转基因小鼠制备实验方法
1、 选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。
2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。 4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。
6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。
9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。
10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。
(一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)
受体细胞DNA中，HSV-tk+基因产物可使GANC转变成一种有毒物质使细胞死亡
。如果发生同源重组，由于tk基因在同源区之外不能整合，neor基因在同源区之内得以保留，这样受体细胞抗G418有正选择作用，对GANC无转变功能而有负选择作用，因此认为存活的细胞是与导入基因发生同源重组的（图23-3）。Plump等（1992）用基因剔除技术已培育出缺ApoE基因的TGM模型，并利用这一AS小鼠模型研究了饮食和遗传因素对AS的影响。
图 23-3 正负双向选择法示意图
a：同源重组；b：随机整合；neor：新霉素抗性基因；HSV-tkc：疱
疹病毒胸苷激酶基因；GeneX：干细胞内源基因（与导入基因同源）；
G418：新霉素；GANC：抗致死的核苷类似物GANC；GANC：核苷类似
物参与合成，细胞致死。
近几来，随着对基因失活方面研究的深入，引发了基因剔除技术的一大飞跃，产生了条件性基因剔除（conditional gene knockout）。条件性基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。目前多采用Cre-loxP重组系统（Cre-loxP-mediated gene replacement ,Cre-loxP recombination system）。其中Cre重组酶来源于
侵染大肠杆菌P1噬菌体。分子量38000，无论在大肠杆菌体内或体外，它都能启动
DNA分子间或分子内的联合与重组，重组发生在一个被称为loxP的特异位点（loxp site），且不需要其他的蛋白质因子。在Cre酶存在时，两个loxP位点可以同源重组，切除其中间的部分，留下一个loxP位点。其原理如图23-4所示。研究发现，在哺乳动物细胞中Cre重组酶也同样能引起DNA联合和位点特异性重组。
图23-4 Cre酶作用原理
1Cre基因转译成Cre酶；2Cre酶作用于基因组上loxP位点；3Cre酶使两个loxP位点联合；4两个loxP位点发生同源重组切除X基因及一个loxP位点而仅留下一个loxP位点。
Cu等（1994）在鼠的ES细胞中利用Cre-loxP重组系统进行条件性基因剔除的程序如下：①用常规性基因剔除方法将一段新构建的DNA序列整合至内源基因组，这段新构建的DNA序列由新的（突变的）基因片段，选择性标记基因HSV-tk及neor、一个将被取代的正常基因片段等几部分组成。在此新构建的NDA序列中，在可选择性标记基因和正常基因片段的两侧都连有loxP位点；②经过基因剔除的ES细胞被一个编码Cre重组酶载体迅速传染，因此处于两个loxP位点之间的HSV-tk、neor及正常的野生型基因均在Cre酶的作用
下而被切除，只在原来的位置上留下了突变的基因和其3’端带有一个loxP位点，其Cre-loxP重组系统进行条件性基因剔除程序如图23-5所示。 条件性基因剔除系统的建立，使得转基因的目的
加明确，效果也进一步精确可靠，是基因剔除方法上的一个重大突破，将给动脉粥样硬化的研究增加更便利的条件。
图23-5 Cre loxP重组系统进行条件性基因剔除程序
1有待于被剔除的基因组上某野生型基因片段；2将一个loxP位点插在野生型基因片段的3’端；3将新构建的DNA序列整合到基因组上；4在Cre酶的作用下切除HSV-tk、neor野生型基因及一个loxP位点；5经过Cre-loxP重组系统作用后所形成的DNA序列。
广义的转基因动物是指通过实验手段将新的遗传物质导入到动物胚细胞中，并能稳定遗传，由此获得的动物称为转基因动物。转基因动物可通过插入目的基因用于过表达基因研究，或是通过插入目的基因的
shRNA来降低目的基因的本底表达，也可通过同源重组的方法获得基因Knock-in 和Knock-out小鼠。
小鼠作为最优秀的实验动物模型，在转基因动物研究领域也同样得到了广泛验证。转基因小鼠的制备技术主要有两类，DNA原核显微注射法和胚胎干细胞囊胚显微注射法。
DNA原核显微注射法
通过显微操作仪将外源基因直接注入受精卵，使外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。此方法是最经典的用于制作转基因动物的方法，也是目前应用最广泛的方法，现在的转基因动物研究大都是在Palmiter等方法的基础上有所改进而进行的。由这种方法制备的动物品种属于狭义的转基因动物的范畴。
由这种方法制备的转基因小鼠其插入目的基因的形式通常是多拷贝首尾相连的形
式，其整合到基因组的具体机制目前并没有完全研究清楚。
胚胎干细胞囊胚显微注射法
是在体外将外源基因导入胚胎干细胞；然后将转基因的胚胎干细胞通过显微操作仪注入动物囊胚，此胚胎干细胞可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合。胚胎干细胞体外培养时保持未分化状态，当被注入囊胚腔后，可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成，因此将外源DNA导入胚胎干细胞就可实现基因的转移。出生的动物其生殖系统就可能整合上外源基因，通过杂交繁育可得到具有纯合目的基因的个体，即转基因动物。目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。基因的敲除及捕获常用这类方法。
注：转基因小鼠制备技术路线，此图片由赛业（广州）生物科技有限公司提供
显微操作技术（MicromanipulationTechnique）是指在高倍倒置显微镜下，利用显微操作器（Micromanipulator），控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置，用来进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。
操作方法
目前，以细胞内微注射和微灌注技术为基础的玻璃针头(GlassNeedle，精细的玻璃微量毛细移液管)的使用，已经在越来越多的实验生物学研究领域中成为一项非常普遍的操作方法，比如在体外受精、转基因中等等。描述这些技术最恰当的话应当称其为---显微操作，因为这些操作是通过单个的或多个的筒状玻璃微量移液管、精确的定位装置（显微操作器）以及微量注射器或微量灌注器来在单个的细胞上进行的。
显微技术的分类
显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等，例如多莉羊就是运用细胞核移植技术而成功的；而转基因技术指的是将外源基因导入体细胞并能稳定的嵌入宿主动物的生殖细胞染色体中的一门技术，基因转殖动物被定义为由人为的方式将外源基因引入体内而引起基因改变的动物，并可将遗传特质传递到接续的每一世代中。 概述
