血凝抑制（HI ）试验操作规程
1. 仪器、设备和试剂的准备
1.1仪器及设备
V 型96孔血凝板、微量振荡器、低速台式离心机、含25μL的单道加样器、含25μL的八道加样器、小圆底试管、吸管。
1.2抗原和试剂：1.2.1相应HI 抗原1.2.2相应阳性血清
1.2.3生理盐水、阿氏液（血球保护液）1.2.41%鸡红细胞悬液1.2.4.1红细胞的采集从2-6月龄SPF 公鸡翅静脉采集血液与等量的阿氏液混合（采集后上下颠倒使血液和阿氏液混匀，防止凝血）1.2.4.2红细胞的洗涤将于阿氏液混合的血液，分装于圆底试管中，以1000rpm 离心5分钟，吸弃阿氏液；加入适量生理盐水轻轻吸打将红细胞充分混合，以1500rpm 离心5-10分钟，吸弃上清液时，应注意吸弃红细胞表面的白细胞层，并应尽量吸净上清液。按上述步骤，用生理盐水对红细胞进行洗涤三次，最后一次洗涤应1500rpm 离心10分钟（确保红细胞的压积）。
1.2.4.3吸弃上清液，将沉淀的红细胞吸取1ml ，加入99ml 生理盐水摇匀配制成1%的红细胞悬液。（按照需要量配制）
1.2.4.41%红细胞悬液的标定对首次配制的红细胞悬液应进行标定，取配制好的红细胞悬液60ml ，自然沉降后，弃掉上部生理盐水50ml ，混匀后装入刻度离心管中，1000rpm 离心5分钟，红细胞压积应为0.6ml 2．HI 抗原工作液配制2.1HI 抗原血凝价测定血凝试验：
1．取一块V 型96孔板，按表1每孔加入生理盐水25ul ，将HI 抗原进行系列倍比稀释，至11孔后吸取25ul 弃去，第12孔为对照，稀释后每孔再加入25ul 生理盐水，最后每孔加入1%鸡红细胞悬液25ul ，微量振荡器中速摇匀，置于室温（20—25℃），20~30分钟后判定结果，以能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。
表1
孔号：滴度：
病毒血凝试验561:321:642525
2525
71:1282525
8910111:2561:5121:10241:20482525
2525
2525
2525
12对照
11:221:42525
31:82525
41:162525
25生理盐水
红细胞悬液25
2525
轻轻振荡1-2min 置于20~25℃静置20-25min 后判定结果
图1
如图1所示为禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的血凝价测定，第9孔为能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数，因此该禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原血凝价为1:5122.2HI 抗原工作液配制及检验2.2.14HA 100单位的抗原配制
4个100%血凝单位（即4HA 100）抗原的稀释倍数=使100%红细胞凝集的抗原最高稀
释倍数/4
图1所示禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的4HA 100单位的抗原=512/4=1282.2.24HA 100单位抗原的检验
4HA 100单位抗原的检验按表2进行。检查血凝价是否准确，应将配置好的4HA 100单
位的抗原再用生理盐水稀释，使其稀释度为1:2、1:3、1;4、1:5、1:6、1:7。将每一稀释度的抗原25ul 加入生理盐水25ul ，最后加入1%鸡红细胞悬液25ul ，用微量振荡器中速振匀，置室温（20~25℃），20~30分钟后判定结果。
将血凝板在20~25℃下放置20~30分钟后，如果1:4稀释度是100%红细胞凝集终点，
说明配制的是4HA 100单位的抗原；如果100%红细胞凝集终点是1:5或1:6说明配制的4HA 100单位抗原实际上高于4个单位；如果100%红细胞凝集终点是1:2或1:3说明配制的4HA 100单位抗原实际上低于4个单位。使用时应根据检验结果做适当调整，使抗原工作液确为4HA 100单位
表14HA 100
单位抗原的检验孔号：
4HA 100抗原的稀释度
稀释的4HA 100抗原生理盐水
1%鸡红细胞悬液
轻轻振荡1-2min
11:2252525
21:3252525
31:4252525
41:5252525
51:6252525
61:7252525
置于20~25℃静置20-25min 后判定结果
2.2.34HA 100单位抗原的调整
稀释倍数=使100%红细胞凝集终点的稀释倍数x 原4HA 100单位抗原的稀释倍数/4
图2
如图2所示，使100%红细胞凝集终点的稀释倍数为1:3，说明配制的4HA 100单位抗原实际上低于4个单位，所以调整后的4HA 100单位抗原稀释倍数=使100%红细胞凝集终点的稀释倍数x 原4HA 100单位抗原的稀释倍数/4=3X 128/4=96
按1:96稀释禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原，制成4HA 100单位抗原。
3．血凝抑制试验（HI ）
3.1取96孔微量反应板，分别向1~12孔中加入25ul 生理盐水。
