多粘类芽孢杆菌 (1)

多粘类芽孢杆菌

1. 基本特性

1.1中文通用名称：多粘类芽孢杆菌

1.2英文通用名称（或拉丁名称）：Paenibacillus polymyxa 1.3毒性：低毒

1.4应用作物：棉花、玉米、水稻、花生、马铃薯、黄瓜、青椒

1.5防治对象：棉花黄萎、黑根腐、炭疽病、赤霉病；玉米全蚀病；水稻白叶枯病；花生青枯病；马铃薯软腐病；黄瓜角斑；青椒疮痂

1.6生防特点：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa) 对植物黄萎病、鹰嘴豆枯萎病、油菜腐烂病、黑松根腐病等多种植物病害均具有一定的控制作用。美国环境保护署(EPA)已将其列为可商业上应用的微生物种类之一。无论是采用HY96-2（P. polymyxa ）发酵液，还是由HY96-2制成的细粒剂(KDLD)，在温室内和田间都取得了稳定的防治效果，并且KDLD 细粒剂在田间表现的效果更为突出。

2. 定性鉴别试验

2.1菌株的形态及培养特征

类芽孢杆菌属。菌株接种于 LB固体培养基上，28ºC 培养 18～24 h，观察其菌落形态。利用光学显微镜观察在LB 培养基上生长菌体形状和革兰氏染色情况，利用电镜观察菌体大小、荚膜和鞭毛着生情况。菌体大小为(0．6～ 0．8) μm ×(2．0～5．0) μm ，革兰氏阳性、阴性或可变，兼性厌氧，杆状，产芽孢，芽孢椭圆形，端生，膨大，有荚膜，鞭毛侧生或周生。在 PDA平板上，菌落较小、白色或淡黄色、圆形、菌面稍凸或不凸起，边缘整齐，表面有光泽、光滑、湿润、半透明到不透明；在肉汁琼脂培养基上生长菌落较薄，无菌膜，液体澄清；在斜面培养基上生长良好，菌苔线状、扁平，表面光滑、半透明。最适合生长温度30-35 ºC

表1 菌株在不同培养基中的培养特征（30ºC ，2天）培养特性菌落颜色菌落形状菌落直径mm

2.2生理生化特征

LB 琼脂乳白色湿润光滑 2.5

营养琼脂杏仁白色粘稠状 2.8

酵母浸膏琼脂淡黄白色有小突起，粘性 3

牛肉汁琼脂灰白色湿润光滑 2.6

由表 2可知，菌株的接触酶、厌氧生长、酪朊水解、淀粉水解、V —P 反应和硝酸盐还原均为阳性；氧化酶、酪氨酸水解、脲酶、卵黄卵磷脂水解、吲哚产生、柠檬酸盐利用均为阴性；可利用 D 葡萄糖、D 一木糖、D 一甘露醇、甘油，且均产酸、产气。菌株在pH 5．6条件下生长；在45℃上不生长。超过7%含量的NaCl 中不生长。

表2 生理生化特征

接触酶厌氧生长 D 一葡萄糖 D 一木糖 D 一甘露醇甘油酪朊水解淀粉水解酪氨酸水解脲酶试验卵黄卵磷脂水解 V —P 反应吲哚产生硝酸盐还原柠檬酸盐利用氧化酶 2%NaCL 7%NaCL 45ºC 50 ºC 55 ºC

+ + ++ ++ ++ ++ + + - - - + - + - - + - - - -

注：“+”．阳性，“一”．阴性；“++”．产酸、产气。

2.3 16S rDNA片断扩增和序列分析

（1）基因组DNA 的提取：当菌株在LB 液体培养基培养至 OD 600=0．8时，离心收集菌体，采用 CTAB 法提取基因组DNA

（2）16S rDNA片断的扩增：以提取的基因组DNA 作为模板，采用扩增细菌 16S rDNA 的一对通用引物。正向引物 16Sf ：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG；反向引物 16Sr ：ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT。这对引物可扩增约 1．6 kb的16S rDNA全序列。

