生物芯片与第二代测序技术是两种重要的高通量基因组学研究方法，在生命科学研究领域有着极其广泛的应用前景。经过近20年的发展，生物芯片技术逐渐成熟，正在向着 “高密度，灵活定制，微量样品” 的方向发展，从一个实验室技术发展成一个基因组学研究所依赖的，快速产生海量数据的常规手段，正在逐步走向产业化。第二代测序技术是最近几年建立的高通量技术，其特点是一次测序反应可以产生千万到亿条序列，而测序的成本大大降低，到2010年已经进入数千美元测定一个人全基因组的时代。
上海伯豪生物技术有限公司（简称SBC，上海生物芯片有限公司下属CRO子公司）先后建立了Roche 454技术平台, Illumina Solexa技术平台和ABI SOLiD技术平台，已拥有ABI SOLiD4 System（4台）、Roche Genome Sequencer FLX System（1台）和Illumina Genome Analyzer IIx（2台），已成为华东地区最大的第二代测序中心。
能提供的测序服务有：全基因组重测序、全转录组测序、染色质免疫沉淀-测序（ChIP-Seq）、DNA甲基化测序（MBD-Seq）、人全外显子组序列捕获及第二代测序、目标序列捕获及第二代测序。
目前用血液样品做microRNA芯片有两种情况。
1、全血：一般是分离白细胞，用试剂盒抽提白细胞中的RNA，随后做芯片实验。一般1-2ml全血即可。
2、血清血浆：直接用试剂盒抽提RNA，因为目前发现血清血浆中也有microRNA的存在。一般来讲，血浆的效果要好于血清。一般400ul的血清血浆就可以了。
您所问的属于第二种情况。但是做microRNA芯片的总RNA与做表达谱芯片的总RNA不一样，它必须包含microRNA，所以必须用能纯化到microRNA的试剂盒。我们公司抽提含microRNA的总RNA用Qiagen miRNeasy Kit试剂盒 或 Ambion mirVana miRNA isolution Kit试剂盒。
你们做de novo测序拼接用什么软件？一般用多少×的数据量？
拼接之后的N50值一般为多少？
还有，你们在客户送样后，是如何做质控的。从接收样本，到最后的给数据，
能出具怎么样的报告？可否给一个质控以及报告的模板给我看一下？
如果我要测一个6MB的基因组，什么价格？你会用什么方法检测？
会用454,还是solex,还是solid进行检测，建的文库大小是多少bp？
zjubell，您好：
de novo测序拼接，我们一般选用商业化的软件clc bio，或者velvet，oases（这个主要针对转录本）等公共软件。
拼接之后的N50值一般没有确定的值， 看什么物种，是genome还是 transcriptome，以及用到的软件，差别很大。 我们会对同一个物种拼接多次， 然后不断修改参数，比较得到一个好的结果。
关于样品：
对于RNA样品，我们一般要求OD260/280为1.8~2.2，Agilent Bioanalyzer仪器检测获得的总RNA 28S:18S≥1，RIN≥8。
对于DNA样品。由于我们一般收到样品之后要重新纯化一遍。所以对纯度要求不高，但对基因组完整性要求高，我们一般是跑胶检验基因组DNA的完整性。
Question:“想做血清或血浆 RNA及miRNA表达谱，该用什么芯片呢？”
Answer：血清血浆mRNA的含量特别少，几乎没有，目前没有客户用血清血浆做mRNA表达谱芯片。至于microRNA，目前只有Agilent的microRNA芯片能检验血清血浆样品中的microRNA表达量。
请问全转录组测序，可以同时检测mRNA 、miRNA及其他非编码RNA吗？
ebio66您好，感谢您的提问。
首先需要向您讲明一个事实。目前，第二代测序的长度有不同的选择。Solexa GAIIx的测序长度是36bp，75bp和100bp；ABI SOLiD3的测序长度是25bp和50bp。不同的测序长度的费用是不同的！目前，我们通常根据测序样品长度的不同而选择不同的测序长度。例如：mRNA测序通常会需要75bp的读长，而microRNA则只需要36bp或者50bp的读长就足够了。