微注射应用的范围非常广泛，从辅助（体外）细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运都需使用这一技术，比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和/或监测某种特定的存活细胞中的基本机体生物化学状态。这些可以注射进细胞的物质包括有：各种细胞器、激酶、组织化学标志物（比如辣根过氧化物酶或者荧光黄）、蛋白质、代谢物质、微磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的mRNA和DNA等等。运用这一技术，也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量（皮升至毫升）药剂或药物的精确输送（微灌注），例如药理学的药物检验。转基因动物的制作，可以利用基因微注射（gene microinjection）、胚干细胞（embryonic stem cells,ES cells）、精子载体（sperm vector）、反转录病毒感染（retroviral vectorinfection）及体细胞核移置（somatic cell nucleartransfer）等方法达成，其中显微注射为目前应用最普遍之方法之一。
显微注射
显微注射法（microinjection）是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组（rearrangement）、缺失
（deletion）、复制（duplication）或易位（translocation）等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。这种显微注射术的程序，需有相当精密
的显微操作设备，制造长管尖时，需用微量吸管拉长器
（micropipettepuller），注射时需有固定管尖位置的微量操作器。这种技术的长处为任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。
显微注射的优缺点
以显微注射法转外源基因没有长度上的限制，目前已证明数百kb之DNA片段均可以成功产制出转基因动物。其缺点是设备精密而昂贵、操作技术需要长时间的练习，以及每次只能注射有限的细胞。这些操作中所使用的微量移液管是用毛细管拉针器(pipettepuller)来制作的，先将玻璃毛细管加热到其熔化的温度，再将其拉制成所需的合适大小的直径和锥形，微量移液管小头的直径（小至0.2微米）与纤维操纵器的高精度相关，它可以用于精准的移液。这种精确度可以为各种类型和任意大小的细胞提供亚皮克升级或0.1微米(micron)范围内的精确的、重复性良好的细胞内和细胞旁注射。通过运用直接的水压（压力注射）或者不通过使用水流，而通过施加一电场来使带电离子运动（离子电渗法），都可以获得将微量移液管中的物质挤喷出去的效果。
常用生产转基因动物的方式
目前最常用来生产转基因动物的方式为：直接把重组过的 DNA 注入受精卵的原核(pronuleus) 中，将从胚胎提供者的输卵管中取得的授精卵移到倒置显微镜上的微量注射台上，然后利用固定吸量管 (holdingpipette) 固定住，之后注射针则依序穿过 zona pellucida，ocyte membrane 及malepronuleus membrane后，将DNA注入，注入时可以见到原核膨大。以小鼠受精卵雄原核的显微注射为例，显微注射所使用的受精卵固定吸管（holdingpipette）及注射针（injectionneedle）制备很困难，除影响操作时间外，也是影响转基因效率及基因注入后之胚胎存活及转基因成功与否极其重要的因子。固定吸管之内、外径分别为30、80μm是较为合适的，显微注射针自针尖起20μm处的外径为4μm时，可获得良好的转染效率。固定吸管的内径如果太小，会导致吸力不足，对受精卵操控不易；如太大，则受精卵易受伤害，影响胚胎的存活率。显微注射针尖如果太粗，则导致插入透明带及原核的阻力增加，且DNA流量过多，受精卵易于裂解；太细则导致针内DNA流出速率过慢，且易阻塞，而使DNA无法顺利流入原核内，影响注射效率。因此进行受精卵雄原核的显微注射时，如何制备适用固定受精卵的吸管及显微注射针是关乎转基因效率极其重要的因素。
显微注射实验操作
（1）导入DNA的制备：显微注射首先涉及导入DNA的制备，显微注射的转入基因通常为去除载体序列的线状DNA，转基因所用载体是真核表达载体，即含有在哺乳动物细胞内表达的真核启动子。所谓组织特异性的实现多是通过组织特异性启动子来实现组织特异性表达的。制备转基因小鼠，必须对待导入DNA进行分离纯化。实验必须用经过琼脂糖电泳鉴定并确定其纯度的DNA，对导入基因的大小没有特别的限制，长链DNA也可成功。 实验中注意防止一些杂质堵塞注射针，如琼脂糖颗粒、纤维物质等，需尽量超速离心除去。
DNA的注射质量是实验成功的关键。研究表明DNA注射的起始浓度大约在1ng/ml，当DNA注射浓度超过一定上限时，实验效果不佳，而且大于5 ng/ml会产生明显的毒性作用。
导入DNA的制备程序如下：
1） 通过在Tris/acetate/EDTA缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳从载体中分离待插入DNA，用5mg/ml溴乙啶染色。
2） 为防止对插入DNA的溴乙啶的破坏，用长波紫外光显影。
3） 切下目的基因所在凝胶片，电泳制备目的DNA，或用Qiaex凝胶抽提试剂盒进行抽提。
4） 乙醇沉淀目的DNA。在样品中加入1/10体积的3M乙酸钠，混匀，再加入2-2.5倍体积无菌100%乙醇进行沉淀。
5） -200C 孵育过夜后，超速离心机10000转/分，离心5分，收集沉淀，重悬沉淀于Elutip缓冲液。
6） 用Elutip-D微型柱对目的DNA过柱处理。
7） 按照步骤4重新沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀2-3次，真空干燥沉淀。清洗与干燥过程极其重要，因为残余的盐和乙醇对受精卵的发育是致命的。
8） 注射缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5）重悬沉淀，缓冲液必须是Milli-Q纯化水配制
9） 通过荧光光度计或凝胶电泳比色法评估目的DNA的浓度
10） 用注射缓冲液调整目的DNA的浓度在5-10ng/?l.
（2） 器械准备
[注射针的制作]
注射针是内含玻璃细丝的薄壁毛细吸管，它可以通过毛细管虹吸作用进行载样。用拉针仪（SUTTER,P2000 laser based micropipette puller,具体操作程序详见产品说明书）可以把注射针水平或垂直扯下来。必须保证制备的毛细管可以进入拉针仪这样加热组件大约在毛细管的中央位置。一般用内径为1.0mm的微电极管为材料制作注射针,微电极管可以买到,它与拉针仪是匹配的。另外，应该对拉针仪的设置进行选择，使细丝温度和扯拉力度(主拉力和次拉力)将处于最佳状态。具体需要预实验来确定其最佳设置。待用注射针应该用蒸馏水严格清洗以除去残留炭化物颗粒。严格的实验微电极管在使用前应经过泡酸、泡蒸馏水和硅化的程序,但有人省略了此步也有较好的结果,经拉针仪拉针后就没法清洗,好的拉针仪是不会残留炭化物颗粒,若拉成后清洗其针尖很容易断掉,可用Narishige Japan model PN-30。
[持卵管制作]
为避免机械损伤，持卵管口应该是钝性末端而且其孔隙有限，使受精卵轻轻依附在负压管道中。这种高度密实可抵抗密封系统的破损，而密封可以减少受精卵注射时的旋转运动。持卵管的口部应该光滑，平整及与其长轴垂直。具体制备操作：双手执毛细玻璃管的两端，将管的中部置酒精灯外焰烧红至变软后离开火焰，同时双手外伸，将烧软的部分拉细。用玻璃刀或细沙轮小心将细管切开，在镜下观察切口应平齐(如不平齐，应重新切割)。然后于酒精灯火焰底部的蓝焰边缘处将切口钝化处理(即将管口于蓝焰边缘处做短暂灼烧，然后于显微镜下检查管口形状，如此反复，直至满意)。如实验室配有持卵管制作仪，则可在显微镜下直接监视热灯丝对持卵管管口灼烧后的形状，及时调整二者之间的相对位置，更易得到满意的持卵管。持卵管应该做调整，用熔断仪将其打弯使其末端成15度(不同的显微注射仪度数可能有差异,打弯成25度左右,一般为20-25度)轻微弯曲以方便使用。此持卵管为不含细丝的玻璃，显微镜下用含刻度目镜确定持卵管的外径应该为100-140?m。持卵管的内径很重要,可用铂金灯丝灼烧管口,使其内径为30-50?m左右,内径要能吸住受精卵,而又不把卵吸入管内。为便于操作，持卵管可进一步调整使其末端轻微弯曲（15度）。
[洗卵管制作]
1） 点燃酒精灯，调节火焰到最佳。捏持玻璃毛细吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋转过火。
