说 明 书
去除甘蔗宿根矮化病的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种去除甘蔗宿根矮化病的方法。 背景技术
甘蔗宿根矮化病是一种由细菌引起的病害，繁殖、生产和推广脱毒种苗是防止种苗带病传播，是提高甘蔗产量和糖分的一项重要举措，去除甘蔗宿根矮化病原物方法已在澳大利亚、美国、巴西、古巴、南非、菲律宾及中国台湾省等地应用多年。
现有去除甘蔗宿根矮化病生产甘蔗健康种苗多采用温水浸泡种茎或温水浸泡结合茎尖组培技术脱除甘蔗宿根矮化病的病原。
然而，温水浸泡的温度通常为50—52℃，该温度极为接近甘蔗芽的临界致死温度，另外老芽和嫩芽能承受的温度也不一样，温度过低脱毒效果差，温度过高，又容易导致甘蔗芽死亡。而茎尖脱毒培养技术需要取的茎尖大小为0.1—0.2mm，此法需要精密的仪器以及对操作人员的要求比较高，这与市场要求的低成本，高效率不相符合。
发明内容
本发明的目的是针对上述存在问题，提供一种去除甘蔗宿根矮化病的方法，达到优化甘蔗病原物脱除流程，提高效率的目的，为甘蔗去除宿根矮化病技术提供新的方法。
本发明的具体步骤如下：
1、大田选材
在大田选择正常生长的甘蔗植株。
2、腋芽培养
采用常规腋芽培养技术诱导甘蔗腋芽的丛生芽，且腋芽苗是在透光的耐热塑料袋中进行培养，以备后续脱毒使用，以下简称“袋培腋芽苗”。
3、袋培腋芽苗温水脱毒
袋培腋芽苗温水脱毒生产流程：将水浴锅的温度调到50-52℃→通电加热至
设定温度→将袋培腋芽苗整体直接浸没于水浴锅中60-120min→经抽检合格的袋培腋芽苗→按生产数量需求进行后续的继代增殖、生根及假植移栽等常规生产程序→获得计划数量的合格健康种苗。
上述的无菌操作步骤、继代增殖、病原物检测及生根培养等甘蔗健康种苗培育程序均为本领域的技术人员所熟知，即为本领域技术人员的公知常识，培养的条件和配方也与常规的甘蔗健康种苗相同。
传统的甘蔗宿根矮化病去除程序为：
1、甘蔗种茎→温水脱毒处理→病原物检测→无病种苗扩繁。
2、甘蔗种茎→温水脱毒处理→在38℃下催芽→茎尖培养→病原物检测→
无病种苗扩繁。
本发明的甘蔗健康种苗生产程序为：甘蔗种茎→腋芽培养→袋装腋芽苗温水脱毒处理→病原物检测→无病种苗扩繁
从上述流程可见，与传统的甘蔗健康种苗生产程序相比较，本发明的有益效果：本发明直接用袋装的甘蔗腋芽苗进行温水脱毒处理，克服了因甘蔗老芽和嫩芽能承受的温度不一样，无法准确控制温度及茎尖培养技术需要取的茎尖大小为0.1—0.2mm，需要精密的仪器和高素质的操作人员的缺点，因此本发明的去除甘蔗宿根矮化病方法可以达到优化生产程序、降低技术操作门槛和降低生产成本的目的。
附图说明
图1是本发明去除甘蔗宿根矮化病流程示意图。
具体实施方式
实施例1：
为了便于理解，在描述具体的实施例之前，先对本发明的原理进行一个简单的介绍。
下面描述一个依据上述原理并采用袋培腋芽苗直接温汤去除甘蔗宿根矮化病实施例，其包括如下步骤：
1、大田选材
在甘蔗生产大田选取正常生长的甘蔗植株，为确保试验的准确性，选取经检
测已感染宿根矮化病的甘蔗植株。
2、腋芽培养
切取上述已感染宿根矮化病的甘蔗植株的蔗稍部位，在接种室中经过无菌操作步骤，逐层剥开包裹的叶鞘，每剥开一片叶鞘，即露出一个带腋芽的节位，用无菌手术刀切取该带腋芽的节,置于丛生芽诱导培养基上进行丛生芽的诱导。丛生芽诱导培养基为液体。大约培养30-45天即可诱导出丛生腋芽苗，在接种室中将丛生腋芽苗转接至透光的聚丙烯塑料袋中进行继代培养。继代培养基为液体。