关于您所提的问题，技术上是可行的，我们可以以75bp的读长测mRNA的同时测其中包含的microRNA。但是在经济上是不划算的。microRNA比较短，PCR扩增倍数多，形成的cluster多，占用了很多本该属于mRNA测序的资源，而它们本身又用不完75bp的读长，所以造成浪费。
一般来讲，如果要进行microRNA测序的话。我们希望能将microRNA分离出来，单独测序。
还有2个问题，
1、我看到测序长度有不同类型，如36bp，50bp，75bp，100bp等，还有单端测序和两端测序的区分。请问在选择上有什么建议？
2、加barcode可以节省一些费用，但会牺牲一些数据量。对于做高等生物全转录组测序来说，最多可以加到几个barcode？
谢谢
ebio66，您好。
在上一个回复中，我想您已经看得很清楚。36bp，50bp，75bp，100bp等是不同测序反应的读长。而单端测序指只从一端测序，双端测序指从两端同时测序。一般来讲，双端测序的读长是单端测序的两倍。至于
如何选择的话，还是要具体问题具体分析，因为单端测序的价格与双端测序也是不一样的！一般来讲，双端测序读长较长，有利于拼接，所以一般用于de nova测序。
至于Barcode。Barcode实际上是在同一次测序中区分不同样品的标记。一次测序产生的数据量有限，加多少Barcode要由转录组的大小和测序深度决定，而与物种无关。
理论上，Barcode可以达到256个。但是在一次测序反应中，Barcode越多，样品越混乱，越容易产生Bias。一般建议单次测序，Barcode不要超过4个。
想做小鼠血清或血浆的miRNA表达谱，需要多少血标本，取活着小鼠的血很难呀。
taotaohenhao，您好。
理解您实验的难处！但是用血清血浆做Agilent 的microRNA芯片。我们一般需要400ul的血清血浆。
目前，生物芯片技术发展成熟。
根据探针的不同，生物芯片分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片。
cDNA芯片的探针是以文库为模板，PCR获得。目前cDNA芯片一般为点制芯片，这类芯片的探针长度一般能达到250bp，片内重复性90%以上。但是这类芯片目前正在走向衰亡。
寡核苷酸芯片的探针是人工合成获得。现在有点制芯片和原位合成两种。目前的主流是原位合成的寡核苷酸芯片，例如，生物芯片巨头affymetrix，Agilent，nimblegen都是原位合成的寡核苷酸芯片。
原位合成的寡核苷酸芯片重复性极高。例如Agilent的表达谱芯片的片间（注意是片间！）重复性能达到99.5%！
由于现在这些商品化的原位合成寡核苷酸芯片的重复性已经有了很高的保障。因此，芯片实验的技术重复并不像以前那样得到重视（当然，如果您是自制芯片，那么还是需要做技术重复），现在大家更关心的是生物学重复，即从不同的侧面验证实验结果。
楼主好，最近想做原核的转录组，利用高通量测序。需要提取原核mRNA，请问有什么方法可以去除tRNA和rRNA？
现在去除rRNA和tRNA的试剂盒主要是针对真核（小鼠和人），对于原核，我还真是不清楚。我会去咨询一下测序公司的工程师。
我想问：如果是做癌组织和癌旁组织的microRNA芯片，得到结果以后，应该怎样分析结果？怎样从大量数据中，挑选出最具有明显意义的microRNA？
谢谢~
vrsoft，您好。
microRNA芯片得到杂交信号后，有一系列的生物学软件来对数据进行统计学分析和功能注释，归类。一般来说，芯片公司会有一个集成了各种工具软件的平台，便于客户分析数据。例如，上海伯豪的SAS平台。
至于如何从石蜡组织中提取microRNA，不用试剂盒的方法我不是很清楚，你可以在网上查一下。应该是二甲苯石蜡块脱蜡，按照常规提取石蜡组织的流程，沉淀的时候改用异丙醇加糖原Glycogen-blue等等。
