苏云金芽孢杆菌LLB19发酵培养基的优化

第２５卷第２期２００９年３月

福建师范大学学报（自然科学版）

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｕｊｉａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）

Ｖ０１．２５ＮＯ．２

Ｍａｒ．２００９

文章编号：１０００—５２７７（２００９）０２—００７５—０７

苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９发酵培养基的优化

杨

梅ｈｚ，张峰１，苏新华２

３５０１０８；

３５０００２）

（１．福建师范大学生命科学学院，福建福州

２．福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福建福州

摘要：通过单因子实验对苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９菌株发酵培养基碳氮源配方进行优化，确定以玉米淀粉、玉米粉为发酵培养基的碳源；以黄豆饼粉、酵母粉作为发酵培养基的氮源．采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计．ＳＡＳ软件分析该菌株的发酵培养基配方，确定了玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉为影响Ｉ。Ｉ。Ｂ１９菌株芽孢含量的３种重要因子．运用爬坡路径法对这３种因子进行实验，获得这３种重要因子的最适质量浓度范围．通过响应面分析法，得出３种重要影响因子的交互作用及最佳条件．确定ＬＩ。Ｂ１９菌株产芽孢最佳发酵培养基为：

玉米淀粉２０．０ｇ／Ｌ，黄豆饼粉２６．７ｇ／ｉ。，酵母粉５．５ｇ／Ｌ，ＫｚＨＰ０４０．３ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ，・７Ｈ２００．２ｇ／Ｉ。．ＣａＣＯａ

０．４

ｇ／Ｉ。，ＺｎＳＯ．０．２ｇ／Ｌ．最佳发酵培养基芽抱数为４．２５０Ｘ１０７／ｍＬ，与初始培养基芽抱数３．４１０×ｉ０７／ｍＬ

相比提高了２４．６％．

关键词：苏云金芽抱杆菌；Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ；爬坡路径法；响应面中图分类号：Ｑ９３６

文献标识码：Ａ

ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＭｅｄｉｕｍｆｏｒＳｐｏｒｅｓ

ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＬＬＢ１９

ＹＡＮＧＭｅｉｌ～。ＺＨＡＮＧＦｅｎ９１，ＳＵＸｉｎ—ｈｕａ２

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ２．Ｋｅｙ

ｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＦｕｊｉａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０１０８．Ｃｈｉｎａ；

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ

ｏｆＢｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ．Ｆ巧ｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄ

Ｆｏｒｅｓｔｒｙ

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙｏｆ

Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ・Ｆｕｚｈｏｕ３５０００２・Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｆｏｒｓｐｏｒｅｓ

ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ

ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＢａｃｉｌｌｕｓ

ＬＬＢｌ９ｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ

ｔｏ

ｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｉａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｃｏｒｎｆｌｏｕｒ

ａｎｄ

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ｓｔａｒｃｈ，ｂｅａｎｃａｋｅｐｏｗｄｅｒａｎｄｙｅａｓｔｐｏｗｄｅｒｗｅｒｅｔｈｅｍｏｓｔｓｕｉｔａｂｌｅｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉ—

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ｓｏｕｒｃｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎｄｅｓｉｇｎｗａｓｕｓｅｄ

ｃｏｒｎ

ｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

ｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｒｏｕｇｈＳＡＳｓｏｆｔｗａｒｅａｎａｌｙｚｉｎｇｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔ

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ｔｏ

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ａｐｐｒｏａｃｈｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．

Ｔｈｅｎｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｍｂｉｎｅｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｍｕｔｕａｌｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｒｅｅｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｂｅｓｔｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｗａｓ

ｃｏｒｎ

ｓｔａｒｃｈ２０。０ｇ／Ｌ，ｂｅａｎｃａｋｅｐｏｗｄｅｒ２６．７ｇ／Ｌ，ｙｅａｓｔｐｏｗｄｅｒ５．５ｇ／Ｌ，ＫｚＨＰ０４０・３ｇ／

ｓｐｏｒｅｓ

Ｌ，ＭｇＳ０４・７Ｈ２００．２ｇ／Ｌ，ＣａＣ０３０．４ｇ／Ｌ，ＺｎＳ０４０．２ｇ／Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｔｗｈｉｃｈ

ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｗａｓ４．２５０Ｘ１０７／ｍＬｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ２４．６％ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅ３．４１０×１０７／ｍＬｏｆｍｉｎ—ｉｍａｌｍｅｄｉｕｍ．收稿日期：２００８—０６—０４

基金项目；福建省科技厅基金资助项目（ＪＡ０８０４１）

作者简介：杨梅（１９６３一），女，福建龙岩人．副教授．博士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学

福建师范大学学报（自然科学版）

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苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，简称Ｂｔ）是昆虫病原细菌，属于革兰氏阳性菌ＬｌＪ．在稳定生长期胁可形成伴孢晶体（ｐａｒａｓｐｏｒａｌｃｒｙｓｔａｌｓ），又称杀虫晶体蛋白（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ

ｃｒｙｓｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ，

ＩＣＰ）［ｚ叫］，ＩＣＰ对敏感昆虫有强烈的毒性，而对它们的天敌、人畜以及植物无害，被广泛用作生物农药防治多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目的害虫，Ｂｆ是目前研究最为深入、应用最为广泛的微生物制剂ｒｓ－＇Ｏ．

