细菌纤维素在医学领域的应用
摘要:纳米纤维素是一种新型的高分子功能材料, 具有独特的结构和优良的性能。主要涉及细菌纤维素, 植物纤维素和纤维素纳米复合物的制备。细菌纤维素（BC ）是某些细菌产生的纯度很高的纳米级纤维素，与植物纤维素相比，具有三维纳米网状结构、高结晶度、高纯度、高机械强度和良好生物相容性等独特的性质。BC 作为一种新型的生物医学材料，在人造血管、组织工程支架材料和伤口敷料等领域具有良好的应用前景。但是BC 的大规模产业化应用还存在一些问题，如成本高、产量低和机械稳定性差等需要解决。本文介绍了近年来对于纳米纤维素在医学方面的用途以及研究进展。
关键词：细菌纤维素；人工血管；组织工程支架；人工角膜
Abstract ：Cellulose is a new kind of polymer functional materials, has a unique structure and excellent performance. Mainly related to bacterial cellulose, plant cellulose and cellulose nano compound preparation. Bacterial cellulose (BC) is a certain bacteria to produce high purity nano-sized cellulose, compared with the plant cellulose, with three dimensional nano reticular structure, high crystallinity, high purity, high mechanical strength and good biocompatibility and other unique properties. BC as a new type of biomedical material, in artificial blood vessels, tissue engineering scaffold material, and the wound dressings, and other fields has a good application prospect. But BC large-scale industrialization application still has some problems, such as high cost, low yield and poor mechanical stability need to be solved. This paper introduces the in recent years
Key words：Bacterialcellulose ;Artificial blood vessels ; Tissue engineering scaffolds ; Artificial cornea,
引言：纤维素主要由植物的光合作用合成, 是自然界取之不尽, 用之不竭的可再生天然高分子。近年来随着石油、煤炭储量的下降、石油价格的飞速增长、各国对环境污染问题的日益关注和重视, 以及可再生资源在科技、医学、技术等方面的发展, 纤维素的应用正愈来愈受到重视[1]。
纤维素具有很多优越的性质, 如亲水性、手性、生物可降解性, 以及广泛的化学改性能力。纤维素大分子之间, 纤维素和水分子之间, 或者纤维素大分子内部都可以形成氢键, 而这些大规模的氢键网状结构组成了纤维素的半晶体光纤形态[2]。
纤维素的来源主要是植物。棉花几乎是纯的纤维素, 而木材等则是由纤维素、木质素、半纤维素、果胶等其它碳水化合物的混合体。除了植物以外, 动物、特
定的细菌、海藻、真菌等也能生成纤维素。其中目前已知的合成纤维素能力最强的微生物菌株为木醋杆菌, 它已经被广泛应用于实验室研究细菌纤维素(BC)。
细菌纤维素的分子结构与植物纤维素基本相同, 但其重要的结构特征和性质使它的实际应用意义远远大于植物纤维素。细菌纤维素具有高纯度、高聚合度(高达8000) 、高结晶度、高含水量和高力学稳定性等重要性质。而这些性质都是由于它在水介质中形成的特定网状纳米超分子结构所引起的。类似于BC 那样具有纳米尺度的纤维素被称为纳米纤维素, 它也包括纳米尺度的纤维素晶须和纳米纤维素复合物。
1. 纳米纤维素的制备
1. 1 用细菌制备纳米纤维素
1886年,Brown 首次报道了由木醋杆菌(Acetobacterxylinum)合成了一种胞外呈凝胶状的物质, 但由于无合适的实验手段以及产量较低, 因此未受到重视。细菌纤维素(BC)引起人们更多的注意是在20世纪后期, 而深入的研究则是从Hestrin 和Schramm 等的研究开始的, 他们证明了静止和冻干的醋酸细菌细胞在有葡萄糖和氧时能够合成纤维素, 并且研究出了一种特殊的培养基, 使木葡糖酸醋杆菌在实验条件下最优化产出纤维素[3]。BC 的生物合成是一个很复杂的过程, 从尿苷二磷酸葡萄糖开始, 经过4个主要的酶催化反应, 最终转化为纤维素长链分子。
细菌纤维素相对于植物纤维素的优越性在于:(1)它是一种纯纤维素, 具有高化学纯度和高结晶度, 而植物纤维主要由纤维素组成, 但它掺杂其它许多糖类, 如半纤维素或木质素;(2)它的弹性模量为一般植物纤维的数倍至十倍以上, 并且抗张强度高;(3)有很强的持水能力、较高的生物适应性和良好的生物可降解性;(4)生物合成过程可调控。这使细菌纤维素在食品工业、造纸工业、化妆品、聚合物增强、无机物合成等许多方面有很大的应用价值。
1. 2 用植物制备纳米纤维素
相对于细菌纤维素来说, 植物纤维素必须经过化学处理或者机械粉碎才能得到纳米尺度的纤维素。
1. 2. 1 物理处理 1980年, 用高速搅拌机处理木浆,Thrbak 等研究出了一种微
纤维化的纤维素, 得到了纳米级的网状结构的纤维素, 其纤维直径在10～ 100nm之间, 可以用于制备透明的高强度纳米复合物。将竹子纤维及其单纤维用石盘高速研磨, 并结合热碱的预处理,Takahashi 等[4]以竹子为原料制得了微纤化的纤维素。
1. 2. 2 化学处理 化学处理植物体来制备纳米纤维素的最主要方法是酸或碱的水解, 也包括用表面活性剂或生物酶来处理。
Li 等[5]将桑葚枝条预处理并漂白后, 用100mL 64w/w%的硫酸溶液在60℃下水解10g 漂白后的纤维, 加冷却水停止反应并进行离心, 再重复的将沉淀搅拌悬浮再离心, 直到变成胶状的悬浮液。将胶体透析并用超声波处理后, 在4℃下冷冻并加氯仿来避免细菌生长。在悬浮液中, 纤维素晶须的重量份数为1w/w%。AFM 表征了纤维素晶须的形态(见图1), 有42. 4%的晶须直径范围在25-30nm, 晶须长度大约在400～ 500nm。
图1 用硫酸溶液处理制备的纤维素晶须的AFM 图像
Figure 1 AFM image of cellulose whiskers prepared by the treatment of sulfuric acid solution [5]
越来越多的人趋向于寻找不同于传统纤维素来源的其他原材料。Zuluaga 等
[6]用四种不同的酸碱配比方法处理了香蕉茎, 并得到了纤维素微纤。实验显示, 当碱的浓度提高时, 木质素等非纤维素物质大多被除去。其原因是木质素等非纤维素成分与纤维素的相互关系不仅仅是表面联系,
而是分子链之间相互交联。所以
足够浓度的碱溶液使得纤维素微纤溶胀, 有利于杂质的分离。
还有一种方法是酶解, 即利用纤维素酶选择性地酶解掉无定形的纤维素而剩下部分纤维素晶体。Brumer 等[7]研究通过转糖基酶以化学和酶同时改性的方式活化纳米纤维素晶体表面, 从而不至于在纤维素晶体表面修饰的同时破坏基元原纤和晶体内部结构。
2 纳米纤维素的应用
纳米纤维素是一种纯天然的生物材料, 它在生物方面的用途极为广泛, 包括生物传感器的制造, 生物载体, 生物医学材料, 无机材料的生物模板, 和无机材料复合制备生物活性的组织学支架, 磁性药物载体, 甚至工业净化等等, 几乎所有纳米纤维素所应用的领域都涉及到了其生物特性[8,9]。
纳米纤维素具有很好的生物适应性以及其纳米尺度的特殊结构, 在生物载体方面体现出了巨大的潜力。Ioelovich 等[10]介绍了一种纳米纤维素载体的制备方法。这种方法包括:在控制条件下将最初的纤维素解聚, 对其进行结构和化学的改性, 以便使多种生物活性物质能嫁接到纤维素颗粒上以及在液体介质中将纤维素颗粒高强度机械瓦解。因此, 有生物活性的纳米纤维素就被分离出来了。由于是纳米级别, 有生物活性的纤维素颗粒能清理皮肤的毛孔, 打开气孔, 穿过皮下的脂质层和上皮层。生物载体的该功效可以被应用到高级生物材料或者用于高级护理及皮肤治疗的化妆药物。