3、袋培腋芽苗温水脱毒
袋培腋芽苗温水脱毒生产流程：首先将水添加至水浴锅体积的大约3/4处→将水浴锅的温度调到50.5℃→通电加热至50.5℃→将袋培腋芽苗整体直接浸没于水浴锅中120min→经抽检合格的袋培腋芽苗→按生产数量需求进行后续的继代增殖、生根及假植移栽常规生产程序→获得计划数量的合格健康种苗。
上述的无菌操作步骤、继代增殖、病原物检测及生根培养等甘蔗健康种苗培育程序均为本领域的技术人员所熟知，培养的条件和配方也与常规的甘蔗健康种苗相同。（请补充两个实施例的实验数据，包括样本中阳性的比例，经过处理之后阳性的比例，加热对于腋芽苗的成活率等是否有影响，以实验数据说明）
表1 不同处理温度、不同处理时间对去除甘蔗宿根矮化病的影响
处理温抽检数量（袋） 60分钟阳性（袋） 90分钟阳性（袋） 120分钟阳性（袋） 度（℃）
50.0 50 32 25 21 50.5 50 13 5 0 51.0 50 6 3 0 51.5 50 5 2 0 52.0 50 0 0 0 ck 50 50 注：本试验甘蔗宿根矮化病的检测方法为斑点酶标免疫试验法(DB-EIA)检测RSD病菌 表2不同处理温度、不同处理时间对袋培腋芽苗成活率的影响
处理温处理数量（袋） 度（℃）
50.0
50.5
51.0
51.5 50 50 50 50 60分钟成活率（℅） 100.0 100.0 71.2 65.1 90分钟成活率（℅） 100.0 95.3 51.4 45.5 120分钟成活率（℅） 95.8 90.6 42.8 20.1
52.0
ck 50 50 0 100.0 0 100.0 0 100.0 注：成活率数据为每袋成活率的平均数。
实施例2：
该实施例中，步骤1和步骤3及后续育苗程序均同实施例1，所不同的是步骤2，现具体介绍如下：
2、腋芽培养
⑴浸种催芽
将已感染宿根矮化病的甘蔗植株剥掉蔗叶后在自来水下冲洗干净，切成单芽段，用浓度1‰的甲基多布菌溶液进行浸种消毒30min后置于温度38℃的人工气候箱中催芽7-10天。
⑵温室培养
切取上述催芽了7-10天的腋芽，在接种室中经过无菌操作步骤，逐层去除包裹的心叶，取出腋芽的顶端生长点组织1-2㎜进行离体培养，该培养基为固体培养基。培养30-45天即可诱导出丛生芽，将丛生芽转接至聚丙烯塑料袋中进行继代增殖培养。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
表3 不同处理温度、不同处理时间对去除甘蔗宿根矮化病的影响
处理温抽检数量（袋） 60分钟阳性（袋） 90分钟阳性（袋） 120分钟阳性（袋） 度（℃）
50.0 50 25 15 10 50.5 50 9 3 0 51.0 50 4 2 0 51.5 50 3 1 0 52.0 50 0 0 0 ck 50 50 注：本试验甘蔗宿根矮化病的检测方法为斑点酶标免疫试验法(DB-EIA)检测RSD病菌 表4 不同处理温度、不同处理时间对袋培腋芽苗成活率的影响
处理温处理数量（袋） 度（℃）
50.0
60分钟成活率（℅） 100.0 50 90分钟成活率（℅） 100.0 120分钟成活率（℅） 91.5
50.5
51.0
51.5