2） 当吸管开始变软，快速撤离火焰，向外急剧扯拉使吸管变长，形成口径大约200?l的吸管。注意制备过程中离开火焰的时间以及扯拉的力度，尽量保证制备吸管的一致性。
3） 为吸管评分，轻柔地折断吸管，辨别其声音是否清脆，或扯拉吸管或只做弯曲直到两根同分数的吸管断裂为止。
4） 解剖镜下(要在熔断仪上)检查吸管，并对其进行调整，确定其口径以及管口光滑平整。
[移卵管的制作]
用于转移注射后受精卵到假孕鼠体内的吸管制作过程同上洗卵管。不同的是，这些吸管的口径稍微小一些，大约150?m(150-160?m)，直径比单受精卵的口径略大一些，将促使卵细胞精细的充满移卵管并转移到输卵管。移卵管在打磨过程中要求管口更光滑平整以减轻插入输卵管时对输卵管的损伤，同时必须注意移卵管头在火焰上时间不可太长，防止融化堵塞。管口要平且要钝化。
[凹玻片的准备]
必须准备适合承载用于微注射的受精卵的凹玻片做微注射槽，也可用培养皿做注射槽，载玻片上的受精卵应该浸润在pH缓冲工作液中，如M2溶液，使受精卵在孵箱外保持30-40分能受到保护。具体凹玻片的准备程序如下：
1） 在超净台内利用手动移液器将M2溶液加入凹玻片窝的基底部形成直径大约0.6cm液面，液滴的液面要水平平整，避免液体的折射效应。吸取胚胎实验用矿物油于M2溶液上，矿物油的量以刚刚达M2溶液最高液面为宜，将凹玻片置于倒置显微镜的载物台上，在低倍镜下调节焦距，使M2溶液液滴的底面清楚为止。
2） 覆盖矿物油的作用：防止液滴脱水以及浓缩；使受精卵处于无菌状态； 固定M2溶液液滴。
3） 从孵箱中取出受精卵，用移卵管吸出受精卵并用M2溶液洗涤2-3次，调整实验用量，将其置于凹玻片的M2溶液中，调焦使在低倍镜下清楚地看到受精卵的轮廓，并且保证受精卵有足够空间自由移动，用持卵器将卵汇聚到一起，移卵时注意不要将气泡移入，影响操作视野。
[显微注射设备]
显微注射仪的基本工作原理是运用立体倒置相差显微镜进行观察监测，显微镜两侧各置一台显微操作仪，一侧接持卵管，另一侧接注射针，可调节持卵管或注射针的空间位置。持卵管通过塑料管连接一个装满矿物油的带微调的注射器，通过调节压力控制卵的运动。注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪。将注射时间与压力固定后，进行注射操作。操作系统有LEICA AS TP基因转殖操作系统（major instruments.co.Ltd）等，具体操作程序按其说明书严格进行。
（3）注射针内DNA的装载
把注射针的钝性头浸在盛待注射DNA的管中，溶液通过毛细吸管的虹吸作用进入注射针。注射针的末端应该一直留在DNA溶液中直到注射针末端有小泡形成。这说明DNA溶液装载完毕。仔细检查注射针针头末端，距其几毫米处可见一个小凹液面。最后可将载满DNA溶液的吸管装在持针器或固定在器械环中待用。
（4）受精卵的显微注射
受精卵的显微注射过程相对简单，制作大量样品过程中，为保证显微注射量的一致性，必须通过大量反复有效的练习才可以成功。
1） 置凹玻片于显微镜下，低倍聚焦。
2） 调节持卵管，注射针与受精卵在同一视野下后，转换到高倍镜（32X）下时位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。
3） 挨近注射针到工作液或油界边缘，稍微进入油界。在注射前，增加注射针的压力可见DNA溶液泡在油内形成囊状，以此确定DNA溶液流存在。
4） 如果未见DNA溶液流，则轻轻摩擦持样器钝缘，渐渐的打开注射器针头。针头重新进入油内确定DNA溶液流的存在。
5） 移动持卵管回到受精卵下部。通过微分驱动水压控制系统使持卵管内产生温和的负压，并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必须确保受精卵基底部与凹玻片基底部轻轻接触。注意不宜吸得过紧，否则会使卵变形，甚至会将卵吸人持卵器内。
6） 对持卵管内真空进行缓慢调节，使持卵管内受精卵轻柔地旋转，使卵内原核位于持卵管口的远侧端。
7） 维持持卵管稳定，使注射针的针头紧靠受精卵的透明带，进行调节并使针与原核处于同一平面上。用注射针依次刺破透明带，细胞外膜，前核核膜，进入核膜内，受精卵的透明带易被针尖刺破，前核核膜相当有弹性，应用不同的方法进行尝试突破此结构。操作时避免与核接触损伤核仁。
8） 保持注射针位置固定，轻轻增加压力使DNA溶液流入前核中。注射过程中可能出现的现象如下：
① 注射后原核将膨大到原来的两倍左右，表明注射成功，然后直接抽出注射针。 ② 一气泡出现在注射针尖端，透明带可能膨胀，表明受精卵的膜非常艰固，没有被刺破，此时需继续向内进针，直到尖端进入核，同时要小心注射针尖端极易破损。
③ 注射针压力较大，看不到任何现象，可能是注射针堵塞，需换针或更换DNA溶液。
④ 若见胞质颗粒涌出到卵黄周围空间，说明受精卵破裂。注射过程中，发现卵破裂数目较多，则需更换注射针。一支注射针一般可注射5—10枚卵。
9） 用持卵器移动受精卵到凹玻片凹内相对隔离的位置，以区分注射组与非注射组。重新安装持卵管并进行下一组操作。
5．受精卵的输卵管转移
（1）受精卵的输卵管注射
1）将麻醉小鼠放置于一塑料平皿盖上，固定小鼠牙齿于皿缘以确保小鼠气道通畅。用70%乙醇涂搽切口部位。也可预先在手术部位剔除毛发。
2）将受精卵从培养液转移至工作液内。因受精卵在转移过程中在孵箱外操作，所以应该将其从培养基中移到工作液中。
4） 用移卵管装载受精卵。移卵管的正确装载对输卵管转移的成功非常重要。如图11-1所示，吸取一定量的工作液在移卵管尖端，然后吸取些许空气制成一个小气泡。再吸取与气泡体积大约相当的工作液，紧接着在吸取另外一个小气泡。收集受精卵于尽可能小容积的工作液中，将其线形排列于移卵管中。当所有的卵被负载后，再吸取小量气体制成小气泡，接着吸取最终容量的工作液。气泡将有利于对压力进行调节，更容易使卵移动。
5） 手术暴露输卵管复合体。如图所示，在离中线约0.5厘米、背驼峰与后腿髋关节之间作横行切口。仔细用浸70%乙醇涂搽切口部位，并搽去毛发。捏住一侧切口皮肤，钝性分离皮下组织。移动皮肤直到腹壁神经走行清晰可见。这时可看到腹壁下红色卵巢或浅色卵巢脂肪垫。用眼科镊捏住腹壁，并作约0.5厘米横行切口，钝性分离组织，轻轻移出脂肪垫、卵巢、输卵管以及子宫。用弹簧夹夹住脂肪垫并保持子宫在适当位置。若子宫及子宫角频繁滑回腹腔，在保证气道通畅的前提下，可适当重新布置其位置。
6） 轻轻移动塑料平皿，使小鼠位于解剖显微镜下，适当调节显微镜及小鼠位置使其输卵管卷曲部清晰可见。
7） 用眼科镊于漏斗部透明囊膜处钝性撕开小口，并防止撕裂血管，引起出血。必要是撕裂口部位局部应用肾上腺素以减少出血，并用纱布擦拭保持操作视野干净。
8） 一旦漏斗部清晰可见，用镊子夹持其边缘并充分暴露漏斗管口。在避免壶腹损伤的前提下，尽可能插入移卵管。
9） 在压力可调节的前提下，轻轻把卵吸吹进入漏斗部。气泡可以阻止卵回流而且很容易使卵进入输卵管漏斗管。若吹卵的压力太大，那么移卵管口可能抵在输卵管壁上，这时可稍微后撤移卵管再进行操作，也可能由于血块堵塞移卵管，若这样，则应该吹出细胞在培养皿中，重新吸卵。
10） 移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置将各器官重置于腹腔内。
10）缝合切口，用小夹夹持皮肤。常用自动小夹代替缝线，这样可以避免小鼠啃嘶缝线，切口裂开。
11）若进行双侧手术，则于另一侧子宫角重复上述操作。
12）手术完成后，安置小鼠于清洁的笼中。麻醉状态下，小型哺乳动物无法有效维持机体温度。所以应该注意小鼠的保温。可以用热垫保持其温度直到动物苏醒。所有的动物在回笼前20-30分可苏醒。由于妊娠很容易使受体母鼠产生应激反应导致流产或食子，所以对受体母鼠必须严格监护。
（2）注射后期监护：手术后严格监护防止并发症的发生非常重要。麻醉易诱导小鼠出现血压升高，所以手术后必须严密监护至少2小时，同时推荐进行保温处理。
处于麻醉状态的小鼠应该用软纱布包裹，而且笼中加垫草垫以及软材料，并保持鼠笼温度。正常体温的维持可以缩短动物处于麻醉状态的时间。