纳米纤维素可以作为酶的固定化及生物活性分子的载体, 应用吸附则可以大大的拓宽其使用范围。Tabuchi [11]介绍了一种新的对生物分子(DNA和蛋白质等) 敏感的探测体系, 利用CD 光盘和生物纳米纤维集成在实验室芯片上。这种新方法通过利用纳米尺度的纤维和孔, 限制特定的细菌纤维素纤维片段组成了一个控制CD 烧制的微通道。与现行的通用方法相比, 检测DNA 的最大敏感度是传统方法的6倍。
3 细菌纤维素在医学材料上的应用
细菌纤维素由于具有独特的生物亲和性、生物相容性、生物可降解性、生物适应性和无过敏反应, 以及高的持水性和结晶度、良好的纳米纤维网络、高的张力和强度, 尤其是良好的机械韧性, 因此在组织工程支架、人工血管、人工皮肤
以及治疗皮肤损伤等方面具有广泛的用途, 是国际生物医用材料研究的热点之
一。研究发现, 细菌纤维素在活体中还未发现有任何排异反应和炎症发生, 这种优越的生物适应性引起了人们的广泛兴趣。细菌纤维素在伤口抗菌敷料、人工移植物以及人工血管领域都有很好的用途。
3. 1 组织工程支架
已有很多天然生物材料，如多聚糖、胶原、无机及生物衍生材料等用于组织工程支架的研究，这些材料都表现出良好的生物相容性。相比较而言，ＢＣ具有很好的力学性能、持水性、生物相容性、广泛的温度适应性和ｐＨ稳定性，同时具有多孔形态和可降解性。目前，已开展ＢＣ在骨组织工程支架、人工角膜等方面的研究，如表１所示。
组织工程学包括对细胞, 生物或人工支架的应用, 也包括了细胞和生物反应器。多聚糖如壳聚糖, 透明质酸和它们的天然来源很有利于组织工程学支架研究, 因为他们有很好的生物相容性, 可以刺激细胞生长, 并且可以控制细胞支架的相互作用。现在的趋势显示出了对组织制备的力学性能的重视, 因此人们有兴趣在力学作用下把细胞-支架组成暴露在活性的生物传感器中。相比之下, 用木醋杆菌制备的纳米纤维素被发现很适用于做支架材料, 因为它很好的力学性能, 持水性能, 生物相容性和它的在广泛温度和pH 范围内的稳定性。另外, 很好的多孔性形态和与胶原蛋白的相似性使得细菌纤维素对于细胞固定, 细胞移居和多孔模板的制备来说是很有吸引力的[12]。由木醋杆菌合成的BC 由完全纯净的纤维素纳米微纤组成。BC 有很高的机械强度, 三维的网状结构。纤维素基的材料几乎不引起排异反应和炎症, 被认为是有生物相容性的。
Gisela 等[13]以老鼠作为实验品, 测定了BC 的生物适应性。他们将BC
移植到
老鼠的皮下, 保持时间为1,4和12周。没有发现慢性炎症或排异反应。BC 和周围的组织结合在一起, 血管及内皮细胞都在BC 的周围生长, 并且开始推开BC 纤维向移植物的内部生长。4周后, 扩散性的细胞消失,BC 与周围的组织混合在一起, 延长的成纤维细胞进入BC 的波浪状结构内部, 并且开始产生胶原蛋白，经过12个星期的观察, 没有发现宏观的炎症反应(也就是说没有很多的小细胞包围着移植物或血管), 也没有出现纤维化, 胶囊化或者巨细胞。成纤维细胞渗入BC 中,BC 和主组织很好地融合在一起, 并没有引起任何排异反应。BC 的生物适应性很好, 而且这种材料在组织工程学中用于支架是有很大潜力的。
Bodin [12]评估了细菌纤维素作为组织工程学支架中软骨、骨头、特别是血管的适用性。他发现培养方法对支架形态的影响和选择会明显的影响其力学性能和细胞附着性能, 以及细胞在材料内的生长。同时, 他也研究了一些多聚糖材料作为水凝胶或多孔结构的适用性, 但发现它们在生物反应器中无法提供有效的对细胞的机械支撑。相反的, 由木醋杆菌生产的纳米纤维素则很适用于支架材料, 因为它有很好的机械性质, 持水性, 生物适应性和在大范围温度和pH 内的稳定性。Bodin 还研究了模仿生物的方法来表面改性细菌纤维素, 可以提高细胞粘附性和影响细胞分化, 以及调整纤维素支架的多孔性和机械性能的培养过程[14]。
Rambo [15]用促进合成的方法制备了可控的多孔纳米纤维素薄膜, 方法为将木醋杆菌在适合的培养基中在静态条件下培养。用由聚苯乙烯(= 300μm) 或光学纤维(= 60μm) 组成的直径为60～ 300μm 的针状模板浸泡在溶液中固定在培养基中来形成原位孔。在针状物的周围发生生物合成纤维素, 在纤维素薄膜上出现小孔。移去模板后, 在50℃下干燥生物薄膜24个h 。在孔形成后,BC 薄膜的物理化学性质, 如结晶度、溶胀和拉伸强度没有很大的变化。微结构显示薄膜基质是由长的纳米纤维分布在表面组成的。纤维素薄膜内形成的圆形孔的直径在60～ 300μm, 随着针状模板的不同而变化。这些孔显示边缘没有缺陷。微孔薄膜可以用于修复组织, 特别是修复高氧化率或伤口挛缩延迟的组织。
3. 2 医学移植
在美国, 每年都有超过500000的人工合成移植物被移植入人体。对血管外壁的重建和替代的移植手术在近五年来明显增加了90%～ 75%,细菌合成纤维素管(BASYC)的高纯度、高含水量、天生的水凝胶结构的稳定性、纳米纤维网状结构、
液体离子的可渗透性、小分子量和近似于生物组织表面使得BASYC 可以用于制造新型的生物移植物。
Schumann [16]将BASYC 植入动物中进行长期观察, 研究了BASYC 的植入对老鼠颈动脉的影响。激光扫描显微镜显示BASYC 的内表面很光滑, 类似于天然的颈动脉。SEM 显示证实了内皮细胞化的同质活性。BASYC 内侧的成纤维细胞产出了胶原蛋白。
医学移植中很重要的一部分是客户定制的特征和纤维素纳米支架的可控改性。这个支架通过羟基功能化的外表面, 纳米纤维结构的底表面, 以及大孔体系与环境相互作用。因此, 可以吸附和积累水, 其它液体有:有机物、无机试剂、金属和金属氧化物、合成大分子、生物大分子和活细胞[17]。
医学装置设计和制作的一个重要的方面是找到一种适合于做软组织替代的材料, 它不仅仅要和需要替代的软组织有相似的力学性质, 还要有生物活性、生物适应性、不易凝血和钙化度低等特点。聚乙烯醇(PVA)是一种亲水聚合物, 有很多可以用于生物医学应用的性质。PVA 可以被转变成一种固体的水凝胶, 用交联和冻干可以得到很好的力学性能。由木醋杆菌通过发酵制备的亲水BC 纤维的平均直径在50nm,Millon [18,19]将它用于和PVA 联合生成生物兼容的纳米复合物。得到的复合物有很宽的力学性能范围, 可以被制备成和心血管组织力学性能相似的物质, 如主动脉和心脏瓣膜叶。不止一种PVA-BC 纳米复合物的应力应变性质在圆周和轴向组织较好地符合了猪的主动脉的性质。他也制备了和心脏瓣膜组织性质类似的PVA-BC 纳米复合物, 并研究了所有样品的松弛性质, 这是心血管应用中很重要的性质, 研究显示样品都比他们要替代的组织松弛的速度更快, 残余应力更低。这个新型的PVA-BC 复合物在心血管软组织替代应用中有很好的应用前景。
最近众多文章报道到细菌纳米纤维素网络能被光聚合的聚丙烯酸脂网络和聚甲基丙烯酸酯网络包裹或填充。通过改变单体类型和交联剂浓度, 可以明显改善刚度和水吸收能力。然而, 这种改变导致了不可控制的复合样本和性质的多样性。可以通过逐步优化单体化合物与杨氏模量的关系, 来达到对有类似于软骨的力学性质的复合物类型的控制。用上述步骤复合丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸-2-羟乙酯和N-乙烯基吡咯烷酮的混合物, 产物的模量是5～ 20 MPa。这些数据和天然透明质的软骨相一致[20]。
马霞等[21]公开了一种利用细菌纤维素制备人工硬脑膜的方法, 其步骤是将细菌纤维素湿膜破碎, 得细菌纤维素匀浆; 以细菌纤维素匀浆的含水量为95%～ 98%计, 将所述细菌纤维素匀浆与浓度为7%～15%的聚乙烯醇溶液按照1∶ 1～ 10的比例均匀混合; 然后将混合物均匀的铺在模具中, 并使其厚度为0. 26～ 0. 90mm,置于- 20到- 4℃条件下冷冻20～ 30h;再于真空冷冻干燥机内冻干, 得成形的人工硬脑膜。这种人工硬脑膜在湿态时有良好的弹性和柔韧性, 实验测定:厚度一般为0. 18～ 0. 78mm,渗水率为0, 断裂伸长率为30%～ 98%。缝合时不撕裂, 不脱边。这个方法生产过程环保、生产工艺简单、成本低, 适于推广。
3.3 BC在人工血管上的应用
众所周知, 当血管由于动脉硬化、血管老化或破损等原因不能正常工作时, 需进行血管移植重建。全世界每年要施行的许多血管重建手术由于自体血管来源
有限, 而异体血管强烈的排异作用, 以及来源少和价格昂贵等原因, 常不得不使用人工合成血管作为替代品。目前, 国际临床上使用最广泛的、用于替代大于 6 mm 的人工血管是编织型的涤纶聚酯血管和膨体聚四氟乙烯血管, 这是因为它们结构稳定性好, 在体内可长期工作而不发生降解, 但是它们仍存在着不少缺点和不足, 譬如血栓的形成和新生内膜增厚导致血管堵塞, 至今尚无十分理想的血管替代物。基于同样原因, 用于置换小于 6 mm 的动、静脉血管的人工血管还没有开发成功。临床上是采用自体血管进行修复, 例如冠状动脉搭桥手术。近 30年来, 人们一直在致力于这方面的研究。