生物芯片与第二代测序技术是两种重要的高通量基因组学研究方法，在生命科学研究领域有着极其广泛的应用前景。经过近20年的发展，生物芯片技术逐渐成熟，正在向着 “高密度，灵活定制，微量样品” 的方向发展，从一个实验室技术发展成一个基因组学研究所依赖的，快速产生海量数据的常规手段，正在逐步走向产业化。第二代测序技术是最近几年建立的高通量技术，其特点是一次测序反应可以产生千万到亿条序列，而测序的成本大大降低，到2010年已经进入数千美元测定一个人全基因组的时代。
上海伯豪生物技术有限公司（简称SBC，上海生物芯片有限公司下属CRO子公司）先后建立了Roche 454技术平台, Illumina Solexa技术平台和ABI SOLiD技术平台，已拥有ABI SOLiD4 System（4台）、Roche Genome Sequencer FLX System（1台）和Illumina Genome Analyzer IIx（2台），已成为华东地区最大的第二代测序中心。
能提供的测序服务有：全基因组重测序、全转录组测序、染色质免疫沉淀-测序（ChIP-Seq）、DNA甲基化测序（MBD-Seq）、人全外显子组序列捕获及第二代测序、目标序列捕获及第二代测序。
目前用血液样品做microRNA芯片有两种情况。
1、全血：一般是分离白细胞，用试剂盒抽提白细胞中的RNA，随后做芯片实验。一般1-2ml全血即可。
2、血清血浆：直接用试剂盒抽提RNA，因为目前发现血清血浆中也有microRNA的存在。一般来讲，血浆的效果要好于血清。一般400ul的血清血浆就可以了。
您所问的属于第二种情况。但是做microRNA芯片的总RNA与做表达谱芯片的总RNA不一样，它必须包含microRNA，所以必须用能纯化到microRNA的试剂盒。我们公司抽提含microRNA的总RNA用Qiagen miRNeasy Kit试剂盒 或 Ambion mirVana miRNA isolution Kit试剂盒。
你们做de novo测序拼接用什么软件？一般用多少×的数据量？
拼接之后的N50值一般为多少？
还有，你们在客户送样后，是如何做质控的。从接收样本，到最后的给数据，
能出具怎么样的报告？可否给一个质控以及报告的模板给我看一下？
如果我要测一个6MB的基因组，什么价格？你会用什么方法检测？
会用454,还是solex,还是solid进行检测，建的文库大小是多少bp？
zjubell，您好：
de novo测序拼接，我们一般选用商业化的软件clc bio，或者velvet，oases（这个主要针对转录本）等公共软件。
拼接之后的N50值一般没有确定的值， 看什么物种，是genome还是 transcriptome，以及用到的软件，差别很大。 我们会对同一个物种拼接多次， 然后不断修改参数，比较得到一个好的结果。
关于样品：
对于RNA样品，我们一般要求OD260/280为1.8~2.2，Agilent Bioanalyzer仪器检测获得的总RNA 28S:18S≥1，RIN≥8。
对于DNA样品。由于我们一般收到样品之后要重新纯化一遍。所以对纯度要求不高，但对基因组完整性要求高，我们一般是跑胶检验基因组DNA的完整性。
Question:“想做血清或血浆 RNA及miRNA表达谱，该用什么芯片呢？”
Answer：血清血浆mRNA的含量特别少，几乎没有，目前没有客户用血清血浆做mRNA表达谱芯片。至于microRNA，目前只有Agilent的microRNA芯片能检验血清血浆样品中的microRNA表达量。
请问全转录组测序，可以同时检测mRNA 、miRNA及其他非编码RNA吗？
ebio66您好，感谢您的提问。
首先需要向您讲明一个事实。目前，第二代测序的长度有不同的选择。Solexa GAIIx的测序长度是36bp，75bp和100bp；ABI SOLiD3的测序长度是25bp和50bp。不同的测序长度的费用是不同的！目前，我们通常根据测序样品长度的不同而选择不同的测序长度。例如：mRNA测序通常会需要75bp的读长，而microRNA则只需要36bp或者50bp的读长就足够了。