手术后小鼠常规4-5天观察一次以确保小鼠处于恢复中，清醒小鼠应活动自如。腹腔手术后小鼠有发生肠疝的可能。所以手术时保持切口尽量小，缝合严密，而组织胶水的正确应用可以避免此类并发症的发生。皮肤必须用缝线或不锈刚夹夹闭，手术后1-2周可拔除。如果动物状态不良，表现厌食，脱水，或明显弓背，通过动物饮水可给予羟苯基乙酰胺以及同类止疼药。若发生脱水，可腹腔注射0.9%生理盐水或林格氏液。若仍无改善可在麻醉状态下重新打开手切口确认是否有疝发生。若动物状态无明显好转，最终采用安乐死进行。
[实验原理]
显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制, 可达100kb ；实验周期相对比较短。它的不足之处是：需要昂贵精密的设备；显微注射操作复杂，需专门技术人员；导入外源基因整合位点和拷贝数无法控制；常导致插入位点附近宿主DNA 片段缺失、重组等突变，可造成动物严重的生理缺陷。尽管如此，由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，因而仍是目前建立转基因动物极为重要的方法。
显微注射技术在植物、动物的细胞发育研究的应用，为研究体内生理和体外的生化过程架起桥梁，将特定的分子探针及衍生的细胞间质成分导入活体细胞，为研究控制细胞功能的调控机制提供了新的视野。
（一） 仪器和用具：
倒置显微镜（如Nikon TMS 和Diaphot 300/2；Zeiss Axiovert 100或135，或Axioskop FS）； Leitz重型基座（用于安放显微镜和微操作仪）；
微操作仪：Leitz（手动系统，安在平台上）或Eppendorf 5171（自动轴向微注射系统，可固定在显微镜的载物台上）；
微注射器：Eppendorf 5242，也可选用螺旋推柄的玻璃注射器。
拉针仪：水平拉针仪P87型（如Sutter Instrument Co.(Novato,USA)），或垂直拉针仪720型（如David Kopf Instruments(Tujunga,California,USA)。
玻璃注射针头：可购买厂商拉制好的商品，也可用拉针仪自行拉制（可参照[方法与步骤]中的1.1注射针头的拉制）。
细胞培养设备：细胞培养箱、超净工作台、塑料平皿和盖玻片等。
（二） 材料：
（三） 试剂：
缓冲培养基（含25mmol/L HEPES pH7.2）；注射缓冲液（10mmol/L H2PO4-和HPO42-，pH7.2，84mmol/L K+，17mmol/L Na+，1mmol/L EDTA
1． 材料准备
1.1 注射针头的拉制
水平拉针仪：装上一根毛细管，拧紧左右两侧的夹子，做好固定，并使其中间部位对准加热丝。设定好电流、拉力和时间。然后按开始键，等待毛细管被拉成两个所需的微注射针头。 垂直拉针仪：把玻璃毛细管固定在上面的夹子上，使其对准加热丝后旋紧。抬起下面的滑夹，固定在毛细管上。调整热度和螺线管范围。
使用拉针仪自行拉制的微注射针头，最好使用硼硅酸盐玻璃的毛细管。可以采用硅烷对注射针头进行处理，以防样品和培养基成分与玻璃的亲水表面相互作用，从而引起针尖阻塞而影响注射。
1.2 盖玻片的处理
1 把盖玻片放在陶瓷或金属架上，相互不要接触。
2 在装有自来水的烧杯中，快速浸泡和冲洗。
3 在纸巾上把架子控干，再放入盛有0.1mol/L HCl的烧杯中，温育过夜。
4 用自来水冲洗盖玻片，每次10min，共5次。
5 把架子浸入70%的乙醇中，温育60min。
6 用去离子水短暂冲洗，放在纸巾上控干。
7 在室温下自然干燥30min。
8 在220～250℃烤6 h。
1.3 显微注射用细胞的准备
1 在注射前一天，把细胞铺到直径为10～15mm的盖玻片上，每个盖玻片250～1000个细胞。
2 在注射前，把带有需要注射细胞的盖玻片转移至新的组织培养皿中，迅速用金刚石笔在盖玻片上划一个十字或一个圆圈标记（金刚石笔使用前用70%乙醇冲洗，并在超净台中用火焰烧一下），然后加入3ml有缓冲液的培养基。
2．显微注射操作过程
2.1 针头装液
1 使用无菌的微量加样器从微注射针头的后部加入0.5～1μl的注射样品。
2 使用玻璃毛细管拉出毛细管针头，里面有与毛细管平行的细丝，有利于液体从后部向针头方向运动。只需在针头后部浸入1mm深度，不需使用手指或其他东西接触，就足以使少量的样品到达针尖部。
2.2 针头定位
1 将装液后的针头的游离端安在连接器上，然后旋紧连接器以固定针头，再将其固定到微操作仪的托针管上。
2 把载有待注射细胞的盖玻片转移到里面有缓冲培养基的平皿中，将其放在中央。
3 将培养皿放在显微镜载物台上，尽量将盖玻片上所画圆圈的一个对准光照的中心区，这时光的亮度最好。
4 用低倍物镜对准细胞调焦。
5 将针头推入视野中心，在视野中针头呈阴影状。
6 轻轻的落下针头，直至到达培养基中后停下。
7 通过显微镜观察，移动针头，必要时调整微操作仪，直到针头的阴影在视野的上方。然后确定针头的位置，使其约处在视野中心。
8 轻轻下调针头，直到针头变得清晰一些
2． 调到工作放大倍数，调准细胞焦距，找到针尖。
3． 如果找不到，重新使用低倍镜，尽量将针头调到视野的中心，重复上述的步骤。 10 小心下调针尖，直到其完全聚焦。
1.3 显微注射的操作
2.3.1 手动细胞核内注射
1 使用最低放大倍数（50×），把焦距对准位于盖玻片上注射标记区域的细胞平面上。用肉眼将注射针头对准到照度最亮处的中心，降下针头，直到进入培养基。把针头调入到视野的中心，轻轻放下针头，直到看清楚为止。然后将放大倍数调至工作倍数，即320×，对准细胞表面调焦。将针头调整到中心，下降针头，对准焦距。移动显微镜载物台，使针尖对准细胞核或核周的胞质。
2 小心落下针尖，使其进入细胞核或核周的胞质。
3 使用注射器施加注射压
4 轻轻上提针头，直到离开细胞。
5 移动显微镜载物台，找到下一个细胞，重复2～4步骤。
2.3.2 自动细胞核内注射和细胞质内注射
1 按上述手动系统的方法将针头调整至视野中间，不同的是通过控制面板自动控制微操作部分。
2 工作放大倍数为320×，下降针头，使之触及细胞核或核周间隙上方的细胞表面，直到细胞表面见到一个轻微的压迹。
3 通过控制部分，设定细胞核内或细胞质内注射的定位参数。
4 将针头略提起，离开细胞表面几微米，选择一个新细胞，按下操纵杆上方的按钮进行微注射。针头首先在水平面上做逆向轨迹运动，然后朝向细胞做出一个迅速的轴向运动，正好刺入细胞内预先设定好的坐标位置，这时微操作仪的控制部分，激活注射压力，持续时间已经预先设定好。针头回到原来的位置。
5 在必要的情况下，可以在控制面板上修正各种参数，因为盖玻片和平皿的表面不是十分平整，所以当从盖玻片的一个地方移动到另一个地方进行注射时，一定要重新调整细胞核内或细胞质的坐标。
3 对注射了荧光标记物的细胞的分析
荧光标记物，如FITC-葡聚糖等常用来作注射用标记物，以分辨出已经注射的细胞。浓度为0.25%～1%时，这种物质的毒性很小，而且在细胞增殖的2～4天仍可见。
3.1 在PBS中轻轻冲洗注射过的细胞两次。
3.2 用甲醇（2min）或PFA/GA（5min）快速固定
3.3 用去离子水快速冲洗盖玻片。
3.4 滴一滴Mowiol，将盖玻片装到载玻片上。
显微注射 注意事项
[注意事项]
1 在整个过程中，注射针尖应远离人员和实验室中的仪器。注射针在持针器上安装不牢时，注射器、管子及注射针内的压力，可能将注射针射出。
2 在反向充填液体时，适当地在显微镜下观察注射针尖，以决定在加压时是否注射针阻塞或偏斜。阻塞通常可通过将针尖轻轻敲击一个固定物而得以缓解。针尖偏斜的注射针是适合于显微注射的，但其使用应做细微调整或补偿注射中加压所造成的额外偏斜。
3 注射速度过快能扰乱细胞质成分，细胞裂解或细胞从底层移位。当注射体积小于估计的细胞体积的50%，并且注射样品的流动速度几乎不导致可见的细胞质移位时，注射效果最好。 4 用紫外光可看到注入标记物后的活细胞，但会对细胞造成不可恢复的损伤，因此应尽可能缩短紫外光照射时间。
5 如果对已经注射的细胞进行免疫荧光测定或其他处理，最好使用可固定的葡聚糖，以防在冲洗中造成标记物的扩散损失。
【注 意 事 项】
1．最优组分依使用的特定细胞种类而有明显的变化。如果努力优化电压和脉冲宽度电穿孔结果仍不令人满意，就应尝试改变穿孔介质。
2．影响电穿孔/电融合的另一重要因素与细胞状态有关，为达到最高效率，必须收集对数生长中期的细胞。
转基因小鼠制备实验方法
1、 选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。