3.2吸取25ul 待检血清，加至第一孔内，充分混匀后，吸取25ul 至第二孔，依次2倍稀释至第十孔，从第十二孔中吸取25ul 弃去。
3.3每块板上设置标准阳性对照和阴性对照，稀释方法同3.23.4分别向1~12孔中加入含4HA 100单位的抗原25ul ，微量振荡器中速混匀后室温（20~25℃左右）静置20~30分钟。
3.5每孔中加入25ul 1%鸡红细胞悬液，微量振荡器上轻轻震荡均匀，室温下（20~25℃）静置20~30分钟。3.6结果判定凝集现象表现为红细胞平铺在V 型管底壁，凝集严重时红细胞膜片边缘可能出现卷边现象。未凝集的红细胞在V 型血凝孔中呈现为明显的红色圆点。将反应板倾斜45度角后判定结果，当红细胞呈现泪滴状流淌且没有凝集颗粒时为100%抑制。当阴性血清HI 效价≤2log 2、阳性血清HI 效价与已知结果相比误差≤1log 2时，试验方可成立。
以完全抑制4HA 100单位抗原凝集的血清最高稀释度作为HI 效价。
表3
孔号：
血清稀释倍数生理盐水被检血清4HA 100抗原
96孔板微量法血凝抑制试验5
6
71:1282525
8
9
10
11
12对照25
11:2252525
21:4252525
31:82525
41:162525
1:321:[1**********]:2561:5121:10241:2048
[***********]
25
轻轻振荡1-2min
红细胞悬液
置于20~25℃
25
25
25
25
静置20-25min 后加入红细胞悬液25
25
25
25
25
25
25
25
轻轻振荡1-2min 置于20~25℃静置20-25min 后判定结果
图3
如图3所示，抗体1完全抑制4HA 100单位抗原凝集的血清最高稀释度为第10孔，故其效价为1:1024；抗体2和抗体3完全抑制4HA 100单位抗原凝集的血清最高稀释度为第9孔，其效价为1:512，阴性血清完全凝集，阳性血清与已知效价一致，因此该结果成立。附：
阿氏液配方：葡萄糖2.05克柠檬酸钠0.8克柠檬酸0.055克氯化钠0.42克
加蒸馏水至100毫升，调PH 值至6.1，115度，10分钟灭菌。4度保存。使用比例：静脉血液与阿氏液1:1。PBS 1L 配方pH7.4：
磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.28g ，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.15g ，氯化钠(NaCl)：8g ，加去离子水定容到1L 。抗凝剂配方：柠檬酸钠3.8g
加蒸馏水至100毫升，10分钟灭菌。4度保存。使用比例：静脉血液与抗凝剂1:9。
血凝抑制（HI ）试验操作规程
1. 仪器、设备和试剂的准备
1.1仪器及设备
V 型96孔血凝板、微量振荡器、低速台式离心机、含25μL的单道加样器、含25μL的八道加样器、小圆底试管、吸管。
1.2抗原和试剂：1.2.1相应HI 抗原1.2.2相应阳性血清
1.2.3生理盐水、阿氏液（血球保护液）1.2.41%鸡红细胞悬液1.2.4.1红细胞的采集从2-6月龄SPF 公鸡翅静脉采集血液与等量的阿氏液混合（采集后上下颠倒使血液和阿氏液混匀，防止凝血）1.2.4.2红细胞的洗涤将于阿氏液混合的血液，分装于圆底试管中，以1000rpm 离心5分钟，吸弃阿氏液；加入适量生理盐水轻轻吸打将红细胞充分混合，以1500rpm 离心5-10分钟，吸弃上清液时，应注意吸弃红细胞表面的白细胞层，并应尽量吸净上清液。按上述步骤，用生理盐水对红细胞进行洗涤三次，最后一次洗涤应1500rpm 离心10分钟（确保红细胞的压积）。
1.2.4.3吸弃上清液，将沉淀的红细胞吸取1ml ，加入99ml 生理盐水摇匀配制成1%的红细胞悬液。（按照需要量配制）
1.2.4.41%红细胞悬液的标定对首次配制的红细胞悬液应进行标定，取配制好的红细胞悬液60ml ，自然沉降后，弃掉上部生理盐水50ml ，混匀后装入刻度离心管中，1000rpm 离心5分钟，红细胞压积应为0.6ml 2．HI 抗原工作液配制2.1HI 抗原血凝价测定血凝试验：
1．取一块V 型96孔板，按表1每孔加入生理盐水25ul ，将HI 抗原进行系列倍比稀释，至11孔后吸取25ul 弃去，第12孔为对照，稀释后每孔再加入25ul 生理盐水，最后每孔加入1%鸡红细胞悬液25ul ，微量振荡器中速摇匀，置于室温（20—25℃），20~30分钟后判定结果，以能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。
表1
孔号：滴度：
病毒血凝试验561:321:642525
2525
71:1282525
8910111:2561:5121:10241:20482525
2525
2525
2525
12对照
11:221:42525
31:82525
41:162525
25生理盐水
红细胞悬液25
2525
轻轻振荡1-2min 置于20~25℃静置20-25min 后判定结果
图1
如图1所示为禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的血凝价测定，第9孔为能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数，因此该禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原血凝价为1:5122.2HI 抗原工作液配制及检验2.2.14HA 100单位的抗原配制