52.0
ck 50 50 50 50 50 100.0 70.3 63.2 0 100.0 92.4 48.3 43.5 0 100.0 88.6 40.3 18.4 0 100.0 注：成活率数据为每袋成活率的平均数。
1、去除甘蔗宿根矮化病的方法，包括如下步骤：甘蔗主栽品种或新品种生长正常植株，其中包括已感染宿根矮化病的甘蔗植株→取蔗稍腋芽或全茎腋芽→诱导腋芽苗丛生芽→腋芽苗丛生芽转接至塑料袋进行继代增殖→甘蔗腋芽苗温水脱毒处理→甘蔗宿根矮化病病原物检测→无病种苗增殖扩繁，进行常规后续生产流程→获得预期规格数量的健康种苗，其特征在于：直接用温水脱毒处理诱导出的甘蔗腋芽苗，所述的温水温度为50-52℃之间。
2、根据权利要求1所述的去除甘蔗宿根矮化病的方法，其特征在于：所述甘蔗腋芽苗温水脱毒处理，处理时间60min-120min。
3、根据权利要求2所述的去除甘蔗宿根矮化病的方法，其特征在于：所述水浴锅的温度设置为50.5℃，处理时间为120min。
4、根据权利要求1至3所述的去除甘蔗宿根矮化病的方法，其特征在于：所述的塑料袋为透光的聚丙烯材料制作。
5、去除甘蔗宿根矮化病的方法，包括如下步骤：
（1）大田选材：在甘蔗生产大田选取正常生长的甘蔗植株，包括经检测已感染宿根矮化病的甘蔗植株；
（2）腋芽培养：切取上述已感染宿根矮化病的甘蔗植株的蔗稍部位，在接种室中经过无菌操作步骤，逐层剥开包裹的叶鞘，每剥开一片叶鞘，即露出一个带腋芽的节位，用无菌手术刀切取该带腋芽的节,置于丛生芽诱导培养基上进行丛生芽的诱导，所述的丛生芽诱导培养基为液体；培养30-45天即可诱导出丛生腋芽苗，在接种室中将丛生腋芽苗转接至透光的聚丙烯塑料袋中进行继代培养，继代培养基为液体；
（3）袋培腋芽苗温水脱毒：袋培腋芽苗温水脱毒生产流程：首先将将水浴锅的温度设定50.5℃→通电加热至50.5℃→将袋培腋芽苗整体直接浸没于水浴锅中120min→经抽检合格的袋培腋芽苗→按生产数量需求进行后续的继代增殖、生根
及假植移栽常规生产程序→获得计划数量的合格健康种苗。
6、去除甘蔗宿根矮化病的方法，包括如下步骤：
（1）大田选材：在甘蔗生产大田选取正常生长的甘蔗植株，包括经检测已感染宿根矮化病的甘蔗植株；
（2）腋芽培养：将已感染宿根矮化病的甘蔗植株剥掉蔗叶后在自来水下冲洗干净，切成单芽段，用浓度1‰的甲基多布菌溶液进行浸种消毒30min后置于温度38℃的人工气候箱中催芽7-10天；切取上述催芽了7-10天的腋芽，在接种室中经过无菌操作步骤，逐层去除包裹的心叶，取出腋芽的顶端生长点组织1-2㎜进行离体培养，该培养基为固体培养基；培养30-45天诱导出丛生芽，将丛生芽转接至聚丙烯塑料袋中进行继代增殖培养；
（3）袋培腋芽苗温水脱毒：袋培腋芽苗温水脱毒生产流程：首先将水浴锅的温度设定50.5℃→通电加热至50.5℃→将袋培腋芽苗整体直接浸没于水浴锅中120min→经抽检合格的袋培腋芽苗→按生产数量需求进行后续的继代增殖、生根及假植移栽常规生产程序→获得计划数量的合格健康种苗。
本发明公开了去除甘蔗宿根矮化病的方法，利用甘蔗袋培腋芽苗直接进行温汤脱毒处理，从而达到去除甘蔗宿根矮化病病原物目的。相较于甘蔗种茎温汤脱毒和甘蔗种茎温汤处理结合茎尖培养脱毒等甘蔗脱毒方法，具有操作简便，降低技术操作门坎，对技术、设备和人员的要求相对较低，易于规模化生产的特点。
图1