2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。
3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。 4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。
5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。
6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。
7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。
8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。
9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。
10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。
(一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)
受体细胞DNA中，HSV-tk+基因产物可使GANC转变成一种有毒物质使细胞死亡
。如果发生同源重组，由于tk基因在同源区之外不能整合，neor基因在同源区之内得以保留，这样受体细胞抗G418有正选择作用，对GANC无转变功能而有负选择作用，因此认为存活的细胞是与导入基因发生同源重组的（图23-3）。Plump等（1992）用基因剔除技术已培育出缺ApoE基因的TGM模型，并利用这一AS小鼠模型研究了饮食和遗传因素对AS的影响。
图 23-3 正负双向选择法示意图
a：同源重组；b：随机整合；neor：新霉素抗性基因；HSV-tkc：疱
疹病毒胸苷激酶基因；GeneX：干细胞内源基因（与导入基因同源）；
G418：新霉素；GANC：抗致死的核苷类似物GANC；GANC：核苷类似
物参与合成，细胞致死。
近几来，随着对基因失活方面研究的深入，引发了基因剔除技术的一大飞跃，产生了条件性基因剔除（conditional gene knockout）。条件性基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。目前多采用Cre-loxP重组系统（Cre-loxP-mediated gene replacement ,Cre-loxP recombination system）。其中Cre重组酶来源于
侵染大肠杆菌P1噬菌体。分子量38000，无论在大肠杆菌体内或体外，它都能启动
DNA分子间或分子内的联合与重组，重组发生在一个被称为loxP的特异位点（loxp site），且不需要其他的蛋白质因子。在Cre酶存在时，两个loxP位点可以同源重组，切除其中间的部分，留下一个loxP位点。其原理如图23-4所示。研究发现，在哺乳动物细胞中Cre重组酶也同样能引起DNA联合和位点特异性重组。
图23-4 Cre酶作用原理
1Cre基因转译成Cre酶；2Cre酶作用于基因组上loxP位点；3Cre酶使两个loxP位点联合；4两个loxP位点发生同源重组切除X基因及一个loxP位点而仅留下一个loxP位点。
Cu等（1994）在鼠的ES细胞中利用Cre-loxP重组系统进行条件性基因剔除的程序如下：①用常规性基因剔除方法将一段新构建的DNA序列整合至内源基因组，这段新构建的DNA序列由新的（突变的）基因片段，选择性标记基因HSV-tk及neor、一个将被取代的正常基因片段等几部分组成。在此新构建的NDA序列中，在可选择性标记基因和正常基因片段的两侧都连有loxP位点；②经过基因剔除的ES细胞被一个编码Cre重组酶载体迅速传染，因此处于两个loxP位点之间的HSV-tk、neor及正常的野生型基因均在Cre酶的作用
下而被切除，只在原来的位置上留下了突变的基因和其3’端带有一个loxP位点，其Cre-loxP重组系统进行条件性基因剔除程序如图23-5所示。 条件性基因剔除系统的建立，使得转基因的目的
加明确，效果也进一步精确可靠，是基因剔除方法上的一个重大突破，将给动脉粥样硬化的研究增加更便利的条件。
图23-5 Cre loxP重组系统进行条件性基因剔除程序
1有待于被剔除的基因组上某野生型基因片段；2将一个loxP位点插在野生型基因片段的3’端；3将新构建的DNA序列整合到基因组上；4在Cre酶的作用下切除HSV-tk、neor野生型基因及一个loxP位点；5经过Cre-loxP重组系统作用后所形成的DNA序列。
广义的转基因动物是指通过实验手段将新的遗传物质导入到动物胚细胞中，并能稳定遗传，由此获得的动物称为转基因动物。转基因动物可通过插入目的基因用于过表达基因研究，或是通过插入目的基因的
shRNA来降低目的基因的本底表达，也可通过同源重组的方法获得基因Knock-in 和Knock-out小鼠。
小鼠作为最优秀的实验动物模型，在转基因动物研究领域也同样得到了广泛验证。转基因小鼠的制备技术主要有两类，DNA原核显微注射法和胚胎干细胞囊胚显微注射法。
DNA原核显微注射法
通过显微操作仪将外源基因直接注入受精卵，使外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。此方法是最经典的用于制作转基因动物的方法，也是目前应用最广泛的方法，现在的转基因动物研究大都是在Palmiter等方法的基础上有所改进而进行的。由这种方法制备的动物品种属于狭义的转基因动物的范畴。
由这种方法制备的转基因小鼠其插入目的基因的形式通常是多拷贝首尾相连的形
式，其整合到基因组的具体机制目前并没有完全研究清楚。
胚胎干细胞囊胚显微注射法
是在体外将外源基因导入胚胎干细胞；然后将转基因的胚胎干细胞通过显微操作仪注入动物囊胚，此胚胎干细胞可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合。胚胎干细胞体外培养时保持未分化状态，当被注入囊胚腔后，可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成，因此将外源DNA导入胚胎干细胞就可实现基因的转移。出生的动物其生殖系统就可能整合上外源基因，通过杂交繁育可得到具有纯合目的基因的个体，即转基因动物。目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。基因的敲除及捕获常用这类方法。
注：转基因小鼠制备技术路线，此图片由赛业（广州）生物科技有限公司提供
显微操作技术（MicromanipulationTechnique）是指在高倍倒置显微镜下，利用显微操作器（Micromanipulator），控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置，用来进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。
操作方法
目前，以细胞内微注射和微灌注技术为基础的玻璃针头(GlassNeedle，精细的玻璃微量毛细移液管)的使用，已经在越来越多的实验生物学研究领域中成为一项非常普遍的操作方法，比如在体外受精、转基因中等等。描述这些技术最恰当的话应当称其为---显微操作，因为这些操作是通过单个的或多个的筒状玻璃微量移液管、精确的定位装置（显微操作器）以及微量注射器或微量灌注器来在单个的细胞上进行的。
显微技术的分类
显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等，例如多莉羊就是运用细胞核移植技术而成功的；而转基因技术指的是将外源基因导入体细胞并能稳定的嵌入宿主动物的生殖细胞染色体中的一门技术，基因转殖动物被定义为由人为的方式将外源基因引入体内而引起基因改变的动物，并可将遗传特质传递到接续的每一世代中。 概述