肪发酵培养基的配方与发酵水平密切相关，合适的碳源、氮源和无机盐以及他们之间的比例直接影响目标产物伴孢晶体的产量［８］．目前生产上Ｂｆ发酵培养基配方的主要成分有玉米粉、葡萄糖、豆饼粉、鱼粉以及其它一些微量元素，但由于配比的不恰当使得Ｂｆ伴孢晶体含量不高．调整培养基中各物质的配比，可以改善细菌的生长条件，提高发酵液伴孢晶体含蹙．黄天培、邱思鑫等【９Ｊ采用正交实验设计法对苏云金芽孢杆菌高毒力菌株ＴＳｌ６的摇瓶发酵培养基进行优化；王善利、马景芝等［１０］采用均匀实验设计法优化苏云金芽孢杆菌（ＨＤ２１）发酵培养基配方以及纯化伴孢晶体的条件；Ｓ．Ｒ．Ｐｒａｂａｇａｒａｎａ、Ｋ．Ｐａｋｓｈｉｒａｊａｎ等Ｌ１・１采用Ⅱ向应面法对苏云金芽孢杆ＰＢＴ一３７２进行了优化．但将ＳＡＳ软件应用到＆发酵培养基优化筛选目前未有报道．本实验采用ＳＡＳ软件中的Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计法、响应面分析方法（ＲＳＡ）和爬坡路径法相结合对苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９进行发酵培养基的优化，对苏云金芽孢杆菌培养基不同组分对芽孢产率的影响进行初步的探索．

１材料和方法

１．１供试菌株

苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９由福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室提供．１．２培养基

１．２．１液体种子培养基

酵母浸膏蛋白胨培养基．１．２．２碳源单因子实验发酵培养基

分别以质量分数为２ｏ．４的玉米淀粉、葡萄糖、玉米粉、蔗糖、乳糖为碳源，叫（黄豆饼粉）１．５％，甜（酵母粉）Ｏ．４％，ｗ（Ｋ２ＨＰ０４）Ｏ．０３％，ｗ（ＭｇＳ０４・７Ｈ２０）０．０２％，ｗ（ＣａＣ０３）Ｏ．０４％，ｗ（ＺｎＳ０４）Ｏ．０２％．

１．２．３

氮源单因子实验发酵培养基

分别以质挝分数为２％的黄豆饼粉、酵母粉、蛋白胨、黄豆粉和硫酸铵作为氮源，ｗ（ｔ米淀粉）２％，ｗ（Ｋ２ＨＰ０４）Ｏ．０３％，ｗ（ＭｇＳ０４・７Ｈ２０）Ｏ．０２％，ｗ（ＣａＣ０３）ｏ．０４％，ｗ（ＺｎＳ０４）ｏ．０２％．１．３发酵条件

２５０

ｍＬ三角瓶装５０ｍＬ培养基，初始ｐＨ７．２，高压灭菌２０ｒａｉｎ．以体积分数为ｌ％接种赶转接液

体菌种，置于２８℃，２００ｒ／ｍｉｎ的摇床内进行发酵培养；９２ｈ后对发酵液中的芽孢含量进行测定．１．４培养基的优化

通过单因子实验确定苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９培养基的最适碳氮源，用ＳＡＳ软件中２水平筛选出对影响芽孢产量的重要因子，再通过爬坡路径法和响应面分析对重要囚子的水平进行优化．

１．４．１

２水平设计

选取培养基的８个组分，以实验次数为１２的Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计法分析发酵培养基中影响芽孢产量的重要因子．

１．４．２爬坡路径法

根据ＰＩａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计的实验得出的１次拟合方程安排爬坡实验．以适当的梯度改变重要影响因子在发酵培养基中的质量浓度，其他组分取低水平即初始发酵培养基的质量浓度，测定发酵液芽孢量变化趋势，确定最适质量浓度范围．１．４．３响应面分析

第２期

杨梅等：苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９发酵培养基的优化

运用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ的中心组合设计原理，以最陡爬坡实验得到的中心点对Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验确定的３个显著性影响因子各取３水平．设计了３因素３水平共１５个实验点进行响应面分析．１．５芽孢量测定

用石碳酸复红对待测菌液进行染色，芽孢未被染色，在显微镜下观察，血球计数板进行计数．

２结果与分析

２．１单因子实验

２．１．１

碳源单因子实验

分别以玉米淀粉、葡萄糖、玉米粉、蔗糖、乳糖为碳源，对苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９进行发酵培养，结果表明５种碳源都能促进该菌的生长并产生芽孢．其中以玉米淀粉为碳源的培养基芽孢产量最多，结果见图１．从培养基原料的来源、价格和对芽孢产量的影响等方面考虑，确定以玉米粉、玉米淀粉作为发酵培养基的碳源．

２．１．２

氮源单因子实验

图１不同碳源对苏云金芽孢杆菌芽孢产量的影响

以玉米淀粉作为碳源，分别以黄豆饼粉、酵母粉、硫酸铵、蛋白胨、黄豆粉作为初始氮源，进行单因子实验．在培养过程中苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９生长良好，各种培养基组合都有芽孢产生，但在芽孢产量上有所差别，结果如图２所示．可见酵母粉对芽孢的产量影响最大，本实验确定以酵母粉、黄豆饼粉作为培养基的氮源．

２．２

Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计法筛选培养基巾影响发酵液芽孢通过碳源和氮源单因子实验，结合其他召ｚ发酵实验过程

产量的重要因子

中发酵培养基的组成以及碳氮源比例，确定初始发酵培养基为：玉米粉１０．０ｇ／Ｌ，玉米淀粉１５．０ｇ／Ｌ，黄豆饼粉２０．０ｇ／Ｌ，酵母粉３．０ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰ０４

０．３ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ。・７Ｈ２００．２ｇ／

Ｌ，ＣａＣＯ。０．４ｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ。０．２

ｇ／Ｌ．将初始发酵培养基巾的

图２不同氮源对苏云金芽孢杆菌芽孢产量的影响

８个组分作为影响因素进行全面考察，选择８因子２水平的实

验设计，以ｘ。、咒、ｘ。、Ｘ。、ｘ，、ｘ。、ｘ。。、ｘ。。分别代表玉米粉、玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉、Ｋ：ＨＰＯ。、

ＭｇＳＯ。・７Ｈ。Ｏ、ＣａＣＯｓ、ＺｎＳＯ。，用Ｘｓ、Ｘ。、Ｘ。代表虚拟因子以减少误差．每个因子取高（＋１）和低（一１）两个水平（见表１），通过不同的组合观察发酵液中芽孢的含量，实验设计方案及结果见表２．