2001 年Klemm 等[22]研究了在显 微外科中以BASYC 做为人造血管的可行性。他们利用大鼠微脉管插补术试验发现只有 1mm内径的 BASYC 在湿的状态下具有高的机械强度, 大的持水能力, 低粗糙度的内径以及完善的生物活性等优良特性, 证明了它在显微外科中作为人工血管的巨大应用前景。 2004 年Klemm 等[23 ]进一步证实 BASYC 具有生物活性和相容性。由于具有与天然血管内腔表面类似的平滑度, 因此血管内不会形成血栓, BASYC 完全符合显微外科中人工血管的物理和生物要求。最近, 该课题组[24]将 BASYC长期植入老鼠体内 ( 1年 ), 然后借助组织免疫和电子显微镜等手段研究老鼠的内皮细胞、肌肉细胞、弹性结构和结缔组 织等不同 结构的变 化, 重点 研究植 入的BA SYC 和周围组织接触的区域。
2006 年 Henrik 等[25]研究了细菌纤维素作为潜在的组织工程血管支架的机械性能。通过利用 SEM研究静态培养的细菌纤维素薄膜生长的形态学, 并比较了细菌纤维素、猪动脉血管以及膨体聚四氟乙烯 ( e PTFE) 支架在机械性能上的差异, 结果表明细菌纤维的应变能力与动脉血管相似, 这很可能是由于纳米纤维结构的相似性造成的。通过体外实验研究了人平滑肌细胞在细菌纤维素上的吸附、增殖、向内生长的情况, 结果发现在细菌纤维素上吸附和增殖的平滑肌细胞在培养两个星期后可向内生长 40 Lm。
3.4伤口敷料
皮肤创伤是种常见损伤，快速修复创伤皮肤的有效手段是使用创伤敷料治疗。基于BC 膜的独特纳米结构，与其它伤口敷料相比，BC 具有在潮湿的条件下机械强度高，对气、液和电解质有良好的通透性，皮肤相容性好等特点，这些优良的物理性能有利于皮肤 组 织 的 生 长 和 愈 合，是 一 种 新 型 的 伤 口 敷料，如表2所示。
为了提高BC 作为伤口敷料的功能，研究者们探索很多方法改善BC 膜的性能。如Yu 等在木醋杆菌合成培养基中加入水溶性羧甲基纤维素，制备得到羧甲基BC ，该复合物具备更好的保水能力和断裂应力。Kim 等制备复合物BC/壳聚糖、BC/聚乙二醇和BC/明胶，这些复合物的生物相容性优于BC 。Maneerung 等研究将银纳米粒子吸附在BC 膜上，从而制备具有抗菌活性的伤口敷料，该敷料对大肠杆菌和葡萄球菌均有很强的抗菌能力，开创了BC 制备新型抗菌活性伤口敷料的领域。
3.5 BC 在人工皮肤以及皮肤损伤治疗上的应用
自1987年以来有近10个皮肤伤病医疗单位已报道 400多例应用 BC 膜治疗烧伤、烫伤、褥疮、皮肤移植、创伤和慢性皮肤溃疡等取得成功的实例,
现已
有用其制成的人工皮肤、纱布、绷带和 /创口贴等伤科敷料商品。与其它人工皮肤和伤科敷料相比, 该膜的主要特点是在潮湿情况下机械强度高、对液、气及电解物有良好的通透性、与皮肤相容性好, 无刺激性, 可有效缓解疼痛, 防止细菌的感染和吸收伤口渗出的液体, 促进伤口的快速愈合, 有利于皮肤组织生长。此膜还可作为缓释药物的载体携带各种药物, 利于皮肤表面给药, 促使创面的愈合和康复。
为了应用于皮肤创伤, Sanchavanakit 等[26]利用人类角化细胞和成纤维细胞来评价 BC 膜的潜在生物作用机理。他们研究了从 Nata椰子汁培养基提取的细菌纤维素膜的特性以及人类角化细胞和纤维原细胞在BC 上的生长情况。用平衡发射极晶体管技术 ( BET )测定发现 BC 干膜的平均孔径和总表面积为 224ANG和 12. 62m2/g。一张厚度为0.12mm 的 BC 膜, 干膜的平均抗张强度和断裂强度分别为 5. 21MPa和 3. 75%,而相应的湿膜为1.56MPa 和 8. 00% 。风干 BC膜的吸水量为每克干膜吸水 5. 09g。研究结果直接证明了 BC膜支持人类角化细胞的生长、增生和移动, 但是对成纤维细胞没有作用
Czaja 等[27]研究了 BC在治疗二级和三级烧伤方面的应用前景, 他们对 20个病人做了一项医学研究: 将BC 创伤敷料直接覆盖在新鲜烧伤达 9% ~ 18% 创面上, 接下来观察创伤以及伤口周围环境的变化、观测表皮生长、检测微生物和研究组织病理学。结果显示, BC是一种很好的促进烧伤愈合的材料, 效果好的原因可能是多方面的, 譬如 ( 1) BC 的湿润环境易于组织再生、还可以有效的减轻疼痛, ( 2) 特殊的纳米结构促进细胞相互作用、促进组织再生、减轻疼痛以及减少疤痕组织生成, ( 3) 治疗过程中 BC 有利于在伤口处安全、方便地释放药物。
3.6BC/PVA 制备人工角膜材料
细菌纤维素是天然高分子化合物，它的化学纯度很高，具有精致的三维网状结构，较好的生物相容性和持水性。而且细菌纤维素还具有良好的机械性能，其的机械强度足以维持人的眼内压并可以达到缝合的要求，它可以作为人工角膜的周边支架材料。细菌纤维素虽然具有一定的透明性，但是作为人工角膜材料的光学中心部分来说，还有一定的差距，需要进一步提高其的透明性。角膜作为人眼的屏障，有保护眼内组织的功能，也就是说必须能阻止外界的细菌对眼内组织的
侵染，但是纤维素是一种多糖，易被空气中细菌感染而发霉降解。如果用于人工角膜材料，必须对其进行改性，以提高透明度和抗菌性。
聚乙烯醇(PVA)水凝胶一种水溶性高分子，它与人体组织具有高度的相容性，它无毒、无副作用、无降解，化学性质稳定，机械性能优良，含水量高，易于成 型，在生物医学和工业方面的用途非常广泛[28]。PVA 水凝胶已用作腹膜、透析膜、缓释载体、组织工程支架、人工器官、人工软骨和人工血管等[29]。在眼科方面，聚乙烯醇水凝胶可以用作软性接触眼镜、人工玻璃体和人工角膜等。聚乙烯水凝胶可有多种方法交联而成，主要是化学交联和物理交联两种方法。化学交联是高分子水凝胶材料制备的主要方法之一，由化学键交联形成的三维网络聚合物，要求交联剂必须是能与高分子功能基反应的多官能团化合物或多价金属离子[30]。PVA 水凝胶常用的交联剂有戊二醛、丁二酰、已二酰等[31]。物理交联法是制备医用PVA 水凝胶的常用方法，即冷冻-熔融法。在常温下，PVA 水溶液中的高分子链无规律分布在水相中，当PVA 水溶液冷冻呈固相后，高分子链通过氢键被固定。除氢键外，在冷冻状态下，还形成高分子结晶以及发生相分离，使高分子链的运动受到最大限制；解冻后，部分氢键及结晶被破坏，但是PVA 已部分交联，不再融于水中。在下一次的冷冻过程中，形成新的结晶区，充当新的物理交联点，再次熔融又会破坏部分交联，如此反复冻融处理，得到稳定的物理交联PVA 水凝胶。采用冷冻-熔融的方法，使细菌纤维素与聚乙烯醇复合，利用BC 的“纳米效应”
[32]，制备出具有高透明性，不易被细菌感染，同时具有细菌纤维素与聚乙烯醇优点的复合材料，使细菌纤维素能够用于人工角膜材料。
4 结论
本文以分类讨论的方式对纳米纤维素的制备和应用进行了综述, 主要描述了近年来纳米纤维素研究方面的进展。从纳米纤维素的应用可以预测, 未来其在生物和医学方面的发展将是占主流的。在生物应用中, 纳米纤维素有可能在载体及生物传感器方面有较大的发展; 而在医学领域, 纳米纤维素与无机物进行复合制造人工组织无疑会是一个热点。
生物医学材料由于直接关系到人类的生命与健康, 且面临着全球人口的巨大市场需求, 因而得到世界各国的广泛重视。目前对细菌纤维素的研究主要集中
在附加值较高的医学生物材料上, 例如组织工程支架、骨支架、软骨支架、人工血管、人工皮肤以及药物载体等方面。但是真正能应用到临床上的产品还不多, 大部分的研究还停留在细胞水平和动物实验等初级阶段, 离临床应用仍有一定距离。在我国, 人们对细菌纤维素的了解和认识还不足, 对其研究尚处于初级阶段, 大部分集中在食品、食品添加剂和造纸应用等方面, 在生物医用材料上的开发应用上相关报道较少。由于细菌纤维素具有优秀的生物亲和性、生物相容性、生物适应性和良好的生物可降解性, 因此该纤维素必将成为世界上性能优异的新型生物纳米高技术材料。
目前 BC应用的主要技术障碍一是发酵水平较低, 产量低、成本高、价格不抵普通植物纤维素, 二是进一步研究和利用 BC的成模和成型的工艺技术还没有解决, 三是做为生物医用材料, 其与生物体长期作用效果、体内的降解性、与宿主组织和细胞相容性, 以及在体内时 BC 的机械、物理和化学性能的变化等一系列问题还需要进一步研究。要解决上述问题, 今后的研究方向主要有两个: 一是要研究设计可行的发酵设备及发酵工艺以提高纤维素产量, 降低其成本; 二是要研制开发具有自主知识产权的 BC生物医用材料。
参考文献
[1] Ye D Y,HuangH,Fu Y Q,Chen H Q. J ChemInd Eng,2006,57:1782～ 1791.
[2] Yu B,Zhou H L,Biotechnology Bull,2007,2:87～ 97.
[3] Dieter K,DieterS,FriederikeK,et al. AdvPolym Sci,2006,205:49～ 96.
[4] Takahashi N,OkuboK,Fujii T. Bamboo J,2005,22:81～ 83.
[5] Li R,FeiJ,Cai Y R,Li Y F,et al. Carbohydrate Polym,2009,76:94～ 99.
