5高通量测序技术在肿瘤基因检测中的应用-易鑫

精准检测是精准医学的基础

目录

CONTENTS

•样本要求

•杂交捕获还是PCR扩增 •测序平台的选择 •高通量测序检测突变类型

•常用生物信息分析软件与数据库

术标本液等

打断高通量测序肿瘤基因检测流程介绍

肿瘤高通量测序的样本

样本类型

DNA量：>10~30ng

对照样本

纯度问题

富集技术的选择 扩增子 or 杂交捕获

评价目标区域富集技术的关键点

·覆盖度（coverage): 测序数据覆盖区域/探针or引物设计区域

·特异性（specificity): 目标区域测序数据/总数据

·均一度（uniformity): 目标区域碱基覆盖度的波动情况 ·重复性 (repeatability)：重复实验的波动情况

方法

代表品牌 SureSelect (Agilent)

基于杂交捕获

SeqCap (Roche) HaloPlex (Agilent) 基于扩增子

Ampliseq （Thermo)

Truseq (Illumina) 其它方面比较：

•扩增子引物结合区域突变位点难以检测 •PCR引物区域会测序数据的浪费

•扩增子覆盖度不均一会导致低覆盖区域Calling准确性的下降

拷贝数变异（CNV）检测精度的比较

不同引物结合效率可能存在较大差异

不同探针结合效率差异不大

CNV检测精度： 杂交捕获显著优于扩增子建库

打断

捕获

PCR

测序平台的选择

Illumina *** *** *** *** *** *** *** ** Thermo *** * *** *** *** *** *** *** 比较

相近

Thermo对于连续相同碱基的读取错误率略高 相近 相近 相近

相近

各种通量机型可灵活选择

Thermo在测序时间上具有一定优势 SNV InDel

准确性

CNV SV 易用性 读长 通量 时间 SNV精度检测，两个平台检测精度相当

肿瘤体细胞突变SNV数据分析原理

突变 T（肿瘤） N（对照） 突变类型 50%

0% 体细胞突变 GT

50%

50%

生殖细胞突变

Science Translational Medicine 15 Apr 2015: Vol. 7, Issue 283

拷贝数变异(CNV)检测的原理

影响CNV检测的因素： 实验的重复性

不同类型样本基线的建立 CNV本身的大小

融合基因检测示意图

常用生物信息软件与数据库

•数据分析软件：

BWA＋GATK Suite for Germline Variants

MuTect /GATKSomatic Indel /Contra for Somatic Variants

•公共数据库：

•肿瘤突变相关数据库：

•临床用药信息数据库：

高通量测序的检测灵敏度

Sanger测序：10-15% ARMS PCR 检测：1% ddPCR检测：0.1%

高通量测序：？

高通量测序检测灵敏度与测序深度的关系

5条Reads确定一个可信突变

测序深度决定检测灵敏度

肿瘤样本

1%的肿瘤含有该突变 （肿瘤的纯度、取样方式影响非常大）

50%的数据利用率 最少5条reads确定一个突变

Y=5/0.5/0.01=1000X

上机测序

液体活检-ctDNA检测

乳腺癌甲基化

肺癌KRAS 黑色素瘤BRAF

结直肠癌KRAS 肝癌/卵巢癌TP53

胰腺癌KRAS 乳腺癌TP53

1948年首次描述了游离核酸存在于人的血液中； 1994年癌症患者血液中检测到重要癌基因RAS变异； 液体活检，ctDNA可反映癌症演化过程的动态信息； ctDNA由于其巨大的应用价值，被称为下一代癌症指标。

*Nature.Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients.2011.