表１

水平

一１

ｌ

Ｐｌａｃｋｅｔｔ・Ｂｕｒｍａｎ实验设计因子与水平

Ｘ２

ｇ／Ｉ。

Ｘｌｏ０．４０．５０

Ｘ１Ｉ０．２０．２５

Ｘｌ

１０．Ｏ１２．５０

Ｘ４

２０．０２５．００

Ｘｓ３．０３．７５

Ｘ７０．３０．３８

Ｘ８０．２０．２５

１５．０１８．７５

实验数据由ＳＡＳ软件的２水平设计并分析各个因子的主效应，即在其他因子不变的情况下，某因子的变化对响应值的影响，数据处理和验证结果见表３，可知输入因子玉米淀粉、酵母粉、黄豆饼粉在置信区间内对发酵液芽孢产量的影响很大，为显著性因子，三者的重要性排序为：玉米淀粉、酵母粉、

黄豆饼粉．

７８

福建师范大学学报（自然科学版）表２

Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计方案及相应值

表３Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验分析结果

２．３爬坡路径方法确定发酵培养基重要影响因子的最适质量浓度范围

从Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验结果可知玉米淀粉、黄豆饼粉和酵母粉是影响发酵液芽孢产量的重要因子，三者的模型方程系数均为正数，对芽孢的产量有积极作用．对３种重要影响因子进行爬坡路径实验，确定此３种因子的最适质量浓度范围，结果见表４．随玉米淀粉、黄豆饼粉和酵母粉质量浓度的增加，发酵液芽孢含量的变化趋势先上升后下降．当玉米淀粉２０．０ｇ／Ｌ，黄豆饼粉２７．５ｇ／Ｌ，酵母粉５．５ｇ／Ｌ时，对应的发酵液芽孢含量达到最大值，为３因子的最大响应值区域，以此为中心点进行响应面分析．

表４爬坡法路径实验设计及结果

２．４响应面分析法确定发酵培养基最佳质量浓度配方

响应面分析法是一种寻找多因子系统中最佳条件的数学统计方法，其中Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ和Ｂｏｘ—Ｗｉｌ—ｓｏｎ中心组合设计是两种较常用的响应面分析法（ＲＳＡ）【１２－１引．根据相应的实验设计进行实验后，对数据进行二次回归拟合，得到带交互项和平方项的二次方程，最后在一定的水平范围内求出最佳值，然后进行数学模型验证．通过爬坡路径法确定发酵培养基３种重要影响因子质量浓度范围后，以玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉３种因子为自变量，以发酵液中芽孢的产量为响应值，实验因素与水平见表５，

第２期杨梅等：苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９发酵培养基的优化

７９

根据Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ中心组合设计原理，设计３因子３水平的响应面分析实验，中心点设置３次重复．实验方案及实验结果见表６．

运用ＳＡＳＲＳＲＥＧ程序对１５个实验点的响应面值进行回归分析，得二次多项式方程：Ｙ。一４．０５８

３３３—０．０１５６２５Ｘｌ一０．０２８１２５Ｘ２—０．０１８７５Ｘ３—０．５０７２９２Ｘ１２＋０．０６８７５Ｘ１Ｘ２＋０．０３７５Ｘ１Ｘ３—０．０３２２９２Ｘ２２—０．０７５Ｘ２Ｘ３—０．２７６

０４２Ｘ３２，决定系数Ｒ２—０．９６３２，表明模型能解释９６．３２％发酵液

中芽孢含量的变化，回归拟合程度较好．

通过软件分析得到３种重要影响因子之间的响应面分析图和相应的等高图（见图３一图５）．任意两个因子与响应面ｙ值之间的关系可通过三维与二维图形立体直观地表现出来．

表５响应分析法设计因子及水平列表

ｇ／Ｌ

表６响应分析法实验设计及结果

实验序号

ｌ２３４５６７８

３一

芽孢数／（１０７‘ｍｌ。－１）

３．６２５３．４７５３．４２５３．５５０

３．７００

鼠一一●一ｌ

一１

１１ｏ

ｏ

咒一一２一ｌ

１

ｘ．一ｏ

ｏｏｏ

—１

１一ｌ一１ｌ１

ｏ

一ｌ１

３．９００３．７５０３。６５０３．３７５３．３００３．１７５３．２５０４．１７５４．０５０３．９５０

ｏｏ

一１

ｌ

—１

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一１一ｌ

１ｌ

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—ｌ

ｌ

ｏ

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垢

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图３一Ａ显示，在Ｘ。（玉米淀粉）质量浓度为最佳值１８．５ｇ／Ｌ时，随着Ｘ：（黄豆饼粉）质量浓度的增加发酵液芽孢含量没有明显变化，说明在一定范围内黄豆饼粉质量浓度的变化对发酵液芽孢含量的变化没有显著的影响．在Ｘ。（黄豆饼粉）质量浓度为高水平或者低水平时，随着Ｘ。（玉米淀粉）质量浓度的增加，发酵液芽孢含量先增加后降

图３玉米淀粉和黄豆饼粉响应分析法分析图和相应的等高图

低，表明玉米淀粉含量的变化对发酵液中芽孢的产量有一定的影响．图３～Ｂ表明Ｘ。（玉米淀粉）与Ｘ。（黄豆饼粉）两因子交互作用不太显著，等高图的圆心对应的值存在着一个最佳值．

图４一Ａ显示Ｘ。（酵母粉）在最佳质量浓度５．５ｇ／Ｌ时，随着Ｘ。（玉米淀粉）随着质量浓度的增加，发酵液的芽孢含量先增加再减少，说明高质量浓度或低质量浓度的玉米淀粉都不利于发酵液芽孢量的增加．当Ｘ。（玉米淀粉）的质量浓度在低水平或高水平时，随着Ｘ。（酵母粉）质量浓度的增加发酵液中芽孢

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福建师范大学学报（自然科学版）

含量先增加再减少，表明为酵母粉的质量浓度对芽孢的产生有一定的影响，或高或低都对芽孢的产生不利．图４一Ｂ显示Ｘ，（玉米淀粉）与Ｘ。（酵母粉）两因子交互作用的等高图谱，表明两者交互作用显著．