[6] ZuluagaR,Putaux J L,CruzJ,et al. Carbohydrate Polym,2009,76:51～ 59.
[7] Ye D Y. Prog in Chem,2007,19:1568～ 1575.
[8] Ye D Y,HuangH,Fu Y Q,Chen H Q. J ChemInd Eng,2006,57:1782～ 1791.
[9] Yu B,Zhou H L. Biotechnol Bull.,2007,2:87～ 97.
[10] IoelovichM,Figovsky O. Adv Mater Res,2008,47～ 50.
[11] TabuchiM,KobayashiK,FujimotoM,Baba Y. Lab on a Chip,2005,5:1412～ 1415.
[12] BodinA,BackdahlH,RisbergB,Gatenholm P. Abstracts of Papers,Proceedings of 233rd ACS National Meeting,Chicago,IL,UnitedStates,March 25～ 29,2007,CELL ～ 107.
[13] Gisela H,HentikB,AaseB,et al. J Biomed Mater Res,2006,76:431～ 438..
[14] BodinA,BackdahlH,RisbergB,GatenholmP,Abstracts of Papers,Proceedings of 235th ACS National Meeting,NewOrleans,LA,UnitedStates,April 6-10,2008,CELL-011.
[15] Rambo C R,Recouvreux D O S,Carminatti C A,et al. Mater SciEng C:2008,28:549～ 554.
[16] Schumann D A,Klemm D O,KramerF,et al. Abstracts of Papers,Proceedings of 235th ACS National Meeting,NewOrleans,LA,UnitedStates,April 6-10,2008,CELL-011.
[17] Klemm D O,Schumann D A,KramerF,et al. Abstracts of Papers,Proceedings of 233rd ACS National Meeting,Chicago,IL,UnitedStates,March 25-29,2007,CELL-127.
[18] Millon L E,Wan W K. J Biomed Mater Res,Part B:2006,79B:245～ 253.
[19] Millon L E,GuhadosG,Wan W. J Biomed Mater Res,Part B:2008,86B:444～ 452.
[20] Klemm D O,KramerF,WesargF,et al. Abstracts of Papers,Proceedings of 235th ACS National Meeting,NewOrleans,LA,UnitedStates,April 6-10,2008,CELL-011.
[21] 马霞, 王瑞明, 关凤梅, 王腾飞. 中国专利,CN[1**********]7.5.
[22] Klemm D, S chum ann D, Udhard t U, et a.l Bacterial synthesized cellu lose Oartificia l b lood vessels for microsurgery.Polymer Science, 2001, 26( 9): 1561 ~ 1603
[23] Klemm D, Udhard t U, S chum ann D, et a.l The m ouldedbiomaterial BASYC ( BA cterialSYnthesizedCellu lose ): Ap rom is ing artificial b lood vessel for microsurgical use. In Abstracts of Papers, 227 th ACS National M eeting, Anaheim,CA, Uni ted S tates, 2004. W ash ington, DC: Am ericanChemical Society, 2004, CELL~ 156
[24] S chum ann D, M arsch S, K lemm D, et a.l New results about BASYC ( BActerialSYnthesized C ellu lose ), the p rom is ing artificial b lood vessel for microsurgery and further application of b acterialcellu lose in m edicine. In Abstracts of P apers, 229 th ACS National Meeting, S an Diego, CA, Un ited S tates, 2005.W ash ing ton, DC: American Chemical Society, 2005, CELL ~152
[25] Henrik B, GiselaH, Aase B, et a.l M echanical properties of bacterial cellulose and interaction s with smooth muscle cells. B iomaterials, 2006, 27 (9): 2141~ 2149
[26] San chavanak it N, Sangrungraungro j W, Kaomongkolgi t R, eta.l G rowth of hum an keratinocytes and fib rob lasts on bacterial cellulose film. B iotechnol P rog, 2006, 22( 4 ): 1194~ 1199
[27] Czaja W, Kaweck i M, K rystynowicz A, et a.l App licat ion of bacterial cellulose in treatment of second and third degree burns. In Abstracts of P apers, 227 th ACS National M eeting,Anaheim, CA, Un ited S tates, 2004. W ash ington, DC:AmericanChemical Society, 2004, CELL~ 157
[28] Cascone MG, Laus M, Ricci D, Sbarbati Del Guerra R. Evaluation of poly(vinyl alcohol) hydrogels as a component of hybrid artificial tissues [J]. J Mater Sci Mater Med 1995;6(2):71-75.
[29] Zheng QG, Jiu MX, Xiang HZ. The development of artificial articular cartilage PV A hydrogel [J]. Bio-Med Mater Eng 1998;8(2):75-81.
[30] AlvarezV A,Ruseckaite RA, Vázquez A. Degradation of sisal fibre/Mater Bi-Y biocomposites buried in soil [J]. Polymer DegradStabil 2006;91(12):3156-3162.
[31] Orienti, Trere R, Zecchi V . Hydrogels formed by cross-linked polyvinylalcohol as colon-specific drug delivery systems [J]. Drug DevInd Pharm 2001;27(8):877-884.
[32] Iwamoto S, Nakagaito AN, Yano H, Nogi M. Optically transparent composites reinforced with plant fiber-based nanofibers [J]. ApplPhys Mater Sci Process 2005;81(6):1109-1112.