（3）PCR 反应体系(30 L)为：10×Buffer(Mg。 )2．5 ttL，10 mmol／L dNTP 2 ttL。10 ttmol／L 引物各 1 L，Taq 酶 0．15 L，模板 1 L，ddH2O 22．35 L。（4）PCR 程序为；95℃：4 min；94C 1 min，56 C 1 min，72 C 2 min，循环 30次；72 C 20 min 。将 PCR 产物用质量分数1的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为 1×TAE ，选取 Lambda DNA／EcoR I+Hind m Marker一3作为 Marker 。（5）克隆与筛选：将PCR 产物经DNA 胶回收试剂盒纯化后，连接克隆载体pUCm —T ，转化到大肠杆菌(Escherichia coli DH 5a)，在加有Amp ／IPTG ／X —Gal 的LB 平板上进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落，进行PCR 鉴定，分析插入片段的大小，挑出重组克隆

（6）DNA 序列测定：将重组克隆测序。

（7）菌株16Sr DNA序列系统发育树的构建：将测序所得序列与GenBank 中核酸数据库进行 BLAST 同源序列检索，然后利用 DNAMAN Version 5．1 软件中的 Multiple Sequence Alignment 程序进行多序列同源性分析并构建系统发育树。与已知多粘类芽孢杆菌同处一个最小分支且同源性超过98%可以确定为多粘类芽孢杆菌。

3. 多粘类芽孢杆菌定量分析

3.1 试剂与溶液 3.1.1 无菌水、蒸馏水；

3.1.2 酵母浸膏培养基（用于鉴别与计数）：

蔗糖 1.0％酵母浸膏 0.45％ KH 2PO 4 0.05％ MgSO 4·7H 2O 0.05％ NaCl 0.05％琼脂粉 1.5～1.6％

pH 7.2～7.4 121℃高压蒸汽灭菌15-20min 。 3.2 仪器

显微镜、天平（精确至0.01g ）、量筒、搪瓷缸、电炉、pH 计、酒精灯、无菌三角烧瓶和培养皿（90mm ）、超净工作台、培养箱（30±1）℃。 3.3 检验步骤

3.3.1平板培养基的制备：待融化后的培养基冷却至45℃左右后，在超净工作台中迅速将此培养基倒于无菌培养皿内，待凝固后备用。

3.3.2 在超净工作台中称取试样10.0g （精确至0.01g ）放入装有90mL 无菌水的灭菌三角烧瓶中（瓶内预先加有玻璃珠20个左右），在30℃的旋转式摇床上以150r/min充分振荡0.5h ，即得1：10的菌悬液母液。

3.3.3 用无菌移液管吸取上述1：10的稀释液5ml 于45ml 无菌水中，充分振荡，混合均匀，得到1：102的稀释液。另取一支灭菌移液管，按上述顺序操作，直到比所需最高稀释度低一个数量级为止。则分别得到一系列稀释度的稀释液(每个稀释度必须更换无菌移液管) 。

3.3.4 选择1:106、1:107、1:108、1:109 4个连续的稀释度，分别用移液器吸取0.1mL 稀释液于平板培养基上，并用无菌玻璃刮刀在琼脂表面均匀涂布，每个稀释度5个重复。将涂布均匀的平板培养基置于30℃的培养箱中培养24h ～36h 后进行计数。

3.3.5结果计算

以平板上出现30个～300个菌落数的稀释度平板为计数标准。

当只有一个稀释度的平均菌落数在30个～300个之间时，则以该平均菌落数为计数标准。

若有两个稀释度，其平均菌落数均在30个～300个之间，应按两者菌落总数之比值来决定。如其比值小于2应计数两者的平均值，若大于2则以其中稀释较小的为计数标准。

若四个稀释度的平均菌落数均大于300个，则应以稀释度最高的平均菌落数为计数标准。

若四个稀释度的平均菌落数均小于30个，则应以稀释度最低的平均菌落数

为计数标准。

若四个稀释度的平均菌落数均不在30个～300个之间，则以最接近300个或30个的平均菌落数为计数标准。

根据式（1）计算试样中多粘类芽孢杆菌总数：

多粘类芽孢杆菌活菌总数（c f u /g ）＝菌落平均数×总稀释倍数×

…

（

）

3.3.6 结果报告

多粘类芽孢杆菌活菌总数在100个以内时，按其实有数报告；大于100个时，采用两位有效数字，取其算术平均值为检验结果。 3.4 杂菌率计算

按GB/T 4789.2—2003中的菌落总数测定方法进行。

根据菌落特征判定，并按下式计算出试样中杂菌率：杂菌数

杂菌率=------------------------------------------ ×100 多粘类芽孢杆菌数+杂菌数