ctDNA的高通量检测

ctDNA在血浆中的比例：

不同肿瘤，不同TNM分期ctDNA差别很大， 低至0.01%，检测技术难度很大。

高灵敏度检测：位点检测 or 高通量检测

方法 灵敏度 优势

缺陷

Clamping PCR Digital-PCR BEAMing

Sequenom UltraSEEKTM

0.1-1%

操作简单 速度较快

探针需要验证

受限于模板量，对于低频突变只能做单个或几个位点的检测 （多重引物）

ctDNA检测：

5ml全血 2ml血浆 ≈30~50ng cfDNA（健康人）≈ 10~20ng原始测序模板

（50%制备损失率）

≈ 3000~6000个基因组 （3pg/genome）

对于0.1%频率突变，高通量测序可实现多基因多突变的一次性采集

低频纠错检测技术的开发

新的实验与数据分析方法可将测序背景错误下降至0.0001%~0.001%。

高通量测序对0.01%~0.1%的突变检测变成可能。

Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Sep 4;109(36):14508-13

低频纠错检测技术

可实现0.01~0.1%突变

比例的高通量精准检测

肿瘤精准用药—单基因到多基因

NCI-MATCH打响精准医疗第一枪

同癌异治

（伞试验）

肺癌患者 外周血 组织

基因检测 异癌同治 （篮子试验）

外周血 组织

基因检测

NCI-MATCH基因与药物

药物 Crizotinib

Crizotinib

Dabrafenib和 Trametinib

Trametinib

Afatinib

Afatinib 靶点 ALK重排 ROS1 易位 BRAF V600E or V600K突变 BRAF Fusions/ Non-V600E/Non-V600K BRAF 突变 EGFR HER2 估算的突变频率 4% 5% 7% 2.80% 1-4% 2-5% AZD9291

Ado-trastuzumab emtansine

VS6063

Sunitinib EGFR T790M 突变 and 稀有的 EGFR突变 HER2扩增 NF2缺失 cKIT突变 1-2% 5% 2% 4%

a、所有实体肿瘤和淋巴瘤患者，不区分癌症类型；

b、列表显示2015年6月入组基因与药物，不停在增加；

c、目前基因检测范围包含200-300个药靶基因

ctDNA作为预后复发监测的指标

Digital PCR方法

断点检测方法

基于ctDNA的复发监测与疗效评估

ScienceTranslationalMedicine. 26 August 2015 Vol 7 Issue 302

ctDNA在结直肠癌患者复发监测的应用

精准检测是精准医学的基础

目录

CONTENTS

•样本要求

•杂交捕获还是PCR扩增 •测序平台的选择 •高通量测序检测突变类型

•常用生物信息分析软件与数据库

术标本液等

打断高通量测序肿瘤基因检测流程介绍

肿瘤高通量测序的样本

样本类型

DNA量：>10~30ng

对照样本

纯度问题

富集技术的选择 扩增子 or 杂交捕获

评价目标区域富集技术的关键点

·覆盖度（coverage): 测序数据覆盖区域/探针or引物设计区域

·特异性（specificity): 目标区域测序数据/总数据

·均一度（uniformity): 目标区域碱基覆盖度的波动情况 ·重复性 (repeatability)：重复实验的波动情况

方法

代表品牌 SureSelect (Agilent)

基于杂交捕获

SeqCap (Roche) HaloPlex (Agilent) 基于扩增子

Ampliseq （Thermo)