微注射应用的范围非常广泛，从辅助（体外）细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运都需使用这一技术，比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和/或监测某种特定的存活细胞中的基本机体生物化学状态。这些可以注射进细胞的物质包括有：各种细胞器、激酶、组织化学标志物（比如辣根过氧化物酶或者荧光黄）、蛋白质、代谢物质、微磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的mRNA和DNA等等。运用这一技术，也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量（皮升至毫升）药剂或药物的精确输送（微灌注），例如药理学的药物检验。转基因动物的制作，可以利用基因微注射（gene microinjection）、胚干细胞（embryonic stem cells,ES cells）、精子载体（sperm vector）、反转录病毒感染（retroviral vectorinfection）及体细胞核移置（somatic cell nucleartransfer）等方法达成，其中显微注射为目前应用最普遍之方法之一。
显微注射
显微注射法（microinjection）是利用管尖极细（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射针，将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中，然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组（rearrangement）、缺失
（deletion）、复制（duplication）或易位（translocation）等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内。这种显微注射术的程序，需有相当精密
的显微操作设备，制造长管尖时，需用微量吸管拉长器
（micropipettepuller），注射时需有固定管尖位置的微量操作器。这种技术的长处为任何DNA在原则上均可传入任何种类的细胞内。此法已成功运用于包括小鼠、鱼、大鼠、兔子及许多大型家畜，如牛、羊、猪等基因转殖动物。
显微注射的优缺点
以显微注射法转外源基因没有长度上的限制，目前已证明数百kb之DNA片段均可以成功产制出转基因动物。其缺点是设备精密而昂贵、操作技术需要长时间的练习，以及每次只能注射有限的细胞。这些操作中所使用的微量移液管是用毛细管拉针器(pipettepuller)来制作的，先将玻璃毛细管加热到其熔化的温度，再将其拉制成所需的合适大小的直径和锥形，微量移液管小头的直径（小至0.2微米）与纤维操纵器的高精度相关，它可以用于精准的移液。这种精确度可以为各种类型和任意大小的细胞提供亚皮克升级或0.1微米(micron)范围内的精确的、重复性良好的细胞内和细胞旁注射。通过运用直接的水压（压力注射）或者不通过使用水流，而通过施加一电场来使带电离子运动（离子电渗法），都可以获得将微量移液管中的物质挤喷出去的效果。
常用生产转基因动物的方式
目前最常用来生产转基因动物的方式为：直接把重组过的 DNA 注入受精卵的原核(pronuleus) 中，将从胚胎提供者的输卵管中取得的授精卵移到倒置显微镜上的微量注射台上，然后利用固定吸量管 (holdingpipette) 固定住，之后注射针则依序穿过 zona pellucida，ocyte membrane 及malepronuleus membrane后，将DNA注入，注入时可以见到原核膨大。以小鼠受精卵雄原核的显微注射为例，显微注射所使用的受精卵固定吸管（holdingpipette）及注射针（injectionneedle）制备很困难，除影响操作时间外，也是影响转基因效率及基因注入后之胚胎存活及转基因成功与否极其重要的因子。固定吸管之内、外径分别为30、80μm是较为合适的，显微注射针自针尖起20μm处的外径为4μm时，可获得良好的转染效率。固定吸管的内径如果太小，会导致吸力不足，对受精卵操控不易；如太大，则受精卵易受伤害，影响胚胎的存活率。显微注射针尖如果太粗，则导致插入透明带及原核的阻力增加，且DNA流量过多，受精卵易于裂解；太细则导致针内DNA流出速率过慢，且易阻塞，而使DNA无法顺利流入原核内，影响注射效率。因此进行受精卵雄原核的显微注射时，如何制备适用固定受精卵的吸管及显微注射针是关乎转基因效率极其重要的因素。
显微注射实验操作
（1）导入DNA的制备：显微注射首先涉及导入DNA的制备，显微注射的转入基因通常为去除载体序列的线状DNA，转基因所用载体是真核表达载体，即含有在哺乳动物细胞内表达的真核启动子。所谓组织特异性的实现多是通过组织特异性启动子来实现组织特异性表达的。制备转基因小鼠，必须对待导入DNA进行分离纯化。实验必须用经过琼脂糖电泳鉴定并确定其纯度的DNA，对导入基因的大小没有特别的限制，长链DNA也可成功。 实验中注意防止一些杂质堵塞注射针，如琼脂糖颗粒、纤维物质等，需尽量超速离心除去。
DNA的注射质量是实验成功的关键。研究表明DNA注射的起始浓度大约在1ng/ml，当DNA注射浓度超过一定上限时，实验效果不佳，而且大于5 ng/ml会产生明显的毒性作用。
导入DNA的制备程序如下：
1） 通过在Tris/acetate/EDTA缓冲液中进行琼脂糖凝胶电泳从载体中分离待插入DNA，用5mg/ml溴乙啶染色。
2） 为防止对插入DNA的溴乙啶的破坏，用长波紫外光显影。
3） 切下目的基因所在凝胶片，电泳制备目的DNA，或用Qiaex凝胶抽提试剂盒进行抽提。
4） 乙醇沉淀目的DNA。在样品中加入1/10体积的3M乙酸钠，混匀，再加入2-2.5倍体积无菌100%乙醇进行沉淀。
5） -200C 孵育过夜后，超速离心机10000转/分，离心5分，收集沉淀，重悬沉淀于Elutip缓冲液。
6） 用Elutip-D微型柱对目的DNA过柱处理。
7） 按照步骤4重新沉淀DNA，用70%乙醇漂洗沉淀2-3次，真空干燥沉淀。清洗与干燥过程极其重要，因为残余的盐和乙醇对受精卵的发育是致命的。
8） 注射缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl/0.1 mmol/L EDTA, pH 7.5）重悬沉淀，缓冲液必须是Milli-Q纯化水配制
9） 通过荧光光度计或凝胶电泳比色法评估目的DNA的浓度
10） 用注射缓冲液调整目的DNA的浓度在5-10ng/?l.
（2） 器械准备
[注射针的制作]
注射针是内含玻璃细丝的薄壁毛细吸管，它可以通过毛细管虹吸作用进行载样。用拉针仪（SUTTER,P2000 laser based micropipette puller,具体操作程序详见产品说明书）可以把注射针水平或垂直扯下来。必须保证制备的毛细管可以进入拉针仪这样加热组件大约在毛细管的中央位置。一般用内径为1.0mm的微电极管为材料制作注射针,微电极管可以买到,它与拉针仪是匹配的。另外，应该对拉针仪的设置进行选择，使细丝温度和扯拉力度(主拉力和次拉力)将处于最佳状态。具体需要预实验来确定其最佳设置。待用注射针应该用蒸馏水严格清洗以除去残留炭化物颗粒。严格的实验微电极管在使用前应经过泡酸、泡蒸馏水和硅化的程序,但有人省略了此步也有较好的结果,经拉针仪拉针后就没法清洗,好的拉针仪是不会残留炭化物颗粒,若拉成后清洗其针尖很容易断掉,可用Narishige Japan model PN-30。
[持卵管制作]
为避免机械损伤，持卵管口应该是钝性末端而且其孔隙有限，使受精卵轻轻依附在负压管道中。这种高度密实可抵抗密封系统的破损，而密封可以减少受精卵注射时的旋转运动。持卵管的口部应该光滑，平整及与其长轴垂直。具体制备操作：双手执毛细玻璃管的两端，将管的中部置酒精灯外焰烧红至变软后离开火焰，同时双手外伸，将烧软的部分拉细。用玻璃刀或细沙轮小心将细管切开，在镜下观察切口应平齐(如不平齐，应重新切割)。然后于酒精灯火焰底部的蓝焰边缘处将切口钝化处理(即将管口于蓝焰边缘处做短暂灼烧，然后于显微镜下检查管口形状，如此反复，直至满意)。如实验室配有持卵管制作仪，则可在显微镜下直接监视热灯丝对持卵管管口灼烧后的形状，及时调整二者之间的相对位置，更易得到满意的持卵管。持卵管应该做调整，用熔断仪将其打弯使其末端成15度(不同的显微注射仪度数可能有差异,打弯成25度左右,一般为20-25度)轻微弯曲以方便使用。此持卵管为不含细丝的玻璃，显微镜下用含刻度目镜确定持卵管的外径应该为100-140?m。持卵管的内径很重要,可用铂金灯丝灼烧管口,使其内径为30-50?m左右,内径要能吸住受精卵,而又不把卵吸入管内。为便于操作，持卵管可进一步调整使其末端轻微弯曲（15度）。