细菌纤维素在医学领域的应用
摘要:纳米纤维素是一种新型的高分子功能材料, 具有独特的结构和优良的性能。主要涉及细菌纤维素, 植物纤维素和纤维素纳米复合物的制备。细菌纤维素（BC ）是某些细菌产生的纯度很高的纳米级纤维素，与植物纤维素相比，具有三维纳米网状结构、高结晶度、高纯度、高机械强度和良好生物相容性等独特的性质。BC 作为一种新型的生物医学材料，在人造血管、组织工程支架材料和伤口敷料等领域具有良好的应用前景。但是BC 的大规模产业化应用还存在一些问题，如成本高、产量低和机械稳定性差等需要解决。本文介绍了近年来对于纳米纤维素在医学方面的用途以及研究进展。
关键词：细菌纤维素；人工血管；组织工程支架；人工角膜
Abstract ：Cellulose is a new kind of polymer functional materials, has a unique structure and excellent performance. Mainly related to bacterial cellulose, plant cellulose and cellulose nano compound preparation. Bacterial cellulose (BC) is a certain bacteria to produce high purity nano-sized cellulose, compared with the plant cellulose, with three dimensional nano reticular structure, high crystallinity, high purity, high mechanical strength and good biocompatibility and other unique properties. BC as a new type of biomedical material, in artificial blood vessels, tissue engineering scaffold material, and the wound dressings, and other fields has a good application prospect. But BC large-scale industrialization application still has some problems, such as high cost, low yield and poor mechanical stability need to be solved. This paper introduces the in recent years
Key words：Bacterialcellulose ;Artificial blood vessels ; Tissue engineering scaffolds ; Artificial cornea,
引言：纤维素主要由植物的光合作用合成, 是自然界取之不尽, 用之不竭的可再生天然高分子。近年来随着石油、煤炭储量的下降、石油价格的飞速增长、各国对环境污染问题的日益关注和重视, 以及可再生资源在科技、医学、技术等方面的发展, 纤维素的应用正愈来愈受到重视[1]。
纤维素具有很多优越的性质, 如亲水性、手性、生物可降解性, 以及广泛的化学改性能力。纤维素大分子之间, 纤维素和水分子之间, 或者纤维素大分子内部都可以形成氢键, 而这些大规模的氢键网状结构组成了纤维素的半晶体光纤形态[2]。
纤维素的来源主要是植物。棉花几乎是纯的纤维素, 而木材等则是由纤维素、木质素、半纤维素、果胶等其它碳水化合物的混合体。除了植物以外, 动物、特
定的细菌、海藻、真菌等也能生成纤维素。其中目前已知的合成纤维素能力最强的微生物菌株为木醋杆菌, 它已经被广泛应用于实验室研究细菌纤维素(BC)。
细菌纤维素的分子结构与植物纤维素基本相同, 但其重要的结构特征和性质使它的实际应用意义远远大于植物纤维素。细菌纤维素具有高纯度、高聚合度(高达8000) 、高结晶度、高含水量和高力学稳定性等重要性质。而这些性质都是由于它在水介质中形成的特定网状纳米超分子结构所引起的。类似于BC 那样具有纳米尺度的纤维素被称为纳米纤维素, 它也包括纳米尺度的纤维素晶须和纳米纤维素复合物。
1. 纳米纤维素的制备
1. 1 用细菌制备纳米纤维素
1886年,Brown 首次报道了由木醋杆菌(Acetobacterxylinum)合成了一种胞外呈凝胶状的物质, 但由于无合适的实验手段以及产量较低, 因此未受到重视。细菌纤维素(BC)引起人们更多的注意是在20世纪后期, 而深入的研究则是从Hestrin 和Schramm 等的研究开始的, 他们证明了静止和冻干的醋酸细菌细胞在有葡萄糖和氧时能够合成纤维素, 并且研究出了一种特殊的培养基, 使木葡糖酸醋杆菌在实验条件下最优化产出纤维素[3]。BC 的生物合成是一个很复杂的过程, 从尿苷二磷酸葡萄糖开始, 经过4个主要的酶催化反应, 最终转化为纤维素长链分子。
细菌纤维素相对于植物纤维素的优越性在于:(1)它是一种纯纤维素, 具有高化学纯度和高结晶度, 而植物纤维主要由纤维素组成, 但它掺杂其它许多糖类, 如半纤维素或木质素;(2)它的弹性模量为一般植物纤维的数倍至十倍以上, 并且抗张强度高;(3)有很强的持水能力、较高的生物适应性和良好的生物可降解性;(4)生物合成过程可调控。这使细菌纤维素在食品工业、造纸工业、化妆品、聚合物增强、无机物合成等许多方面有很大的应用价值。
1. 2 用植物制备纳米纤维素
相对于细菌纤维素来说, 植物纤维素必须经过化学处理或者机械粉碎才能得到纳米尺度的纤维素。
1. 2. 1 物理处理 1980年, 用高速搅拌机处理木浆,Thrbak 等研究出了一种微
纤维化的纤维素, 得到了纳米级的网状结构的纤维素, 其纤维直径在10～ 100nm之间, 可以用于制备透明的高强度纳米复合物。将竹子纤维及其单纤维用石盘高速研磨, 并结合热碱的预处理,Takahashi 等[4]以竹子为原料制得了微纤化的纤维素。
1. 2. 2 化学处理 化学处理植物体来制备纳米纤维素的最主要方法是酸或碱的水解, 也包括用表面活性剂或生物酶来处理。
Li 等[5]将桑葚枝条预处理并漂白后, 用100mL 64w/w%的硫酸溶液在60℃下水解10g 漂白后的纤维, 加冷却水停止反应并进行离心, 再重复的将沉淀搅拌悬浮再离心, 直到变成胶状的悬浮液。将胶体透析并用超声波处理后, 在4℃下冷冻并加氯仿来避免细菌生长。在悬浮液中, 纤维素晶须的重量份数为1w/w%。AFM 表征了纤维素晶须的形态(见图1), 有42. 4%的晶须直径范围在25-30nm, 晶须长度大约在400～ 500nm。
图1 用硫酸溶液处理制备的纤维素晶须的AFM 图像
Figure 1 AFM image of cellulose whiskers prepared by the treatment of sulfuric acid solution [5]
越来越多的人趋向于寻找不同于传统纤维素来源的其他原材料。Zuluaga 等
[6]用四种不同的酸碱配比方法处理了香蕉茎, 并得到了纤维素微纤。实验显示, 当碱的浓度提高时, 木质素等非纤维素物质大多被除去。其原因是木质素等非纤维素成分与纤维素的相互关系不仅仅是表面联系,
而是分子链之间相互交联。所以
足够浓度的碱溶液使得纤维素微纤溶胀, 有利于杂质的分离。
还有一种方法是酶解, 即利用纤维素酶选择性地酶解掉无定形的纤维素而剩下部分纤维素晶体。Brumer 等[7]研究通过转糖基酶以化学和酶同时改性的方式活化纳米纤维素晶体表面, 从而不至于在纤维素晶体表面修饰的同时破坏基元原纤和晶体内部结构。
2 纳米纤维素的应用
纳米纤维素是一种纯天然的生物材料, 它在生物方面的用途极为广泛, 包括生物传感器的制造, 生物载体, 生物医学材料, 无机材料的生物模板, 和无机材料复合制备生物活性的组织学支架, 磁性药物载体, 甚至工业净化等等, 几乎所有纳米纤维素所应用的领域都涉及到了其生物特性[8,9]。
纳米纤维素具有很好的生物适应性以及其纳米尺度的特殊结构, 在生物载体方面体现出了巨大的潜力。Ioelovich 等[10]介绍了一种纳米纤维素载体的制备方法。这种方法包括:在控制条件下将最初的纤维素解聚, 对其进行结构和化学的改性, 以便使多种生物活性物质能嫁接到纤维素颗粒上以及在液体介质中将纤维素颗粒高强度机械瓦解。因此, 有生物活性的纳米纤维素就被分离出来了。由于是纳米级别, 有生物活性的纤维素颗粒能清理皮肤的毛孔, 打开气孔, 穿过皮下的脂质层和上皮层。生物载体的该功效可以被应用到高级生物材料或者用于高级护理及皮肤治疗的化妆药物。