图５一Ａ表明，当Ｘ。（黄豆饼粉）处于图中所示的质量浓度范围时，随着Ｘ。（酵母粉）质量浓度的增加，发酵液中芽孢含量先增加后降低；而当酵母粉质量浓度一定时，随着黄豆饼粉质量浓度的升高，发酵液中芽孢的产量没有明显变化，由此可见，在一定质量浓度范围内黄豆饼粉质量浓度变化对发酵液芽孢含量基本没有影响．酵母粉和黄豆饼粉都属于氮源，从芽孢含量上分析，图中所示两者的质量浓度作为氮源已经足够．酵母粉除了作为氮源外，还含有

图５黄豆饼粉和酵母粉响应分析法分析图和相应的等高图图４玉米淀粉和酵母粉响应分析法分析图和相应的等高图

丰富的维生素，随着其质量浓度的升高，芽孢产量先增加后降低，可见维生素对芽孢产量的增加有一定的影响．图５一Ｂ显示Ｘ。（黄豆饼粉）与Ｘ。（酵母粉）两因子交互作用不显著．

３模型验证

从数学模型得到玉米粉的最佳质量浓度是２０．０ｇ／Ｌ，黄豆饼粉的最佳质量浓度是２６．７ｇ／Ｌ，酵母粉的最佳质量浓度是５．５ｇ／Ｌ．根据模型得到发酵培养基各组分的最适比例进行发酵，芽孢产最为４．２５０×１０７／ｍＬ，与初始培养基芽孢产量３．４１０×１０７／ｍＬ相比，提高ｒ２４．６％．实验结果证明优化后的培养基使发酵液苏云芽孢杆菌的芽孢产量得到较大的提高．

４讨论

发酵培养基优化的常用方法有单因子法和正交实验设计法，单因子法只针对某一因子的影响，不考虑发酵培养基多种组分间的交互作用，难以取得发酵培养基优化的最佳结果．正交实验设计主要侧重如何合理地安排实验，同时也考虑发酵培养基的多种因子间的交互作用，寻求各因子水平的最佳组合．但它不能得出整个区域因子和响应值之间的一个明确的函数表达式，从而难以确定整个区域ｆ＝因子的最佳组合和响应值的最佳组合．响应面分析法是一种数学统计方法，用于研究多凶子系统中因子交互作用达到最大响应值时所对应的最佳条件．虽然它与过去推广的“正交实验法”均建立在正交设计原理的基础上，但响应面分析法更有效．国内外不少学者通过响应面分析法在发酵培养基优化方面取得了良好效果．本实验通过单因子实验确定苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９发酵培养基的碳氮源，采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计法快速地从发酵培养基的众多因素中筛选出对芽孢产量影响最大的３种重要因子．使用爬坡路径方法确定了重要影响因子的质量浓度范围，最后与响应面方法相结合快速、有效地对苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９液体发酵培养基中的重要影响因子进行了优化，得到最佳培养基配方为：玉米淀粉２０．０ｇ／Ｌ，黄豆饼粉２６．７ｇ／Ｌ，酵母粉５．５ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰ０４

ＣａＣＯ。０．４ｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ．０．２

０．３ｇ／Ｌ，ＭｇＳ０４・７Ｈ２００．２ｇ／Ｌ，

ｇ／Ｌ．Ｂｔ产伴孢晶体特性赋予其具有杀虫活性，是一种新型的微生物杀虫

剂，但通过调整发酵培养配方提高苏云金芽孢杆菌伴孢晶体产量的报道较少，因此优化Ｂｆ发酵培养基

配方显得非常重要，本研究的结果对于苏云金芽孢杆菌在工业发酵上的应用有重要意义．

第２期杨梅等：苏云金芽孢杆菌ＬＩ。Ｂ１９发酵培养基的优化

８１

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Ｓ

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ｒｅ—

ｓｕｒｆａｃｅ

ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＣｈｅｍＢｉｏｃｈｅｍ，２００４．１８（２）；１８３—１８７。

［１２］欧宏字．贾士儒．ＳＡＳ软件在微生物培养条件优化中的应用［Ｊ］．天津轻工业学院学报．２００１（１）：１４—１７．［１３］常亚飞，陈守文，喻子牛．苏云金索发酵培养基的优化设计［Ｊ］．中国生物防治．２００６．２２（３）：１９０一１９４．［１４３郑毅。周堍，黄勤清，等．产耐温蛋白酶苏云金芽孢杆菌ＦＳｌ４０液体发酵条件优化［Ｊ］．应用与环境生物学报，

２００７，１３（５）：７０８—７１２．

（责任编辑：余望）

嘞ｓ刁匈劫匈嘞ｅ啤ｅ啤ｅ峰ｅ啤ｅ啤毒啤毒每向劫：％岛物％物嘞勃勃ｅ啤毫噜ｓ每ｅ噜劫ｅ啕粤罩ｅ啤ｅ峰ｅ噜毒罩劫￥牟嘞劫勃￥每嘞劫‰芒峰ｅ峰岛劫

（上接第６７页）

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Ｈ，ＴａｒａｂｉａＨ，ＤａｖｉｄｏｖＤ。ｅｔａ１．Ｐｏｓｓｉｂｌｅｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒ

ｑｕａｎｔｕｍ—ｓｉｚｅｅｆｆｅｃｔｓｉｎｓｅｌｆ—ａｓｓｅｍｂｌｅｄｕｌｔｒａｔｈｉｎｆｉｌｍｓ

ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ

ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｃｏｐｏｌｙｍｅｒｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｐｐｌｉｅｄＰｈｙｓｉｃｓ，１９９６，７９（６）：３０８２－－３０８８．