[洗卵管制作]
1） 点燃酒精灯，调节火焰到最佳。捏持玻璃毛细吸管或巴氏移液管在火焰上焰旋转过火。
2） 当吸管开始变软，快速撤离火焰，向外急剧扯拉使吸管变长，形成口径大约200?l的吸管。注意制备过程中离开火焰的时间以及扯拉的力度，尽量保证制备吸管的一致性。
3） 为吸管评分，轻柔地折断吸管，辨别其声音是否清脆，或扯拉吸管或只做弯曲直到两根同分数的吸管断裂为止。
4） 解剖镜下(要在熔断仪上)检查吸管，并对其进行调整，确定其口径以及管口光滑平整。
[移卵管的制作]
用于转移注射后受精卵到假孕鼠体内的吸管制作过程同上洗卵管。不同的是，这些吸管的口径稍微小一些，大约150?m(150-160?m)，直径比单受精卵的口径略大一些，将促使卵细胞精细的充满移卵管并转移到输卵管。移卵管在打磨过程中要求管口更光滑平整以减轻插入输卵管时对输卵管的损伤，同时必须注意移卵管头在火焰上时间不可太长，防止融化堵塞。管口要平且要钝化。
[凹玻片的准备]
必须准备适合承载用于微注射的受精卵的凹玻片做微注射槽，也可用培养皿做注射槽，载玻片上的受精卵应该浸润在pH缓冲工作液中，如M2溶液，使受精卵在孵箱外保持30-40分能受到保护。具体凹玻片的准备程序如下：
1） 在超净台内利用手动移液器将M2溶液加入凹玻片窝的基底部形成直径大约0.6cm液面，液滴的液面要水平平整，避免液体的折射效应。吸取胚胎实验用矿物油于M2溶液上，矿物油的量以刚刚达M2溶液最高液面为宜，将凹玻片置于倒置显微镜的载物台上，在低倍镜下调节焦距，使M2溶液液滴的底面清楚为止。
2） 覆盖矿物油的作用：防止液滴脱水以及浓缩；使受精卵处于无菌状态； 固定M2溶液液滴。
3） 从孵箱中取出受精卵，用移卵管吸出受精卵并用M2溶液洗涤2-3次，调整实验用量，将其置于凹玻片的M2溶液中，调焦使在低倍镜下清楚地看到受精卵的轮廓，并且保证受精卵有足够空间自由移动，用持卵器将卵汇聚到一起，移卵时注意不要将气泡移入，影响操作视野。
[显微注射设备]
显微注射仪的基本工作原理是运用立体倒置相差显微镜进行观察监测，显微镜两侧各置一台显微操作仪，一侧接持卵管，另一侧接注射针，可调节持卵管或注射针的空间位置。持卵管通过塑料管连接一个装满矿物油的带微调的注射器，通过调节压力控制卵的运动。注射针通过塑料管连接有压力泵的注射仪。将注射时间与压力固定后，进行注射操作。操作系统有LEICA AS TP基因转殖操作系统（major instruments.co.Ltd）等，具体操作程序按其说明书严格进行。
（3）注射针内DNA的装载
把注射针的钝性头浸在盛待注射DNA的管中，溶液通过毛细吸管的虹吸作用进入注射针。注射针的末端应该一直留在DNA溶液中直到注射针末端有小泡形成。这说明DNA溶液装载完毕。仔细检查注射针针头末端，距其几毫米处可见一个小凹液面。最后可将载满DNA溶液的吸管装在持针器或固定在器械环中待用。
（4）受精卵的显微注射
受精卵的显微注射过程相对简单，制作大量样品过程中，为保证显微注射量的一致性，必须通过大量反复有效的练习才可以成功。
1） 置凹玻片于显微镜下，低倍聚焦。
2） 调节持卵管，注射针与受精卵在同一视野下后，转换到高倍镜（32X）下时位置稍微低于受精卵，以便自如地操作受精卵。
3） 挨近注射针到工作液或油界边缘，稍微进入油界。在注射前，增加注射针的压力可见DNA溶液泡在油内形成囊状，以此确定DNA溶液流存在。
4） 如果未见DNA溶液流，则轻轻摩擦持样器钝缘，渐渐的打开注射器针头。针头重新进入油内确定DNA溶液流的存在。
5） 移动持卵管回到受精卵下部。通过微分驱动水压控制系统使持卵管内产生温和的负压，并使持卵管末端吸住受精卵。此操作必须确保受精卵基底部与凹玻片基底部轻轻接触。注意不宜吸得过紧，否则会使卵变形，甚至会将卵吸人持卵器内。
6） 对持卵管内真空进行缓慢调节，使持卵管内受精卵轻柔地旋转，使卵内原核位于持卵管口的远侧端。
7） 维持持卵管稳定，使注射针的针头紧靠受精卵的透明带，进行调节并使针与原核处于同一平面上。用注射针依次刺破透明带，细胞外膜，前核核膜，进入核膜内，受精卵的透明带易被针尖刺破，前核核膜相当有弹性，应用不同的方法进行尝试突破此结构。操作时避免与核接触损伤核仁。
8） 保持注射针位置固定，轻轻增加压力使DNA溶液流入前核中。注射过程中可能出现的现象如下：
① 注射后原核将膨大到原来的两倍左右，表明注射成功，然后直接抽出注射针。 ② 一气泡出现在注射针尖端，透明带可能膨胀，表明受精卵的膜非常艰固，没有被刺破，此时需继续向内进针，直到尖端进入核，同时要小心注射针尖端极易破损。
③ 注射针压力较大，看不到任何现象，可能是注射针堵塞，需换针或更换DNA溶液。
④ 若见胞质颗粒涌出到卵黄周围空间，说明受精卵破裂。注射过程中，发现卵破裂数目较多，则需更换注射针。一支注射针一般可注射5—10枚卵。
9） 用持卵器移动受精卵到凹玻片凹内相对隔离的位置，以区分注射组与非注射组。重新安装持卵管并进行下一组操作。
5．受精卵的输卵管转移
（1）受精卵的输卵管注射
1）将麻醉小鼠放置于一塑料平皿盖上，固定小鼠牙齿于皿缘以确保小鼠气道通畅。用70%乙醇涂搽切口部位。也可预先在手术部位剔除毛发。
2）将受精卵从培养液转移至工作液内。因受精卵在转移过程中在孵箱外操作，所以应该将其从培养基中移到工作液中。
4） 用移卵管装载受精卵。移卵管的正确装载对输卵管转移的成功非常重要。如图11-1所示，吸取一定量的工作液在移卵管尖端，然后吸取些许空气制成一个小气泡。再吸取与气泡体积大约相当的工作液，紧接着在吸取另外一个小气泡。收集受精卵于尽可能小容积的工作液中，将其线形排列于移卵管中。当所有的卵被负载后，再吸取小量气体制成小气泡，接着吸取最终容量的工作液。气泡将有利于对压力进行调节，更容易使卵移动。
5） 手术暴露输卵管复合体。如图所示，在离中线约0.5厘米、背驼峰与后腿髋关节之间作横行切口。仔细用浸70%乙醇涂搽切口部位，并搽去毛发。捏住一侧切口皮肤，钝性分离皮下组织。移动皮肤直到腹壁神经走行清晰可见。这时可看到腹壁下红色卵巢或浅色卵巢脂肪垫。用眼科镊捏住腹壁，并作约0.5厘米横行切口，钝性分离组织，轻轻移出脂肪垫、卵巢、输卵管以及子宫。用弹簧夹夹住脂肪垫并保持子宫在适当位置。若子宫及子宫角频繁滑回腹腔，在保证气道通畅的前提下，可适当重新布置其位置。
6） 轻轻移动塑料平皿，使小鼠位于解剖显微镜下，适当调节显微镜及小鼠位置使其输卵管卷曲部清晰可见。
7） 用眼科镊于漏斗部透明囊膜处钝性撕开小口，并防止撕裂血管，引起出血。必要是撕裂口部位局部应用肾上腺素以减少出血，并用纱布擦拭保持操作视野干净。
8） 一旦漏斗部清晰可见，用镊子夹持其边缘并充分暴露漏斗管口。在避免壶腹损伤的前提下，尽可能插入移卵管。
9） 在压力可调节的前提下，轻轻把卵吸吹进入漏斗部。气泡可以阻止卵回流而且很容易使卵进入输卵管漏斗管。若吹卵的压力太大，那么移卵管口可能抵在输卵管壁上，这时可稍微后撤移卵管再进行操作，也可能由于血块堵塞移卵管，若这样，则应该吹出细胞在培养皿中，重新吸卵。
10） 移卵操作完成后，撤回移卵管，去除器械，按原本位置将各器官重置于腹腔内。
10）缝合切口，用小夹夹持皮肤。常用自动小夹代替缝线，这样可以避免小鼠啃嘶缝线，切口裂开。
11）若进行双侧手术，则于另一侧子宫角重复上述操作。
12）手术完成后，安置小鼠于清洁的笼中。麻醉状态下，小型哺乳动物无法有效维持机体温度。所以应该注意小鼠的保温。可以用热垫保持其温度直到动物苏醒。所有的动物在回笼前20-30分可苏醒。由于妊娠很容易使受体母鼠产生应激反应导致流产或食子，所以对受体母鼠必须严格监护。
（2）注射后期监护：手术后严格监护防止并发症的发生非常重要。麻醉易诱导小鼠出现血压升高，所以手术后必须严密监护至少2小时，同时推荐进行保温处理。
处于麻醉状态的小鼠应该用软纱布包裹，而且笼中加垫草垫以及软材料，并保持鼠笼温度。正常体温的维持可以缩短动物处于麻醉状态的时间。