说 明 书
去除甘蔗宿根矮化病的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种去除甘蔗宿根矮化病的方法。 背景技术
甘蔗宿根矮化病是一种由细菌引起的病害，繁殖、生产和推广脱毒种苗是防止种苗带病传播，是提高甘蔗产量和糖分的一项重要举措，去除甘蔗宿根矮化病原物方法已在澳大利亚、美国、巴西、古巴、南非、菲律宾及中国台湾省等地应用多年。
现有去除甘蔗宿根矮化病生产甘蔗健康种苗多采用温水浸泡种茎或温水浸泡结合茎尖组培技术脱除甘蔗宿根矮化病的病原。
然而，温水浸泡的温度通常为50—52℃，该温度极为接近甘蔗芽的临界致死温度，另外老芽和嫩芽能承受的温度也不一样，温度过低脱毒效果差，温度过高，又容易导致甘蔗芽死亡。而茎尖脱毒培养技术需要取的茎尖大小为0.1—0.2mm，此法需要精密的仪器以及对操作人员的要求比较高，这与市场要求的低成本，高效率不相符合。
发明内容
本发明的目的是针对上述存在问题，提供一种去除甘蔗宿根矮化病的方法，达到优化甘蔗病原物脱除流程，提高效率的目的，为甘蔗去除宿根矮化病技术提供新的方法。
本发明的具体步骤如下：
1、大田选材
在大田选择正常生长的甘蔗植株。
2、腋芽培养
采用常规腋芽培养技术诱导甘蔗腋芽的丛生芽，且腋芽苗是在透光的耐热塑料袋中进行培养，以备后续脱毒使用，以下简称“袋培腋芽苗”。
3、袋培腋芽苗温水脱毒
袋培腋芽苗温水脱毒生产流程：将水浴锅的温度调到50-52℃→通电加热至
设定温度→将袋培腋芽苗整体直接浸没于水浴锅中60-120min→经抽检合格的袋培腋芽苗→按生产数量需求进行后续的继代增殖、生根及假植移栽等常规生产程序→获得计划数量的合格健康种苗。
上述的无菌操作步骤、继代增殖、病原物检测及生根培养等甘蔗健康种苗培育程序均为本领域的技术人员所熟知，即为本领域技术人员的公知常识，培养的条件和配方也与常规的甘蔗健康种苗相同。
传统的甘蔗宿根矮化病去除程序为：
1、甘蔗种茎→温水脱毒处理→病原物检测→无病种苗扩繁。
2、甘蔗种茎→温水脱毒处理→在38℃下催芽→茎尖培养→病原物检测→
无病种苗扩繁。
本发明的甘蔗健康种苗生产程序为：甘蔗种茎→腋芽培养→袋装腋芽苗温水脱毒处理→病原物检测→无病种苗扩繁
从上述流程可见，与传统的甘蔗健康种苗生产程序相比较，本发明的有益效果：本发明直接用袋装的甘蔗腋芽苗进行温水脱毒处理，克服了因甘蔗老芽和嫩芽能承受的温度不一样，无法准确控制温度及茎尖培养技术需要取的茎尖大小为0.1—0.2mm，需要精密的仪器和高素质的操作人员的缺点，因此本发明的去除甘蔗宿根矮化病方法可以达到优化生产程序、降低技术操作门槛和降低生产成本的目的。
附图说明
图1是本发明去除甘蔗宿根矮化病流程示意图。
具体实施方式
实施例1：
为了便于理解，在描述具体的实施例之前，先对本发明的原理进行一个简单的介绍。
下面描述一个依据上述原理并采用袋培腋芽苗直接温汤去除甘蔗宿根矮化病实施例，其包括如下步骤：
1、大田选材
在甘蔗生产大田选取正常生长的甘蔗植株，为确保试验的准确性，选取经检
测已感染宿根矮化病的甘蔗植株。
2、腋芽培养
切取上述已感染宿根矮化病的甘蔗植株的蔗稍部位，在接种室中经过无菌操作步骤，逐层剥开包裹的叶鞘，每剥开一片叶鞘，即露出一个带腋芽的节位，用无菌手术刀切取该带腋芽的节,置于丛生芽诱导培养基上进行丛生芽的诱导。丛生芽诱导培养基为液体。大约培养30-45天即可诱导出丛生腋芽苗，在接种室中将丛生腋芽苗转接至透光的聚丙烯塑料袋中进行继代培养。继代培养基为液体。