Truseq (Illumina) 其它方面比较：

•扩增子引物结合区域突变位点难以检测 •PCR引物区域会测序数据的浪费

•扩增子覆盖度不均一会导致低覆盖区域Calling准确性的下降

拷贝数变异（CNV）检测精度的比较

不同引物结合效率可能存在较大差异

不同探针结合效率差异不大

CNV检测精度： 杂交捕获显著优于扩增子建库

打断

捕获

PCR

测序平台的选择

Illumina *** *** *** *** *** *** *** ** Thermo *** * *** *** *** *** *** *** 比较

相近

Thermo对于连续相同碱基的读取错误率略高 相近 相近 相近

相近

各种通量机型可灵活选择

Thermo在测序时间上具有一定优势 SNV InDel

准确性

CNV SV 易用性 读长 通量 时间 SNV精度检测，两个平台检测精度相当

肿瘤体细胞突变SNV数据分析原理

突变 T（肿瘤） N（对照） 突变类型 50%

0% 体细胞突变 GT

50%

50%

生殖细胞突变

Science Translational Medicine 15 Apr 2015: Vol. 7, Issue 283

拷贝数变异(CNV)检测的原理

影响CNV检测的因素： 实验的重复性

不同类型样本基线的建立 CNV本身的大小

融合基因检测示意图

常用生物信息软件与数据库

•数据分析软件：

BWA＋GATK Suite for Germline Variants

MuTect /GATKSomatic Indel /Contra for Somatic Variants

•公共数据库：

•肿瘤突变相关数据库：

•临床用药信息数据库：

高通量测序的检测灵敏度

Sanger测序：10-15% ARMS PCR 检测：1% ddPCR检测：0.1%

高通量测序：？

高通量测序检测灵敏度与测序深度的关系

5条Reads确定一个可信突变

测序深度决定检测灵敏度

肿瘤样本

1%的肿瘤含有该突变 （肿瘤的纯度、取样方式影响非常大）

50%的数据利用率 最少5条reads确定一个突变

Y=5/0.5/0.01=1000X

上机测序

液体活检-ctDNA检测

乳腺癌甲基化

肺癌KRAS 黑色素瘤BRAF

结直肠癌KRAS 肝癌/卵巢癌TP53

胰腺癌KRAS 乳腺癌TP53

1948年首次描述了游离核酸存在于人的血液中； 1994年癌症患者血液中检测到重要癌基因RAS变异； 液体活检，ctDNA可反映癌症演化过程的动态信息； ctDNA由于其巨大的应用价值，被称为下一代癌症指标。

*Nature.Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients.2011.

ctDNA的高通量检测

ctDNA在血浆中的比例：

不同肿瘤，不同TNM分期ctDNA差别很大， 低至0.01%，检测技术难度很大。

高灵敏度检测：位点检测 or 高通量检测

方法 灵敏度 优势

缺陷

Clamping PCR Digital-PCR BEAMing

Sequenom UltraSEEKTM

0.1-1%

操作简单 速度较快

探针需要验证

受限于模板量，对于低频突变只能做单个或几个位点的检测 （多重引物）

ctDNA检测：

5ml全血 2ml血浆 ≈30~50ng cfDNA（健康人）≈ 10~20ng原始测序模板

（50%制备损失率）

≈ 3000~6000个基因组 （3pg/genome）

对于0.1%频率突变，高通量测序可实现多基因多突变的一次性采集

低频纠错检测技术的开发

新的实验与数据分析方法可将测序背景错误下降至0.0001%~0.001%。

高通量测序对0.01%~0.1%的突变检测变成可能。

Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Sep 4;109(36):14508-13

低频纠错检测技术

可实现0.01~0.1%突变

比例的高通量精准检测

肿瘤精准用药—单基因到多基因

NCI-MATCH打响精准医疗第一枪

同癌异治

（伞试验）

肺癌患者 外周血 组织

基因检测 异癌同治 （篮子试验）

外周血 组织

基因检测

NCI-MATCH基因与药物

药物 Crizotinib

Crizotinib

Dabrafenib和 Trametinib

Trametinib

Afatinib

Afatinib 靶点 ALK重排 ROS1 易位 BRAF V600E or V600K突变 BRAF Fusions/ Non-V600E/Non-V600K BRAF 突变 EGFR HER2 估算的突变频率 4% 5% 7% 2.80% 1-4% 2-5% AZD9291

Ado-trastuzumab emtansine

VS6063

Sunitinib EGFR T790M 突变 and 稀有的 EGFR突变 HER2扩增 NF2缺失 cKIT突变 1-2% 5% 2% 4%

a、所有实体肿瘤和淋巴瘤患者，不区分癌症类型；

b、列表显示2015年6月入组基因与药物，不停在增加；

c、目前基因检测范围包含200-300个药靶基因

ctDNA作为预后复发监测的指标

Digital PCR方法

断点检测方法

基于ctDNA的复发监测与疗效评估

ScienceTranslationalMedicine. 26 August 2015 Vol 7 Issue 302

ctDNA在结直肠癌患者复发监测的应用