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一１３１９．

（责任编辑：陈力勤）

苏云金芽孢杆菌LLB19发酵培养基的优化

作者：作者单位：

杨梅， 张峰， 苏新华， YANG Mei， ZHANG Feng， SU Xin-hua

杨梅,YANG Mei(福建师范大学生命科学学院,福建,福州,350108;福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建,福州,350002)， 张峰,ZHANG Feng(福建师范大学生命科学学院,福建,福州,350108)， 苏新华,SU Xin-hua(福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建,福州,350002)

福建师范大学学报（自然科学版）

JOURNAL OF FUJIAN NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION)2009,25(2)

刊名：英文刊名：年，卷(期)：

参考文献(14条)

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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_fjsfdxxb200902017.aspx

第２５卷第２期２００９年３月

福建师范大学学报（自然科学版）

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｕｊｉａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）

Ｖ０１．２５ＮＯ．２

Ｍａｒ．２００９

文章编号：１０００—５２７７（２００９）０２—００７５—０７

苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９发酵培养基的优化

杨

梅ｈｚ，张峰１，苏新华２

３５０１０８；

３５０００２）

（１．福建师范大学生命科学学院，福建福州

２．福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室，福建福州

摘要：通过单因子实验对苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９菌株发酵培养基碳氮源配方进行优化，确定以玉米淀粉、玉米粉为发酵培养基的碳源；以黄豆饼粉、酵母粉作为发酵培养基的氮源．采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计．ＳＡＳ软件分析该菌株的发酵培养基配方，确定了玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉为影响Ｉ。Ｉ。Ｂ１９菌株芽孢含量的３种重要因子．运用爬坡路径法对这３种因子进行实验，获得这３种重要因子的最适质量浓度范围．通过响应面分析法，得出３种重要影响因子的交互作用及最佳条件．确定ＬＩ。Ｂ１９菌株产芽孢最佳发酵培养基为：

玉米淀粉２０．０ｇ／Ｌ，黄豆饼粉２６．７ｇ／ｉ。，酵母粉５．５ｇ／Ｌ，ＫｚＨＰ０４０．３ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ，・７Ｈ２００．２ｇ／Ｉ。．ＣａＣＯａ

０．４

ｇ／Ｉ。，ＺｎＳＯ．０．２ｇ／Ｌ．最佳发酵培养基芽抱数为４．２５０Ｘ１０７／ｍＬ，与初始培养基芽抱数３．４１０×ｉ０７／ｍＬ

相比提高了２４．６％．

关键词：苏云金芽抱杆菌；Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ；爬坡路径法；响应面中图分类号：Ｑ９３６

文献标识码：Ａ

ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＭｅｄｉｕｍｆｏｒＳｐｏｒｅｓ

ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＬＬＢ１９

ＹＡＮＧＭｅｉｌ～。ＺＨＡＮＧＦｅｎ９１，ＳＵＸｉｎ—ｈｕａ２

（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ２．Ｋｅｙ

ｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＦｕｊｉａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０１０８．Ｃｈｉｎａ；

Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ

ｏｆＢｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌＢｉｏｌｏｇｙ．Ｆ巧ｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄ

Ｆｏｒｅｓｔｒｙ

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙｏｆ

Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ・Ｆｕｚｈｏｕ３５０００２・Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｆｏｒｓｐｏｒｅｓ

ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ

ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙＢａｃｉｌｌｕｓ

ＬＬＢｌ９ｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ

ｔｏ

ｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｉａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｃｏｒｎｆｌｏｕｒ

ａｎｄ

ｃｏｒｎ

ｓｔａｒｃｈ，ｂｅａｎｃａｋｅｐｏｗｄｅｒａｎｄｙｅａｓｔｐｏｗｄｅｒｗｅｒｅｔｈｅｍｏｓｔｓｕｉｔａｂｌｅｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉ—

ｔｏ

ｔｒｏｇｅｎ

ｓｏｕｒｃｅｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎｄｅｓｉｇｎｗａｓｕｓｅｄ

ｃｏｒｎ

ｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

ｍｅｄｉｕｍ，ｔｈｒｏｕｇｈＳＡＳｓｏｆｔｗａｒｅａｎａｌｙｚｉｎｇｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔ

ｙｅａｓｔ

ｓｔａｒｃｈ，ｂｅａｎｃａｋｅｐｏｗｄｅｒａｎｄ

ｐｏｗｄｅｒｗｅｒｅｔｈｅｔｈｒｅｅｐｒｉｍｅｆａｃｔｏｒｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｓｐｏｒｅｓｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅｐａｔｈｏｆｓｔｅｅｐｅｓｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓａｄｏｐｔｅｄ

ｔｏ

ａｓｃｅｎｔ

ａｐｐｒｏａｃｈｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ．

Ｔｈｅｎｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｍｂｉｎｅｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｍｕｔｕａｌｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｒｅｅｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｂｅｓｔｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｗａｓ

ｃｏｒｎ

ｓｔａｒｃｈ２０。０ｇ／Ｌ，ｂｅａｎｃａｋｅｐｏｗｄｅｒ２６．７ｇ／Ｌ，ｙｅａｓｔｐｏｗｄｅｒ５．５ｇ／Ｌ，ＫｚＨＰ０４０・３ｇ／

ｓｐｏｒｅｓ

Ｌ，ＭｇＳ０４・７Ｈ２００．２ｇ／Ｌ，ＣａＣ０３０．４ｇ／Ｌ，ＺｎＳ０４０．２ｇ／Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｔｗｈｉｃｈ

ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｗａｓ４．２５０Ｘ１０７／ｍＬｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ２４．６％ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅ３．４１０×１０７／ｍＬｏｆｍｉｎ—ｉｍａｌｍｅｄｉｕｍ．收稿日期：２００８—０６—０４

基金项目；福建省科技厅基金资助项目（ＪＡ０８０４１）

作者简介：杨梅（１９６３一），女，福建龙岩人．副教授．博士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学

福建师范大学学报（自然科学版）

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苏云金芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ，简称Ｂｔ）是昆虫病原细菌，属于革兰氏阳性菌ＬｌＪ．在稳定生长期胁可形成伴孢晶体（ｐａｒａｓｐｏｒａｌｃｒｙｓｔａｌｓ），又称杀虫晶体蛋白（ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ

ｃｒｙｓｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ，

ＩＣＰ）［ｚ叫］，ＩＣＰ对敏感昆虫有强烈的毒性，而对它们的天敌、人畜以及植物无害，被广泛用作生物农药防治多种鳞翅目、双翅目、鞘翅目的害虫，Ｂｆ是目前研究最为深入、应用最为广泛的微生物制剂ｒｓ－＇Ｏ．

肪发酵培养基的配方与发酵水平密切相关，合适的碳源、氮源和无机盐以及他们之间的比例直接影响目标产物伴孢晶体的产量［８］．目前生产上Ｂｆ发酵培养基配方的主要成分有玉米粉、葡萄糖、豆饼粉、鱼粉以及其它一些微量元素，但由于配比的不恰当使得Ｂｆ伴孢晶体含量不高．调整培养基中各物质的配比，可以改善细菌的生长条件，提高发酵液伴孢晶体含蹙．黄天培、邱思鑫等【９Ｊ采用正交实验设计法对苏云金芽孢杆菌高毒力菌株ＴＳｌ６的摇瓶发酵培养基进行优化；王善利、马景芝等［１０］采用均匀实验设计法优化苏云金芽孢杆菌（ＨＤ２１）发酵培养基配方以及纯化伴孢晶体的条件；Ｓ．Ｒ．Ｐｒａｂａｇａｒａｎａ、Ｋ．Ｐａｋｓｈｉｒａｊａｎ等Ｌ１・１采用Ⅱ向应面法对苏云金芽孢杆ＰＢＴ一３７２进行了优化．但将ＳＡＳ软件应用到＆发酵培养基优化筛选目前未有报道．本实验采用ＳＡＳ软件中的Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计法、响应面分析方法（ＲＳＡ）和爬坡路径法相结合对苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９进行发酵培养基的优化，对苏云金芽孢杆菌培养基不同组分对芽孢产率的影响进行初步的探索．

１材料和方法

１．１供试菌株

苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９由福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室提供．１．２培养基

１．２．１液体种子培养基

酵母浸膏蛋白胨培养基．１．２．２碳源单因子实验发酵培养基

分别以质量分数为２ｏ．４的玉米淀粉、葡萄糖、玉米粉、蔗糖、乳糖为碳源，叫（黄豆饼粉）１．５％，甜（酵母粉）Ｏ．４％，ｗ（Ｋ２ＨＰ０４）Ｏ．０３％，ｗ（ＭｇＳ０４・７Ｈ２０）０．０２％，ｗ（ＣａＣ０３）Ｏ．０４％，ｗ（ＺｎＳ０４）Ｏ．０２％．

１．２．３

氮源单因子实验发酵培养基

分别以质挝分数为２％的黄豆饼粉、酵母粉、蛋白胨、黄豆粉和硫酸铵作为氮源，ｗ（ｔ米淀粉）２％，ｗ（Ｋ２ＨＰ０４）Ｏ．０３％，ｗ（ＭｇＳ０４・７Ｈ２０）Ｏ．０２％，ｗ（ＣａＣ０３）ｏ．０４％，ｗ（ＺｎＳ０４）ｏ．０２％．１．３发酵条件

２５０

ｍＬ三角瓶装５０ｍＬ培养基，初始ｐＨ７．２，高压灭菌２０ｒａｉｎ．以体积分数为ｌ％接种赶转接液

体菌种，置于２８℃，２００ｒ／ｍｉｎ的摇床内进行发酵培养；９２ｈ后对发酵液中的芽孢含量进行测定．１．４培养基的优化

通过单因子实验确定苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９培养基的最适碳氮源，用ＳＡＳ软件中２水平筛选出对影响芽孢产量的重要因子，再通过爬坡路径法和响应面分析对重要囚子的水平进行优化．

１．４．１

２水平设计

选取培养基的８个组分，以实验次数为１２的Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计法分析发酵培养基中影响芽孢产量的重要因子．

１．４．２爬坡路径法

根据ＰＩａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计的实验得出的１次拟合方程安排爬坡实验．以适当的梯度改变重要影响因子在发酵培养基中的质量浓度，其他组分取低水平即初始发酵培养基的质量浓度，测定发酵液芽孢量变化趋势，确定最适质量浓度范围．１．４．３响应面分析

第２期

杨梅等：苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９发酵培养基的优化

运用Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ的中心组合设计原理，以最陡爬坡实验得到的中心点对Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验确定的３个显著性影响因子各取３水平．设计了３因素３水平共１５个实验点进行响应面分析．１．５芽孢量测定

用石碳酸复红对待测菌液进行染色，芽孢未被染色，在显微镜下观察，血球计数板进行计数．

２结果与分析

２．１单因子实验

２．１．１

碳源单因子实验

分别以玉米淀粉、葡萄糖、玉米粉、蔗糖、乳糖为碳源，对苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９进行发酵培养，结果表明５种碳源都能促进该菌的生长并产生芽孢．其中以玉米淀粉为碳源的培养基芽孢产量最多，结果见图１．从培养基原料的来源、价格和对芽孢产量的影响等方面考虑，确定以玉米粉、玉米淀粉作为发酵培养基的碳源．

２．１．２

氮源单因子实验

图１不同碳源对苏云金芽孢杆菌芽孢产量的影响

以玉米淀粉作为碳源，分别以黄豆饼粉、酵母粉、硫酸铵、蛋白胨、黄豆粉作为初始氮源，进行单因子实验．在培养过程中苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９生长良好，各种培养基组合都有芽孢产生，但在芽孢产量上有所差别，结果如图２所示．可见酵母粉对芽孢的产量影响最大，本实验确定以酵母粉、黄豆饼粉作为培养基的氮源．

２．２

Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计法筛选培养基巾影响发酵液芽孢通过碳源和氮源单因子实验，结合其他召ｚ发酵实验过程