3、袋培腋芽苗温水脱毒
袋培腋芽苗温水脱毒生产流程：首先将水添加至水浴锅体积的大约3/4处→将水浴锅的温度调到50.5℃→通电加热至50.5℃→将袋培腋芽苗整体直接浸没于水浴锅中120min→经抽检合格的袋培腋芽苗→按生产数量需求进行后续的继代增殖、生根及假植移栽常规生产程序→获得计划数量的合格健康种苗。
上述的无菌操作步骤、继代增殖、病原物检测及生根培养等甘蔗健康种苗培育程序均为本领域的技术人员所熟知，培养的条件和配方也与常规的甘蔗健康种苗相同。（请补充两个实施例的实验数据，包括样本中阳性的比例，经过处理之后阳性的比例，加热对于腋芽苗的成活率等是否有影响，以实验数据说明）
表1 不同处理温度、不同处理时间对去除甘蔗宿根矮化病的影响
处理温抽检数量（袋） 60分钟阳性（袋） 90分钟阳性（袋） 120分钟阳性（袋） 度（℃）
50.0 50 32 25 21 50.5 50 13 5 0 51.0 50 6 3 0 51.5 50 5 2 0 52.0 50 0 0 0 ck 50 50 注：本试验甘蔗宿根矮化病的检测方法为斑点酶标免疫试验法(DB-EIA)检测RSD病菌 表2不同处理温度、不同处理时间对袋培腋芽苗成活率的影响
处理温处理数量（袋） 度（℃）
50.0
50.5
51.0
51.5 50 50 50 50 60分钟成活率（℅） 100.0 100.0 71.2 65.1 90分钟成活率（℅） 100.0 95.3 51.4 45.5 120分钟成活率（℅） 95.8 90.6 42.8 20.1
52.0
ck 50 50 0 100.0 0 100.0 0 100.0 注：成活率数据为每袋成活率的平均数。
实施例2：
该实施例中，步骤1和步骤3及后续育苗程序均同实施例1，所不同的是步骤2，现具体介绍如下：
2、腋芽培养
⑴浸种催芽
将已感染宿根矮化病的甘蔗植株剥掉蔗叶后在自来水下冲洗干净，切成单芽段，用浓度1‰的甲基多布菌溶液进行浸种消毒30min后置于温度38℃的人工气候箱中催芽7-10天。
⑵温室培养
切取上述催芽了7-10天的腋芽，在接种室中经过无菌操作步骤，逐层去除包裹的心叶，取出腋芽的顶端生长点组织1-2㎜进行离体培养，该培养基为固体培养基。培养30-45天即可诱导出丛生芽，将丛生芽转接至聚丙烯塑料袋中进行继代增殖培养。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
表3 不同处理温度、不同处理时间对去除甘蔗宿根矮化病的影响
处理温抽检数量（袋） 60分钟阳性（袋） 90分钟阳性（袋） 120分钟阳性（袋） 度（℃）
50.0 50 25 15 10 50.5 50 9 3 0 51.0 50 4 2 0 51.5 50 3 1 0 52.0 50 0 0 0 ck 50 50 注：本试验甘蔗宿根矮化病的检测方法为斑点酶标免疫试验法(DB-EIA)检测RSD病菌 表4 不同处理温度、不同处理时间对袋培腋芽苗成活率的影响
处理温处理数量（袋） 度（℃）
50.0
60分钟成活率（℅） 100.0 50 90分钟成活率（℅） 100.0 120分钟成活率（℅） 91.5
50.5
51.0
51.5