纳米纤维素可以作为酶的固定化及生物活性分子的载体, 应用吸附则可以大大的拓宽其使用范围。Tabuchi [11]介绍了一种新的对生物分子(DNA和蛋白质等) 敏感的探测体系, 利用CD 光盘和生物纳米纤维集成在实验室芯片上。这种新方法通过利用纳米尺度的纤维和孔, 限制特定的细菌纤维素纤维片段组成了一个控制CD 烧制的微通道。与现行的通用方法相比, 检测DNA 的最大敏感度是传统方法的6倍。
3 细菌纤维素在医学材料上的应用
细菌纤维素由于具有独特的生物亲和性、生物相容性、生物可降解性、生物适应性和无过敏反应, 以及高的持水性和结晶度、良好的纳米纤维网络、高的张力和强度, 尤其是良好的机械韧性, 因此在组织工程支架、人工血管、人工皮肤
以及治疗皮肤损伤等方面具有广泛的用途, 是国际生物医用材料研究的热点之
一。研究发现, 细菌纤维素在活体中还未发现有任何排异反应和炎症发生, 这种优越的生物适应性引起了人们的广泛兴趣。细菌纤维素在伤口抗菌敷料、人工移植物以及人工血管领域都有很好的用途。
3. 1 组织工程支架
已有很多天然生物材料，如多聚糖、胶原、无机及生物衍生材料等用于组织工程支架的研究，这些材料都表现出良好的生物相容性。相比较而言，ＢＣ具有很好的力学性能、持水性、生物相容性、广泛的温度适应性和ｐＨ稳定性，同时具有多孔形态和可降解性。目前，已开展ＢＣ在骨组织工程支架、人工角膜等方面的研究，如表１所示。
组织工程学包括对细胞, 生物或人工支架的应用, 也包括了细胞和生物反应器。多聚糖如壳聚糖, 透明质酸和它们的天然来源很有利于组织工程学支架研究, 因为他们有很好的生物相容性, 可以刺激细胞生长, 并且可以控制细胞支架的相互作用。现在的趋势显示出了对组织制备的力学性能的重视, 因此人们有兴趣在力学作用下把细胞-支架组成暴露在活性的生物传感器中。相比之下, 用木醋杆菌制备的纳米纤维素被发现很适用于做支架材料, 因为它很好的力学性能, 持水性能, 生物相容性和它的在广泛温度和pH 范围内的稳定性。另外, 很好的多孔性形态和与胶原蛋白的相似性使得细菌纤维素对于细胞固定, 细胞移居和多孔模板的制备来说是很有吸引力的[12]。由木醋杆菌合成的BC 由完全纯净的纤维素纳米微纤组成。BC 有很高的机械强度, 三维的网状结构。纤维素基的材料几乎不引起排异反应和炎症, 被认为是有生物相容性的。
Gisela 等[13]以老鼠作为实验品, 测定了BC 的生物适应性。他们将BC
移植到
老鼠的皮下, 保持时间为1,4和12周。没有发现慢性炎症或排异反应。BC 和周围的组织结合在一起, 血管及内皮细胞都在BC 的周围生长, 并且开始推开BC 纤维向移植物的内部生长。4周后, 扩散性的细胞消失,BC 与周围的组织混合在一起, 延长的成纤维细胞进入BC 的波浪状结构内部, 并且开始产生胶原蛋白，经过12个星期的观察, 没有发现宏观的炎症反应(也就是说没有很多的小细胞包围着移植物或血管), 也没有出现纤维化, 胶囊化或者巨细胞。成纤维细胞渗入BC 中,BC 和主组织很好地融合在一起, 并没有引起任何排异反应。BC 的生物适应性很好, 而且这种材料在组织工程学中用于支架是有很大潜力的。
Bodin [12]评估了细菌纤维素作为组织工程学支架中软骨、骨头、特别是血管的适用性。他发现培养方法对支架形态的影响和选择会明显的影响其力学性能和细胞附着性能, 以及细胞在材料内的生长。同时, 他也研究了一些多聚糖材料作为水凝胶或多孔结构的适用性, 但发现它们在生物反应器中无法提供有效的对细胞的机械支撑。相反的, 由木醋杆菌生产的纳米纤维素则很适用于支架材料, 因为它有很好的机械性质, 持水性, 生物适应性和在大范围温度和pH 内的稳定性。Bodin 还研究了模仿生物的方法来表面改性细菌纤维素, 可以提高细胞粘附性和影响细胞分化, 以及调整纤维素支架的多孔性和机械性能的培养过程[14]。
Rambo [15]用促进合成的方法制备了可控的多孔纳米纤维素薄膜, 方法为将木醋杆菌在适合的培养基中在静态条件下培养。用由聚苯乙烯(= 300μm) 或光学纤维(= 60μm) 组成的直径为60～ 300μm 的针状模板浸泡在溶液中固定在培养基中来形成原位孔。在针状物的周围发生生物合成纤维素, 在纤维素薄膜上出现小孔。移去模板后, 在50℃下干燥生物薄膜24个h 。在孔形成后,BC 薄膜的物理化学性质, 如结晶度、溶胀和拉伸强度没有很大的变化。微结构显示薄膜基质是由长的纳米纤维分布在表面组成的。纤维素薄膜内形成的圆形孔的直径在60～ 300μm, 随着针状模板的不同而变化。这些孔显示边缘没有缺陷。微孔薄膜可以用于修复组织, 特别是修复高氧化率或伤口挛缩延迟的组织。
3. 2 医学移植
在美国, 每年都有超过500000的人工合成移植物被移植入人体。对血管外壁的重建和替代的移植手术在近五年来明显增加了90%～ 75%,细菌合成纤维素管(BASYC)的高纯度、高含水量、天生的水凝胶结构的稳定性、纳米纤维网状结构、
液体离子的可渗透性、小分子量和近似于生物组织表面使得BASYC 可以用于制造新型的生物移植物。
Schumann [16]将BASYC 植入动物中进行长期观察, 研究了BASYC 的植入对老鼠颈动脉的影响。激光扫描显微镜显示BASYC 的内表面很光滑, 类似于天然的颈动脉。SEM 显示证实了内皮细胞化的同质活性。BASYC 内侧的成纤维细胞产出了胶原蛋白。
医学移植中很重要的一部分是客户定制的特征和纤维素纳米支架的可控改性。这个支架通过羟基功能化的外表面, 纳米纤维结构的底表面, 以及大孔体系与环境相互作用。因此, 可以吸附和积累水, 其它液体有:有机物、无机试剂、金属和金属氧化物、合成大分子、生物大分子和活细胞[17]。
医学装置设计和制作的一个重要的方面是找到一种适合于做软组织替代的材料, 它不仅仅要和需要替代的软组织有相似的力学性质, 还要有生物活性、生物适应性、不易凝血和钙化度低等特点。聚乙烯醇(PVA)是一种亲水聚合物, 有很多可以用于生物医学应用的性质。PVA 可以被转变成一种固体的水凝胶, 用交联和冻干可以得到很好的力学性能。由木醋杆菌通过发酵制备的亲水BC 纤维的平均直径在50nm,Millon [18,19]将它用于和PVA 联合生成生物兼容的纳米复合物。得到的复合物有很宽的力学性能范围, 可以被制备成和心血管组织力学性能相似的物质, 如主动脉和心脏瓣膜叶。不止一种PVA-BC 纳米复合物的应力应变性质在圆周和轴向组织较好地符合了猪的主动脉的性质。他也制备了和心脏瓣膜组织性质类似的PVA-BC 纳米复合物, 并研究了所有样品的松弛性质, 这是心血管应用中很重要的性质, 研究显示样品都比他们要替代的组织松弛的速度更快, 残余应力更低。这个新型的PVA-BC 复合物在心血管软组织替代应用中有很好的应用前景。
最近众多文章报道到细菌纳米纤维素网络能被光聚合的聚丙烯酸脂网络和聚甲基丙烯酸酯网络包裹或填充。通过改变单体类型和交联剂浓度, 可以明显改善刚度和水吸收能力。然而, 这种改变导致了不可控制的复合样本和性质的多样性。可以通过逐步优化单体化合物与杨氏模量的关系, 来达到对有类似于软骨的力学性质的复合物类型的控制。用上述步骤复合丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸-2-羟乙酯和N-乙烯基吡咯烷酮的混合物, 产物的模量是5～ 20 MPa。这些数据和天然透明质的软骨相一致[20]。
马霞等[21]公开了一种利用细菌纤维素制备人工硬脑膜的方法, 其步骤是将细菌纤维素湿膜破碎, 得细菌纤维素匀浆; 以细菌纤维素匀浆的含水量为95%～ 98%计, 将所述细菌纤维素匀浆与浓度为7%～15%的聚乙烯醇溶液按照1∶ 1～ 10的比例均匀混合; 然后将混合物均匀的铺在模具中, 并使其厚度为0. 26～ 0. 90mm,置于- 20到- 4℃条件下冷冻20～ 30h;再于真空冷冻干燥机内冻干, 得成形的人工硬脑膜。这种人工硬脑膜在湿态时有良好的弹性和柔韧性, 实验测定:厚度一般为0. 18～ 0. 78mm,渗水率为0, 断裂伸长率为30%～ 98%。缝合时不撕裂, 不脱边。这个方法生产过程环保、生产工艺简单、成本低, 适于推广。
3.3 BC在人工血管上的应用
众所周知, 当血管由于动脉硬化、血管老化或破损等原因不能正常工作时, 需进行血管移植重建。全世界每年要施行的许多血管重建手术由于自体血管来源
有限, 而异体血管强烈的排异作用, 以及来源少和价格昂贵等原因, 常不得不使用人工合成血管作为替代品。目前, 国际临床上使用最广泛的、用于替代大于 6 mm 的人工血管是编织型的涤纶聚酯血管和膨体聚四氟乙烯血管, 这是因为它们结构稳定性好, 在体内可长期工作而不发生降解, 但是它们仍存在着不少缺点和不足, 譬如血栓的形成和新生内膜增厚导致血管堵塞, 至今尚无十分理想的血管替代物。基于同样原因, 用于置换小于 6 mm 的动、静脉血管的人工血管还没有开发成功。临床上是采用自体血管进行修复, 例如冠状动脉搭桥手术。近 30年来, 人们一直在致力于这方面的研究。
