慢病毒包装步骤
慢病毒包装步骤
慢病毒包装简要步骤：
以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。
温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min
4、用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
注意事项
1.在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。
质粒转染的步骤
1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~3
2、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。
3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。
步骤如下：以24孔培养板为例
1、转染前一天细胞换新的培养基
2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:
a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；
b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；
c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；
3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；
4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。加入G418的量最好设几个梯度或者转染前做MTT，找好G418对你所转细胞致死量的浓度。
5、等细胞在G418作用下，长满后冻存几支（保种）。再克隆化培养：将细胞消化后计数50个细胞，加入22ml完全培养基中，混匀，分装在96孔板中（200ul/孔）。第二天在显微镜下，寻找孔中有单个细胞的孔并做标记，等做标记的孔长满后，消化、转移到4孔或6孔培养板中，最后转移到培养瓶中培养，冻存，鉴定。
6、鉴定成功后，建议马上做后续实验，因为在培养过程或冻存中，转进去的基因容易从细胞中掉下来。
慢病毒包装步骤
慢病毒包装步骤
慢病毒包装简要步骤：
以六孔板中的1孔为例，每个样品需要1×106个293T细胞。
温孵育5min。
3、将DNA溶液和脂质体溶液轻柔混匀。室温孵育20min
4、用胰酶消化并记数293T细胞。用含血清的培养基重悬细胞。
5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生长培养基，再加入DNA-脂质体复合物。
6、将1ml重悬的293T细胞（1×106个细胞/ml）加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育过夜。
7、转染后48-72h收获含病毒的上清。3000 rpm 离心20min，去除沉淀。
8、病毒上清-80°C贮存。
包装出来的慢病毒对NIH/3T3细胞达90%以上感染效率。
注意事项
1.在慢病毒感染细胞前，为检测病毒上清培养液内病毒的活性，并确定病毒与转染细胞之间的比率，需要确定病毒2. 在慢病毒转染细胞的过程中最重要的一步是融合，只有一些较小的慢病毒载体才能转导进细胞，因此，病毒颗粒的吸附是慢病毒转染的限速步骤。
质粒转染的步骤
1、DNA的量：Lipofectamine 2000=1：2~3
2、细胞密度大约占培养板的80%左右，转染。
3、转染期间不要加抗生素，否则会导致细胞死亡。
步骤如下：以24孔培养板为例
1、转染前一天细胞换新的培养基
2、制备DNA-Lipofectamine 2000复合物，如下:
a、用50ul无血清培养基稀释DNA（0.8g），轻轻混匀；
b、Lipofectamine 2000使用前，轻轻混匀，用48ul无血清培养基稀释2ul Lipofectamine 2000，轻轻混匀，室温孵育5分钟；
c、将a+b的液体加在一起，轻轻混匀，室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成；
3、将100ul DNA-Lipofectamine 2000复合物加入培养板中，轻轻前后摇匀；
4、放入37度孵箱中培养24~48h后，1：10传代，加入G418筛选。加入G418的量最好设几个梯度或者转染前做MTT，找好G418对你所转细胞致死量的浓度。
5、等细胞在G418作用下，长满后冻存几支（保种）。再克隆化培养：将细胞消化后计数50个细胞，加入22ml完全培养基中，混匀，分装在96孔板中（200ul/孔）。第二天在显微镜下，寻找孔中有单个细胞的孔并做标记，等做标记的孔长满后，消化、转移到4孔或6孔培养板中，最后转移到培养瓶中培养，冻存，鉴定。
6、鉴定成功后，建议马上做后续实验，因为在培养过程或冻存中，转进去的基因容易从细胞中掉下来。