产量的重要因子

中发酵培养基的组成以及碳氮源比例，确定初始发酵培养基为：玉米粉１０．０ｇ／Ｌ，玉米淀粉１５．０ｇ／Ｌ，黄豆饼粉２０．０ｇ／Ｌ，酵母粉３．０ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰ０４

０．３ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ。・７Ｈ２００．２ｇ／

Ｌ，ＣａＣＯ。０．４ｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ。０．２

ｇ／Ｌ．将初始发酵培养基巾的

图２不同氮源对苏云金芽孢杆菌芽孢产量的影响

８个组分作为影响因素进行全面考察，选择８因子２水平的实

验设计，以ｘ。、咒、ｘ。、Ｘ。、ｘ，、ｘ。、ｘ。。、ｘ。。分别代表玉米粉、玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉、Ｋ：ＨＰＯ。、

ＭｇＳＯ。・７Ｈ。Ｏ、ＣａＣＯｓ、ＺｎＳＯ。，用Ｘｓ、Ｘ。、Ｘ。代表虚拟因子以减少误差．每个因子取高（＋１）和低（一１）两个水平（见表１），通过不同的组合观察发酵液中芽孢的含量，实验设计方案及结果见表２．

表１

水平

一１

ｌ

Ｐｌａｃｋｅｔｔ・Ｂｕｒｍａｎ实验设计因子与水平

Ｘ２

ｇ／Ｉ。

Ｘｌｏ０．４０．５０

Ｘ１Ｉ０．２０．２５

Ｘｌ

１０．Ｏ１２．５０

Ｘ４

２０．０２５．００

Ｘｓ３．０３．７５

Ｘ７０．３０．３８

Ｘ８０．２０．２５

１５．０１８．７５

实验数据由ＳＡＳ软件的２水平设计并分析各个因子的主效应，即在其他因子不变的情况下，某因子的变化对响应值的影响，数据处理和验证结果见表３，可知输入因子玉米淀粉、酵母粉、黄豆饼粉在置信区间内对发酵液芽孢产量的影响很大，为显著性因子，三者的重要性排序为：玉米淀粉、酵母粉、

黄豆饼粉．

７８

福建师范大学学报（自然科学版）表２

Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验设计方案及相应值

表３Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验分析结果

２．３爬坡路径方法确定发酵培养基重要影响因子的最适质量浓度范围

从Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ实验结果可知玉米淀粉、黄豆饼粉和酵母粉是影响发酵液芽孢产量的重要因子，三者的模型方程系数均为正数，对芽孢的产量有积极作用．对３种重要影响因子进行爬坡路径实验，确定此３种因子的最适质量浓度范围，结果见表４．随玉米淀粉、黄豆饼粉和酵母粉质量浓度的增加，发酵液芽孢含量的变化趋势先上升后下降．当玉米淀粉２０．０ｇ／Ｌ，黄豆饼粉２７．５ｇ／Ｌ，酵母粉５．５ｇ／Ｌ时，对应的发酵液芽孢含量达到最大值，为３因子的最大响应值区域，以此为中心点进行响应面分析．

表４爬坡法路径实验设计及结果

２．４响应面分析法确定发酵培养基最佳质量浓度配方

响应面分析法是一种寻找多因子系统中最佳条件的数学统计方法，其中Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ和Ｂｏｘ—Ｗｉｌ—ｓｏｎ中心组合设计是两种较常用的响应面分析法（ＲＳＡ）【１２－１引．根据相应的实验设计进行实验后，对数据进行二次回归拟合，得到带交互项和平方项的二次方程，最后在一定的水平范围内求出最佳值，然后进行数学模型验证．通过爬坡路径法确定发酵培养基３种重要影响因子质量浓度范围后，以玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉３种因子为自变量，以发酵液中芽孢的产量为响应值，实验因素与水平见表５，

第２期杨梅等：苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９发酵培养基的优化

７９

根据Ｂｏｘ—Ｂｅｈｎｋｅｎ中心组合设计原理，设计３因子３水平的响应面分析实验，中心点设置３次重复．实验方案及实验结果见表６．

运用ＳＡＳＲＳＲＥＧ程序对１５个实验点的响应面值进行回归分析，得二次多项式方程：Ｙ。一４．０５８

３３３—０．０１５６２５Ｘｌ一０．０２８１２５Ｘ２—０．０１８７５Ｘ３—０．５０７２９２Ｘ１２＋０．０６８７５Ｘ１Ｘ２＋０．０３７５Ｘ１Ｘ３—０．０３２２９２Ｘ２２—０．０７５Ｘ２Ｘ３—０．２７６

０４２Ｘ３２，决定系数Ｒ２—０．９６３２，表明模型能解释９６．３２％发酵液

中芽孢含量的变化，回归拟合程度较好．

通过软件分析得到３种重要影响因子之间的响应面分析图和相应的等高图（见图３一图５）．任意两个因子与响应面ｙ值之间的关系可通过三维与二维图形立体直观地表现出来．

表５响应分析法设计因子及水平列表

ｇ／Ｌ

表６响应分析法实验设计及结果

实验序号

ｌ２３４５６７８

３一

芽孢数／（１０７‘ｍｌ。－１）

３．６２５３．４７５３．４２５３．５５０

３．７００

鼠一一●一ｌ

一１

１１ｏ

ｏ

咒一一２一ｌ

１

ｘ．一ｏ

ｏｏｏ

—１

１一ｌ一１ｌ１

ｏ

一ｌ１

３．９００３．７５０３。６５０３．３７５３．３００３．１７５３．２５０４．１７５４．０５０３．９５０

ｏｏ

一１

ｌ

—１

ｌ

一１一ｌ

１ｌ

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ｌ

ｏ

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垢

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图３一Ａ显示，在Ｘ。（玉米淀粉）质量浓度为最佳值１８．５ｇ／Ｌ时，随着Ｘ：（黄豆饼粉）质量浓度的增加发酵液芽孢含量没有明显变化，说明在一定范围内黄豆饼粉质量浓度的变化对发酵液芽孢含量的变化没有显著的影响．在Ｘ。（黄豆饼粉）质量浓度为高水平或者低水平时，随着Ｘ。（玉米淀粉）质量浓度的增加，发酵液芽孢含量先增加后降