2001 年Klemm 等[22]研究了在显 微外科中以BASYC 做为人造血管的可行性。他们利用大鼠微脉管插补术试验发现只有 1mm内径的 BASYC 在湿的状态下具有高的机械强度, 大的持水能力, 低粗糙度的内径以及完善的生物活性等优良特性, 证明了它在显微外科中作为人工血管的巨大应用前景。 2004 年Klemm 等[23 ]进一步证实 BASYC 具有生物活性和相容性。由于具有与天然血管内腔表面类似的平滑度, 因此血管内不会形成血栓, BASYC 完全符合显微外科中人工血管的物理和生物要求。最近, 该课题组[24]将 BASYC长期植入老鼠体内 ( 1年 ), 然后借助组织免疫和电子显微镜等手段研究老鼠的内皮细胞、肌肉细胞、弹性结构和结缔组 织等不同 结构的变 化, 重点 研究植 入的BA SYC 和周围组织接触的区域。
2006 年 Henrik 等[25]研究了细菌纤维素作为潜在的组织工程血管支架的机械性能。通过利用 SEM研究静态培养的细菌纤维素薄膜生长的形态学, 并比较了细菌纤维素、猪动脉血管以及膨体聚四氟乙烯 ( e PTFE) 支架在机械性能上的差异, 结果表明细菌纤维的应变能力与动脉血管相似, 这很可能是由于纳米纤维结构的相似性造成的。通过体外实验研究了人平滑肌细胞在细菌纤维素上的吸附、增殖、向内生长的情况, 结果发现在细菌纤维素上吸附和增殖的平滑肌细胞在培养两个星期后可向内生长 40 Lm。
3.4伤口敷料
皮肤创伤是种常见损伤，快速修复创伤皮肤的有效手段是使用创伤敷料治疗。基于BC 膜的独特纳米结构，与其它伤口敷料相比，BC 具有在潮湿的条件下机械强度高，对气、液和电解质有良好的通透性，皮肤相容性好等特点，这些优良的物理性能有利于皮肤 组 织 的 生 长 和 愈 合，是 一 种 新 型 的 伤 口 敷料，如表2所示。
为了提高BC 作为伤口敷料的功能，研究者们探索很多方法改善BC 膜的性能。如Yu 等在木醋杆菌合成培养基中加入水溶性羧甲基纤维素，制备得到羧甲基BC ，该复合物具备更好的保水能力和断裂应力。Kim 等制备复合物BC/壳聚糖、BC/聚乙二醇和BC/明胶，这些复合物的生物相容性优于BC 。Maneerung 等研究将银纳米粒子吸附在BC 膜上，从而制备具有抗菌活性的伤口敷料，该敷料对大肠杆菌和葡萄球菌均有很强的抗菌能力，开创了BC 制备新型抗菌活性伤口敷料的领域。
3.5 BC 在人工皮肤以及皮肤损伤治疗上的应用
自1987年以来有近10个皮肤伤病医疗单位已报道 400多例应用 BC 膜治疗烧伤、烫伤、褥疮、皮肤移植、创伤和慢性皮肤溃疡等取得成功的实例,
现已
有用其制成的人工皮肤、纱布、绷带和 /创口贴等伤科敷料商品。与其它人工皮肤和伤科敷料相比, 该膜的主要特点是在潮湿情况下机械强度高、对液、气及电解物有良好的通透性、与皮肤相容性好, 无刺激性, 可有效缓解疼痛, 防止细菌的感染和吸收伤口渗出的液体, 促进伤口的快速愈合, 有利于皮肤组织生长。此膜还可作为缓释药物的载体携带各种药物, 利于皮肤表面给药, 促使创面的愈合和康复。
为了应用于皮肤创伤, Sanchavanakit 等[26]利用人类角化细胞和成纤维细胞来评价 BC 膜的潜在生物作用机理。他们研究了从 Nata椰子汁培养基提取的细菌纤维素膜的特性以及人类角化细胞和纤维原细胞在BC 上的生长情况。用平衡发射极晶体管技术 ( BET )测定发现 BC 干膜的平均孔径和总表面积为 224ANG和 12. 62m2/g。一张厚度为0.12mm 的 BC 膜, 干膜的平均抗张强度和断裂强度分别为 5. 21MPa和 3. 75%,而相应的湿膜为1.56MPa 和 8. 00% 。风干 BC膜的吸水量为每克干膜吸水 5. 09g。研究结果直接证明了 BC膜支持人类角化细胞的生长、增生和移动, 但是对成纤维细胞没有作用
Czaja 等[27]研究了 BC在治疗二级和三级烧伤方面的应用前景, 他们对 20个病人做了一项医学研究: 将BC 创伤敷料直接覆盖在新鲜烧伤达 9% ~ 18% 创面上, 接下来观察创伤以及伤口周围环境的变化、观测表皮生长、检测微生物和研究组织病理学。结果显示, BC是一种很好的促进烧伤愈合的材料, 效果好的原因可能是多方面的, 譬如 ( 1) BC 的湿润环境易于组织再生、还可以有效的减轻疼痛, ( 2) 特殊的纳米结构促进细胞相互作用、促进组织再生、减轻疼痛以及减少疤痕组织生成, ( 3) 治疗过程中 BC 有利于在伤口处安全、方便地释放药物。
3.6BC/PVA 制备人工角膜材料
细菌纤维素是天然高分子化合物，它的化学纯度很高，具有精致的三维网状结构，较好的生物相容性和持水性。而且细菌纤维素还具有良好的机械性能，其的机械强度足以维持人的眼内压并可以达到缝合的要求，它可以作为人工角膜的周边支架材料。细菌纤维素虽然具有一定的透明性，但是作为人工角膜材料的光学中心部分来说，还有一定的差距，需要进一步提高其的透明性。角膜作为人眼的屏障，有保护眼内组织的功能，也就是说必须能阻止外界的细菌对眼内组织的
侵染，但是纤维素是一种多糖，易被空气中细菌感染而发霉降解。如果用于人工角膜材料，必须对其进行改性，以提高透明度和抗菌性。
聚乙烯醇(PVA)水凝胶一种水溶性高分子，它与人体组织具有高度的相容性，它无毒、无副作用、无降解，化学性质稳定，机械性能优良，含水量高，易于成 型，在生物医学和工业方面的用途非常广泛[28]。PVA 水凝胶已用作腹膜、透析膜、缓释载体、组织工程支架、人工器官、人工软骨和人工血管等[29]。在眼科方面，聚乙烯醇水凝胶可以用作软性接触眼镜、人工玻璃体和人工角膜等。聚乙烯水凝胶可有多种方法交联而成，主要是化学交联和物理交联两种方法。化学交联是高分子水凝胶材料制备的主要方法之一，由化学键交联形成的三维网络聚合物，要求交联剂必须是能与高分子功能基反应的多官能团化合物或多价金属离子[30]。PVA 水凝胶常用的交联剂有戊二醛、丁二酰、已二酰等[31]。物理交联法是制备医用PVA 水凝胶的常用方法，即冷冻-熔融法。在常温下，PVA 水溶液中的高分子链无规律分布在水相中，当PVA 水溶液冷冻呈固相后，高分子链通过氢键被固定。除氢键外，在冷冻状态下，还形成高分子结晶以及发生相分离，使高分子链的运动受到最大限制；解冻后，部分氢键及结晶被破坏，但是PVA 已部分交联，不再融于水中。在下一次的冷冻过程中，形成新的结晶区，充当新的物理交联点，再次熔融又会破坏部分交联，如此反复冻融处理，得到稳定的物理交联PVA 水凝胶。采用冷冻-熔融的方法，使细菌纤维素与聚乙烯醇复合，利用BC 的“纳米效应”
[32]，制备出具有高透明性，不易被细菌感染，同时具有细菌纤维素与聚乙烯醇优点的复合材料，使细菌纤维素能够用于人工角膜材料。
4 结论
本文以分类讨论的方式对纳米纤维素的制备和应用进行了综述, 主要描述了近年来纳米纤维素研究方面的进展。从纳米纤维素的应用可以预测, 未来其在生物和医学方面的发展将是占主流的。在生物应用中, 纳米纤维素有可能在载体及生物传感器方面有较大的发展; 而在医学领域, 纳米纤维素与无机物进行复合制造人工组织无疑会是一个热点。
生物医学材料由于直接关系到人类的生命与健康, 且面临着全球人口的巨大市场需求, 因而得到世界各国的广泛重视。目前对细菌纤维素的研究主要集中
在附加值较高的医学生物材料上, 例如组织工程支架、骨支架、软骨支架、人工血管、人工皮肤以及药物载体等方面。但是真正能应用到临床上的产品还不多, 大部分的研究还停留在细胞水平和动物实验等初级阶段, 离临床应用仍有一定距离。在我国, 人们对细菌纤维素的了解和认识还不足, 对其研究尚处于初级阶段, 大部分集中在食品、食品添加剂和造纸应用等方面, 在生物医用材料上的开发应用上相关报道较少。由于细菌纤维素具有优秀的生物亲和性、生物相容性、生物适应性和良好的生物可降解性, 因此该纤维素必将成为世界上性能优异的新型生物纳米高技术材料。
目前 BC应用的主要技术障碍一是发酵水平较低, 产量低、成本高、价格不抵普通植物纤维素, 二是进一步研究和利用 BC的成模和成型的工艺技术还没有解决, 三是做为生物医用材料, 其与生物体长期作用效果、体内的降解性、与宿主组织和细胞相容性, 以及在体内时 BC 的机械、物理和化学性能的变化等一系列问题还需要进一步研究。要解决上述问题, 今后的研究方向主要有两个: 一是要研究设计可行的发酵设备及发酵工艺以提高纤维素产量, 降低其成本; 二是要研制开发具有自主知识产权的 BC生物医用材料。
参考文献
[1] Ye D Y,HuangH,Fu Y Q,Chen H Q. J ChemInd Eng,2006,57:1782～ 1791.
[2] Yu B,Zhou H L,Biotechnology Bull,2007,2:87～ 97.
[3] Dieter K,DieterS,FriederikeK,et al. AdvPolym Sci,2006,205:49～ 96.
[4] Takahashi N,OkuboK,Fujii T. Bamboo J,2005,22:81～ 83.
[5] Li R,FeiJ,Cai Y R,Li Y F,et al. Carbohydrate Polym,2009,76:94～ 99.