关于您所提的问题，技术上是可行的，我们可以以75bp的读长测mRNA的同时测其中包含的microRNA。但是在经济上是不划算的。microRNA比较短，PCR扩增倍数多，形成的cluster多，占用了很多本该属于mRNA测序的资源，而它们本身又用不完75bp的读长，所以造成浪费。
一般来讲，如果要进行microRNA测序的话。我们希望能将microRNA分离出来，单独测序。
还有2个问题，
1、我看到测序长度有不同类型，如36bp，50bp，75bp，100bp等，还有单端测序和两端测序的区分。请问在选择上有什么建议？
2、加barcode可以节省一些费用，但会牺牲一些数据量。对于做高等生物全转录组测序来说，最多可以加到几个barcode？
谢谢
ebio66，您好。
在上一个回复中，我想您已经看得很清楚。36bp，50bp，75bp，100bp等是不同测序反应的读长。而单端测序指只从一端测序，双端测序指从两端同时测序。一般来讲，双端测序的读长是单端测序的两倍。至于
如何选择的话，还是要具体问题具体分析，因为单端测序的价格与双端测序也是不一样的！一般来讲，双端测序读长较长，有利于拼接，所以一般用于de nova测序。
至于Barcode。Barcode实际上是在同一次测序中区分不同样品的标记。一次测序产生的数据量有限，加多少Barcode要由转录组的大小和测序深度决定，而与物种无关。
理论上，Barcode可以达到256个。但是在一次测序反应中，Barcode越多，样品越混乱，越容易产生Bias。一般建议单次测序，Barcode不要超过4个。
想做小鼠血清或血浆的miRNA表达谱，需要多少血标本，取活着小鼠的血很难呀。
taotaohenhao，您好。
理解您实验的难处！但是用血清血浆做Agilent 的microRNA芯片。我们一般需要400ul的血清血浆。
目前，生物芯片技术发展成熟。
根据探针的不同，生物芯片分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片。
cDNA芯片的探针是以文库为模板，PCR获得。目前cDNA芯片一般为点制芯片，这类芯片的探针长度一般能达到250bp，片内重复性90%以上。但是这类芯片目前正在走向衰亡。
寡核苷酸芯片的探针是人工合成获得。现在有点制芯片和原位合成两种。目前的主流是原位合成的寡核苷酸芯片，例如，生物芯片巨头affymetrix，Agilent，nimblegen都是原位合成的寡核苷酸芯片。
原位合成的寡核苷酸芯片重复性极高。例如Agilent的表达谱芯片的片间（注意是片间！）重复性能达到99.5%！
由于现在这些商品化的原位合成寡核苷酸芯片的重复性已经有了很高的保障。因此，芯片实验的技术重复并不像以前那样得到重视（当然，如果您是自制芯片，那么还是需要做技术重复），现在大家更关心的是生物学重复，即从不同的侧面验证实验结果。
楼主好，最近想做原核的转录组，利用高通量测序。需要提取原核mRNA，请问有什么方法可以去除tRNA和rRNA？
现在去除rRNA和tRNA的试剂盒主要是针对真核（小鼠和人），对于原核，我还真是不清楚。我会去咨询一下测序公司的工程师。
我想问：如果是做癌组织和癌旁组织的microRNA芯片，得到结果以后，应该怎样分析结果？怎样从大量数据中，挑选出最具有明显意义的microRNA？
谢谢~
vrsoft，您好。
microRNA芯片得到杂交信号后，有一系列的生物学软件来对数据进行统计学分析和功能注释，归类。一般来说，芯片公司会有一个集成了各种工具软件的平台，便于客户分析数据。例如，上海伯豪的SAS平台。
至于如何从石蜡组织中提取microRNA，不用试剂盒的方法我不是很清楚，你可以在网上查一下。应该是二甲苯石蜡块脱蜡，按照常规提取石蜡组织的流程，沉淀的时候改用异丙醇加糖原Glycogen-blue等等。