手术后小鼠常规4-5天观察一次以确保小鼠处于恢复中，清醒小鼠应活动自如。腹腔手术后小鼠有发生肠疝的可能。所以手术时保持切口尽量小，缝合严密，而组织胶水的正确应用可以避免此类并发症的发生。皮肤必须用缝线或不锈刚夹夹闭，手术后1-2周可拔除。如果动物状态不良，表现厌食，脱水，或明显弓背，通过动物饮水可给予羟苯基乙酰胺以及同类止疼药。若发生脱水，可腹腔注射0.9%生理盐水或林格氏液。若仍无改善可在麻醉状态下重新打开手切口确认是否有疝发生。若动物状态无明显好转，最终采用安乐死进行。
[实验原理]
显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制, 可达100kb ；实验周期相对比较短。它的不足之处是：需要昂贵精密的设备；显微注射操作复杂，需专门技术人员；导入外源基因整合位点和拷贝数无法控制；常导致插入位点附近宿主DNA 片段缺失、重组等突变，可造成动物严重的生理缺陷。尽管如此，由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，因而仍是目前建立转基因动物极为重要的方法。
显微注射技术在植物、动物的细胞发育研究的应用，为研究体内生理和体外的生化过程架起桥梁，将特定的分子探针及衍生的细胞间质成分导入活体细胞，为研究控制细胞功能的调控机制提供了新的视野。
（一） 仪器和用具：
倒置显微镜（如Nikon TMS 和Diaphot 300/2；Zeiss Axiovert 100或135，或Axioskop FS）； Leitz重型基座（用于安放显微镜和微操作仪）；
微操作仪：Leitz（手动系统，安在平台上）或Eppendorf 5171（自动轴向微注射系统，可固定在显微镜的载物台上）；
微注射器：Eppendorf 5242，也可选用螺旋推柄的玻璃注射器。
拉针仪：水平拉针仪P87型（如Sutter Instrument Co.(Novato,USA)），或垂直拉针仪720型（如David Kopf Instruments(Tujunga,California,USA)。
玻璃注射针头：可购买厂商拉制好的商品，也可用拉针仪自行拉制（可参照[方法与步骤]中的1.1注射针头的拉制）。
细胞培养设备：细胞培养箱、超净工作台、塑料平皿和盖玻片等。
（二） 材料：
（三） 试剂：
缓冲培养基（含25mmol/L HEPES pH7.2）；注射缓冲液（10mmol/L H2PO4-和HPO42-，pH7.2，84mmol/L K+，17mmol/L Na+，1mmol/L EDTA
1． 材料准备
1.1 注射针头的拉制
水平拉针仪：装上一根毛细管，拧紧左右两侧的夹子，做好固定，并使其中间部位对准加热丝。设定好电流、拉力和时间。然后按开始键，等待毛细管被拉成两个所需的微注射针头。 垂直拉针仪：把玻璃毛细管固定在上面的夹子上，使其对准加热丝后旋紧。抬起下面的滑夹，固定在毛细管上。调整热度和螺线管范围。
使用拉针仪自行拉制的微注射针头，最好使用硼硅酸盐玻璃的毛细管。可以采用硅烷对注射针头进行处理，以防样品和培养基成分与玻璃的亲水表面相互作用，从而引起针尖阻塞而影响注射。
1.2 盖玻片的处理
1 把盖玻片放在陶瓷或金属架上，相互不要接触。
2 在装有自来水的烧杯中，快速浸泡和冲洗。
3 在纸巾上把架子控干，再放入盛有0.1mol/L HCl的烧杯中，温育过夜。
4 用自来水冲洗盖玻片，每次10min，共5次。
5 把架子浸入70%的乙醇中，温育60min。
6 用去离子水短暂冲洗，放在纸巾上控干。
7 在室温下自然干燥30min。
8 在220～250℃烤6 h。
1.3 显微注射用细胞的准备
1 在注射前一天，把细胞铺到直径为10～15mm的盖玻片上，每个盖玻片250～1000个细胞。
2 在注射前，把带有需要注射细胞的盖玻片转移至新的组织培养皿中，迅速用金刚石笔在盖玻片上划一个十字或一个圆圈标记（金刚石笔使用前用70%乙醇冲洗，并在超净台中用火焰烧一下），然后加入3ml有缓冲液的培养基。
2．显微注射操作过程
2.1 针头装液
1 使用无菌的微量加样器从微注射针头的后部加入0.5～1μl的注射样品。
2 使用玻璃毛细管拉出毛细管针头，里面有与毛细管平行的细丝，有利于液体从后部向针头方向运动。只需在针头后部浸入1mm深度，不需使用手指或其他东西接触，就足以使少量的样品到达针尖部。
2.2 针头定位
1 将装液后的针头的游离端安在连接器上，然后旋紧连接器以固定针头，再将其固定到微操作仪的托针管上。
2 把载有待注射细胞的盖玻片转移到里面有缓冲培养基的平皿中，将其放在中央。
3 将培养皿放在显微镜载物台上，尽量将盖玻片上所画圆圈的一个对准光照的中心区，这时光的亮度最好。
4 用低倍物镜对准细胞调焦。
5 将针头推入视野中心，在视野中针头呈阴影状。
6 轻轻的落下针头，直至到达培养基中后停下。
7 通过显微镜观察，移动针头，必要时调整微操作仪，直到针头的阴影在视野的上方。然后确定针头的位置，使其约处在视野中心。
8 轻轻下调针头，直到针头变得清晰一些
2． 调到工作放大倍数，调准细胞焦距，找到针尖。
3． 如果找不到，重新使用低倍镜，尽量将针头调到视野的中心，重复上述的步骤。 10 小心下调针尖，直到其完全聚焦。
1.3 显微注射的操作
2.3.1 手动细胞核内注射
1 使用最低放大倍数（50×），把焦距对准位于盖玻片上注射标记区域的细胞平面上。用肉眼将注射针头对准到照度最亮处的中心，降下针头，直到进入培养基。把针头调入到视野的中心，轻轻放下针头，直到看清楚为止。然后将放大倍数调至工作倍数，即320×，对准细胞表面调焦。将针头调整到中心，下降针头，对准焦距。移动显微镜载物台，使针尖对准细胞核或核周的胞质。
2 小心落下针尖，使其进入细胞核或核周的胞质。
3 使用注射器施加注射压
4 轻轻上提针头，直到离开细胞。
5 移动显微镜载物台，找到下一个细胞，重复2～4步骤。
2.3.2 自动细胞核内注射和细胞质内注射
1 按上述手动系统的方法将针头调整至视野中间，不同的是通过控制面板自动控制微操作部分。
2 工作放大倍数为320×，下降针头，使之触及细胞核或核周间隙上方的细胞表面，直到细胞表面见到一个轻微的压迹。
3 通过控制部分，设定细胞核内或细胞质内注射的定位参数。
4 将针头略提起，离开细胞表面几微米，选择一个新细胞，按下操纵杆上方的按钮进行微注射。针头首先在水平面上做逆向轨迹运动，然后朝向细胞做出一个迅速的轴向运动，正好刺入细胞内预先设定好的坐标位置，这时微操作仪的控制部分，激活注射压力，持续时间已经预先设定好。针头回到原来的位置。
5 在必要的情况下，可以在控制面板上修正各种参数，因为盖玻片和平皿的表面不是十分平整，所以当从盖玻片的一个地方移动到另一个地方进行注射时，一定要重新调整细胞核内或细胞质的坐标。
3 对注射了荧光标记物的细胞的分析
荧光标记物，如FITC-葡聚糖等常用来作注射用标记物，以分辨出已经注射的细胞。浓度为0.25%～1%时，这种物质的毒性很小，而且在细胞增殖的2～4天仍可见。
3.1 在PBS中轻轻冲洗注射过的细胞两次。
3.2 用甲醇（2min）或PFA/GA（5min）快速固定
3.3 用去离子水快速冲洗盖玻片。
3.4 滴一滴Mowiol，将盖玻片装到载玻片上。
显微注射 注意事项
[注意事项]
1 在整个过程中，注射针尖应远离人员和实验室中的仪器。注射针在持针器上安装不牢时，注射器、管子及注射针内的压力，可能将注射针射出。
2 在反向充填液体时，适当地在显微镜下观察注射针尖，以决定在加压时是否注射针阻塞或偏斜。阻塞通常可通过将针尖轻轻敲击一个固定物而得以缓解。针尖偏斜的注射针是适合于显微注射的，但其使用应做细微调整或补偿注射中加压所造成的额外偏斜。
3 注射速度过快能扰乱细胞质成分，细胞裂解或细胞从底层移位。当注射体积小于估计的细胞体积的50%，并且注射样品的流动速度几乎不导致可见的细胞质移位时，注射效果最好。 4 用紫外光可看到注入标记物后的活细胞，但会对细胞造成不可恢复的损伤，因此应尽可能缩短紫外光照射时间。
5 如果对已经注射的细胞进行免疫荧光测定或其他处理，最好使用可固定的葡聚糖，以防在冲洗中造成标记物的扩散损失。
【注 意 事 项】
1．最优组分依使用的特定细胞种类而有明显的变化。如果努力优化电压和脉冲宽度电穿孔结果仍不令人满意，就应尝试改变穿孔介质。
2．影响电穿孔/电融合的另一重要因素与细胞状态有关，为达到最高效率，必须收集对数生长中期的细胞。