[6] ZuluagaR,Putaux J L,CruzJ,et al. Carbohydrate Polym,2009,76:51～ 59.
[7] Ye D Y. Prog in Chem,2007,19:1568～ 1575.
[8] Ye D Y,HuangH,Fu Y Q,Chen H Q. J ChemInd Eng,2006,57:1782～ 1791.
[9] Yu B,Zhou H L. Biotechnol Bull.,2007,2:87～ 97.
[10] IoelovichM,Figovsky O. Adv Mater Res,2008,47～ 50.
[11] TabuchiM,KobayashiK,FujimotoM,Baba Y. Lab on a Chip,2005,5:1412～ 1415.
[12] BodinA,BackdahlH,RisbergB,Gatenholm P. Abstracts of Papers,Proceedings of 233rd ACS National Meeting,Chicago,IL,UnitedStates,March 25～ 29,2007,CELL ～ 107.
[13] Gisela H,HentikB,AaseB,et al. J Biomed Mater Res,2006,76:431～ 438..
[14] BodinA,BackdahlH,RisbergB,GatenholmP,Abstracts of Papers,Proceedings of 235th ACS National Meeting,NewOrleans,LA,UnitedStates,April 6-10,2008,CELL-011.
[15] Rambo C R,Recouvreux D O S,Carminatti C A,et al. Mater SciEng C:2008,28:549～ 554.
[16] Schumann D A,Klemm D O,KramerF,et al. Abstracts of Papers,Proceedings of 235th ACS National Meeting,NewOrleans,LA,UnitedStates,April 6-10,2008,CELL-011.
[17] Klemm D O,Schumann D A,KramerF,et al. Abstracts of Papers,Proceedings of 233rd ACS National Meeting,Chicago,IL,UnitedStates,March 25-29,2007,CELL-127.
[18] Millon L E,Wan W K. J Biomed Mater Res,Part B:2006,79B:245～ 253.
[19] Millon L E,GuhadosG,Wan W. J Biomed Mater Res,Part B:2008,86B:444～ 452.
[20] Klemm D O,KramerF,WesargF,et al. Abstracts of Papers,Proceedings of 235th ACS National Meeting,NewOrleans,LA,UnitedStates,April 6-10,2008,CELL-011.
[21] 马霞, 王瑞明, 关凤梅, 王腾飞. 中国专利,CN[1**********]7.5.
[22] Klemm D, S chum ann D, Udhard t U, et a.l Bacterial synthesized cellu lose Oartificia l b lood vessels for microsurgery.Polymer Science, 2001, 26( 9): 1561 ~ 1603
[23] Klemm D, Udhard t U, S chum ann D, et a.l The m ouldedbiomaterial BASYC ( BA cterialSYnthesizedCellu lose ): Ap rom is ing artificial b lood vessel for microsurgical use. In Abstracts of Papers, 227 th ACS National M eeting, Anaheim,CA, Uni ted S tates, 2004. W ash ington, DC: Am ericanChemical Society, 2004, CELL~ 156
[24] S chum ann D, M arsch S, K lemm D, et a.l New results about BASYC ( BActerialSYnthesized C ellu lose ), the p rom is ing artificial b lood vessel for microsurgery and further application of b acterialcellu lose in m edicine. In Abstracts of P apers, 229 th ACS National Meeting, S an Diego, CA, Un ited S tates, 2005.W ash ing ton, DC: American Chemical Society, 2005, CELL ~152
[25] Henrik B, GiselaH, Aase B, et a.l M echanical properties of bacterial cellulose and interaction s with smooth muscle cells. B iomaterials, 2006, 27 (9): 2141~ 2149
[26] San chavanak it N, Sangrungraungro j W, Kaomongkolgi t R, eta.l G rowth of hum an keratinocytes and fib rob lasts on bacterial cellulose film. B iotechnol P rog, 2006, 22( 4 ): 1194~ 1199
[27] Czaja W, Kaweck i M, K rystynowicz A, et a.l App licat ion of bacterial cellulose in treatment of second and third degree burns. In Abstracts of P apers, 227 th ACS National M eeting,Anaheim, CA, Un ited S tates, 2004. W ash ington, DC:AmericanChemical Society, 2004, CELL~ 157
[28] Cascone MG, Laus M, Ricci D, Sbarbati Del Guerra R. Evaluation of poly(vinyl alcohol) hydrogels as a component of hybrid artificial tissues [J]. J Mater Sci Mater Med 1995;6(2):71-75.
[29] Zheng QG, Jiu MX, Xiang HZ. The development of artificial articular cartilage PV A hydrogel [J]. Bio-Med Mater Eng 1998;8(2):75-81.
[30] AlvarezV A,Ruseckaite RA, Vázquez A. Degradation of sisal fibre/Mater Bi-Y biocomposites buried in soil [J]. Polymer DegradStabil 2006;91(12):3156-3162.
[31] Orienti, Trere R, Zecchi V . Hydrogels formed by cross-linked polyvinylalcohol as colon-specific drug delivery systems [J]. Drug DevInd Pharm 2001;27(8):877-884.
[32] Iwamoto S, Nakagaito AN, Yano H, Nogi M. Optically transparent composites reinforced with plant fiber-based nanofibers [J]. ApplPhys Mater Sci Process 2005;81(6):1109-1112.