图３玉米淀粉和黄豆饼粉响应分析法分析图和相应的等高图

低，表明玉米淀粉含量的变化对发酵液中芽孢的产量有一定的影响．图３～Ｂ表明Ｘ。（玉米淀粉）与Ｘ。（黄豆饼粉）两因子交互作用不太显著，等高图的圆心对应的值存在着一个最佳值．

图４一Ａ显示Ｘ。（酵母粉）在最佳质量浓度５．５ｇ／Ｌ时，随着Ｘ。（玉米淀粉）随着质量浓度的增加，发酵液的芽孢含量先增加再减少，说明高质量浓度或低质量浓度的玉米淀粉都不利于发酵液芽孢量的增加．当Ｘ。（玉米淀粉）的质量浓度在低水平或高水平时，随着Ｘ。（酵母粉）质量浓度的增加发酵液中芽孢

８０

福建师范大学学报（自然科学版）

含量先增加再减少，表明为酵母粉的质量浓度对芽孢的产生有一定的影响，或高或低都对芽孢的产生不利．图４一Ｂ显示Ｘ，（玉米淀粉）与Ｘ。（酵母粉）两因子交互作用的等高图谱，表明两者交互作用显著．

图５一Ａ表明，当Ｘ。（黄豆饼粉）处于图中所示的质量浓度范围时，随着Ｘ。（酵母粉）质量浓度的增加，发酵液中芽孢含量先增加后降低；而当酵母粉质量浓度一定时，随着黄豆饼粉质量浓度的升高，发酵液中芽孢的产量没有明显变化，由此可见，在一定质量浓度范围内黄豆饼粉质量浓度变化对发酵液芽孢含量基本没有影响．酵母粉和黄豆饼粉都属于氮源，从芽孢含量上分析，图中所示两者的质量浓度作为氮源已经足够．酵母粉除了作为氮源外，还含有

图５黄豆饼粉和酵母粉响应分析法分析图和相应的等高图图４玉米淀粉和酵母粉响应分析法分析图和相应的等高图

丰富的维生素，随着其质量浓度的升高，芽孢产量先增加后降低，可见维生素对芽孢产量的增加有一定的影响．图５一Ｂ显示Ｘ。（黄豆饼粉）与Ｘ。（酵母粉）两因子交互作用不显著．

３模型验证

从数学模型得到玉米粉的最佳质量浓度是２０．０ｇ／Ｌ，黄豆饼粉的最佳质量浓度是２６．７ｇ／Ｌ，酵母粉的最佳质量浓度是５．５ｇ／Ｌ．根据模型得到发酵培养基各组分的最适比例进行发酵，芽孢产最为４．２５０×１０７／ｍＬ，与初始培养基芽孢产量３．４１０×１０７／ｍＬ相比，提高ｒ２４．６％．实验结果证明优化后的培养基使发酵液苏云芽孢杆菌的芽孢产量得到较大的提高．

４讨论

发酵培养基优化的常用方法有单因子法和正交实验设计法，单因子法只针对某一因子的影响，不考虑发酵培养基多种组分间的交互作用，难以取得发酵培养基优化的最佳结果．正交实验设计主要侧重如何合理地安排实验，同时也考虑发酵培养基的多种因子间的交互作用，寻求各因子水平的最佳组合．但它不能得出整个区域因子和响应值之间的一个明确的函数表达式，从而难以确定整个区域ｆ＝因子的最佳组合和响应值的最佳组合．响应面分析法是一种数学统计方法，用于研究多凶子系统中因子交互作用达到最大响应值时所对应的最佳条件．虽然它与过去推广的“正交实验法”均建立在正交设计原理的基础上，但响应面分析法更有效．国内外不少学者通过响应面分析法在发酵培养基优化方面取得了良好效果．本实验通过单因子实验确定苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９发酵培养基的碳氮源，采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ—Ｂｕｒｍａｎ设计法快速地从发酵培养基的众多因素中筛选出对芽孢产量影响最大的３种重要因子．使用爬坡路径方法确定了重要影响因子的质量浓度范围，最后与响应面方法相结合快速、有效地对苏云金芽孢杆菌ＬＬＢｌ９液体发酵培养基中的重要影响因子进行了优化，得到最佳培养基配方为：玉米淀粉２０．０ｇ／Ｌ，黄豆饼粉２６．７ｇ／Ｌ，酵母粉５．５ｇ／Ｌ，Ｋ２ＨＰ０４

ＣａＣＯ。０．４ｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ．０．２

０．３ｇ／Ｌ，ＭｇＳ０４・７Ｈ２００．２ｇ／Ｌ，

ｇ／Ｌ．Ｂｔ产伴孢晶体特性赋予其具有杀虫活性，是一种新型的微生物杀虫

剂，但通过调整发酵培养配方提高苏云金芽孢杆菌伴孢晶体产量的报道较少，因此优化Ｂｆ发酵培养基

配方显得非常重要，本研究的结果对于苏云金芽孢杆菌在工业发酵上的应用有重要意义．

第２期杨梅等：苏云金芽孢杆菌ＬＩ。Ｂ１９发酵培养基的优化

８１

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（责任编辑：陈力勤）

苏云金芽孢杆菌LLB19发酵培养基的优化

作者：作者单位：

杨梅， 张峰， 苏新华， YANG Mei， ZHANG Feng， SU Xin-hua

杨梅,YANG Mei(福建师范大学生命科学学院,福建,福州,350108;福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建,福州,350002)， 张峰,ZHANG Feng(福建师范大学生命科学学院,福建,福州,350108)， 苏新华,SU Xin-hua(福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建,福州,350002)

福建师范大学学报（自然科学版）

JOURNAL OF FUJIAN NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE EDITION)2009,25(2)

刊名：英文刊名：年，卷(期)：

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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_fjsfdxxb200902017.aspx