythroid normoblast. Some patients' primitive cells，CD34 antigen and fusion gene WT1 were higher than related reference ranges. Conclusions Various diseases can lead to blood cell reducing. Combined with clinical manifestations and laboratory examinations，whether ICUS will have progress to typical myelodysplastic syndrome（MDS），aplastic anemia（AA），or other blood cell reducing diseases，it still requires dynamic clinical observation.
Key words：Idiopathic cytopenia with uncertain（undetermined） significance；Blood cell reducing；Myelodysplastic syndrome；Dyshaematopoiesis；Aplastic anemia
文章编号：1673-8640（2016）011-0929-07
中图分类号：R446.1
文献标志码：A
DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2016.011.001
作者简介：陶朝欣，女，1981年生，学士，主管技师，主要从事血液病诊断研究。
通讯作者：朱 芸，联系电话：0311-67802256。
收稿日期：（2015-12-22）