52.0
ck 50 50 50 50 50 100.0 70.3 63.2 0 100.0 92.4 48.3 43.5 0 100.0 88.6 40.3 18.4 0 100.0 注：成活率数据为每袋成活率的平均数。
1、去除甘蔗宿根矮化病的方法，包括如下步骤：甘蔗主栽品种或新品种生长正常植株，其中包括已感染宿根矮化病的甘蔗植株→取蔗稍腋芽或全茎腋芽→诱导腋芽苗丛生芽→腋芽苗丛生芽转接至塑料袋进行继代增殖→甘蔗腋芽苗温水脱毒处理→甘蔗宿根矮化病病原物检测→无病种苗增殖扩繁，进行常规后续生产流程→获得预期规格数量的健康种苗，其特征在于：直接用温水脱毒处理诱导出的甘蔗腋芽苗，所述的温水温度为50-52℃之间。
2、根据权利要求1所述的去除甘蔗宿根矮化病的方法，其特征在于：所述甘蔗腋芽苗温水脱毒处理，处理时间60min-120min。
3、根据权利要求2所述的去除甘蔗宿根矮化病的方法，其特征在于：所述水浴锅的温度设置为50.5℃，处理时间为120min。
4、根据权利要求1至3所述的去除甘蔗宿根矮化病的方法，其特征在于：所述的塑料袋为透光的聚丙烯材料制作。
5、去除甘蔗宿根矮化病的方法，包括如下步骤：
（1）大田选材：在甘蔗生产大田选取正常生长的甘蔗植株，包括经检测已感染宿根矮化病的甘蔗植株；
（2）腋芽培养：切取上述已感染宿根矮化病的甘蔗植株的蔗稍部位，在接种室中经过无菌操作步骤，逐层剥开包裹的叶鞘，每剥开一片叶鞘，即露出一个带腋芽的节位，用无菌手术刀切取该带腋芽的节,置于丛生芽诱导培养基上进行丛生芽的诱导，所述的丛生芽诱导培养基为液体；培养30-45天即可诱导出丛生腋芽苗，在接种室中将丛生腋芽苗转接至透光的聚丙烯塑料袋中进行继代培养，继代培养基为液体；
（3）袋培腋芽苗温水脱毒：袋培腋芽苗温水脱毒生产流程：首先将将水浴锅的温度设定50.5℃→通电加热至50.5℃→将袋培腋芽苗整体直接浸没于水浴锅中120min→经抽检合格的袋培腋芽苗→按生产数量需求进行后续的继代增殖、生根
及假植移栽常规生产程序→获得计划数量的合格健康种苗。
6、去除甘蔗宿根矮化病的方法，包括如下步骤：
（1）大田选材：在甘蔗生产大田选取正常生长的甘蔗植株，包括经检测已感染宿根矮化病的甘蔗植株；
（2）腋芽培养：将已感染宿根矮化病的甘蔗植株剥掉蔗叶后在自来水下冲洗干净，切成单芽段，用浓度1‰的甲基多布菌溶液进行浸种消毒30min后置于温度38℃的人工气候箱中催芽7-10天；切取上述催芽了7-10天的腋芽，在接种室中经过无菌操作步骤，逐层去除包裹的心叶，取出腋芽的顶端生长点组织1-2㎜进行离体培养，该培养基为固体培养基；培养30-45天诱导出丛生芽，将丛生芽转接至聚丙烯塑料袋中进行继代增殖培养；
（3）袋培腋芽苗温水脱毒：袋培腋芽苗温水脱毒生产流程：首先将水浴锅的温度设定50.5℃→通电加热至50.5℃→将袋培腋芽苗整体直接浸没于水浴锅中120min→经抽检合格的袋培腋芽苗→按生产数量需求进行后续的继代增殖、生根及假植移栽常规生产程序→获得计划数量的合格健康种苗。
本发明公开了去除甘蔗宿根矮化病的方法，利用甘蔗袋培腋芽苗直接进行温汤脱毒处理，从而达到去除甘蔗宿根矮化病病原物目的。相较于甘蔗种茎温汤脱毒和甘蔗种茎温汤处理结合茎尖培养脱毒等甘蔗脱毒方法，具有操作简便，降低技术操作门坎，对技术、设备和人员的要求相对较低，易于规模化生产的特点。
图1