4个100%血凝单位（即4HA 100）抗原的稀释倍数=使100%红细胞凝集的抗原最高稀
释倍数/4
图1所示禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的4HA 100单位的抗原=512/4=1282.2.24HA 100单位抗原的检验
4HA 100单位抗原的检验按表2进行。检查血凝价是否准确，应将配置好的4HA 100单
位的抗原再用生理盐水稀释，使其稀释度为1:2、1:3、1;4、1:5、1:6、1:7。将每一稀释度的抗原25ul 加入生理盐水25ul ，最后加入1%鸡红细胞悬液25ul ，用微量振荡器中速振匀，置室温（20~25℃），20~30分钟后判定结果。
将血凝板在20~25℃下放置20~30分钟后，如果1:4稀释度是100%红细胞凝集终点，
说明配制的是4HA 100单位的抗原；如果100%红细胞凝集终点是1:5或1:6说明配制的4HA 100单位抗原实际上高于4个单位；如果100%红细胞凝集终点是1:2或1:3说明配制的4HA 100单位抗原实际上低于4个单位。使用时应根据检验结果做适当调整，使抗原工作液确为4HA 100单位
表14HA 100
单位抗原的检验孔号：
4HA 100抗原的稀释度
稀释的4HA 100抗原生理盐水
1%鸡红细胞悬液
轻轻振荡1-2min
11:2252525
21:3252525
31:4252525
41:5252525
51:6252525
61:7252525
置于20~25℃静置20-25min 后判定结果
2.2.34HA 100单位抗原的调整
稀释倍数=使100%红细胞凝集终点的稀释倍数x 原4HA 100单位抗原的稀释倍数/4
图2
如图2所示，使100%红细胞凝集终点的稀释倍数为1:3，说明配制的4HA 100单位抗原实际上低于4个单位，所以调整后的4HA 100单位抗原稀释倍数=使100%红细胞凝集终点的稀释倍数x 原4HA 100单位抗原的稀释倍数/4=3X 128/4=96
按1:96稀释禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原，制成4HA 100单位抗原。
3．血凝抑制试验（HI ）
3.1取96孔微量反应板，分别向1~12孔中加入25ul 生理盐水。
3.2吸取25ul 待检血清，加至第一孔内，充分混匀后，吸取25ul 至第二孔，依次2倍稀释至第十孔，从第十二孔中吸取25ul 弃去。
3.3每块板上设置标准阳性对照和阴性对照，稀释方法同3.23.4分别向1~12孔中加入含4HA 100单位的抗原25ul ，微量振荡器中速混匀后室温（20~25℃左右）静置20~30分钟。
3.5每孔中加入25ul 1%鸡红细胞悬液，微量振荡器上轻轻震荡均匀，室温下（20~25℃）静置20~30分钟。3.6结果判定凝集现象表现为红细胞平铺在V 型管底壁，凝集严重时红细胞膜片边缘可能出现卷边现象。未凝集的红细胞在V 型血凝孔中呈现为明显的红色圆点。将反应板倾斜45度角后判定结果，当红细胞呈现泪滴状流淌且没有凝集颗粒时为100%抑制。当阴性血清HI 效价≤2log 2、阳性血清HI 效价与已知结果相比误差≤1log 2时，试验方可成立。
以完全抑制4HA 100单位抗原凝集的血清最高稀释度作为HI 效价。
表3
孔号：
血清稀释倍数生理盐水被检血清4HA 100抗原
96孔板微量法血凝抑制试验5
6
71:1282525
8
9
10
11
12对照25
11:2252525
21:4252525
31:82525
41:162525
1:321:[1**********]:2561:5121:10241:2048
[***********]
25
轻轻振荡1-2min
红细胞悬液
置于20~25℃
25
25
25
25
静置20-25min 后加入红细胞悬液25
25
25
25
25
25
25
25
轻轻振荡1-2min 置于20~25℃静置20-25min 后判定结果
图3
如图3所示，抗体1完全抑制4HA 100单位抗原凝集的血清最高稀释度为第10孔，故其效价为1:1024；抗体2和抗体3完全抑制4HA 100单位抗原凝集的血清最高稀释度为第9孔，其效价为1:512，阴性血清完全凝集，阳性血清与已知效价一致，因此该结果成立。附：
阿氏液配方：葡萄糖2.05克柠檬酸钠0.8克柠檬酸0.055克氯化钠0.42克
加蒸馏水至100毫升，调PH 值至6.1，115度，10分钟灭菌。4度保存。使用比例：静脉血液与阿氏液1:1。PBS 1L 配方pH7.4：
磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.28g ，磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.15g ，氯化钠(NaCl)：8g ，加去离子水定容到1L 。抗凝剂配方：柠檬酸钠3.8g
加蒸馏水至100毫升，10分钟灭菌。4度保存。使用比例：静脉血液与抗凝剂1:9。