水中粪大肠菌群检测方法及其研究进展张济龙何吉明等
水中粪大肠菌群检测方法及其研究进展
张济龙，何吉明，何
（巴中市环境监测站，四川
摘
敏
巴中636000）
要：水体受粪便污染后可导致肠道病毒的扩散和传播，粪大肠菌群恰可准确地反映水体受粪便污染的
状况，因此，对粪大肠菌群的检测是否精确、快速对疾病的预防有至关重要的作用。本文对目前粪大肠菌群的分析方法及其研究改进进行了综述和比较，认为目前水中粪大肠菌群的检测可优先选择纸片法和酶底物法，而经过改进的多管发酵法（EC培养法，乳糖蛋白胨培养法），若再加以验证完善，亦可成为一个好的选择。
关键词：水体；粪大肠菌群；检测方法中图分类号：X830．2
文献标识码：A
文章编号：1007－2454（2012）02－089－04
粪大肠菌群是能在44．5℃±0．5℃温度下生
长的耐热的大肠菌群，属于总大肠菌群的一部分，即属于革兰氏阴性无芽孢杆菌。粪大肠菌群来源于粪便中的细菌，它与水中某些病毒有直接的关系，肠道病毒离开活的宿主不会繁殖，但在水环境
存活时间长达数天或数中有显著的存活能力，月
［1］
水样适当稀释）的水样，接种于乳糖蛋白胨中进
行初发酵，同一体积的水样要接种5管，在37℃±0．5℃培养24±2h后观察其是否产酸产气，若产酸产气，则将水样继续接种EC培养基并在44．5℃±0．5℃下培养24±2h加以验证，如仍产
查MPN表计算酸产气则认定为粪大肠菌群阳性，
［2、3］
。最可能数
1．2方法特点：多管发酵法是粪大肠菌群检测的［3］
经典方法，也是目前的国标方法，该方法技术要求相对较低、分析成本亦较低、得到结果较准
。一旦被粪便污染，就存在肠道病原菌污染
引起肠道传染病甚至流行病的可能。因此，粪大肠菌群的检测可准确及时地监控水源水受粪便污
染的状况，为相关部门有效预报和控制流行疾病的发生与传播提供重要依据。
目前，粪大肠菌群的检测方法可分为多管发酵法、快速纸片法、滤膜法、酶底物法、荧光原位杂
PCR技术等。由于荧光原位杂交（FISH）技术、
PCR技术分析仪器昂贵、交（FISH）技术、操作难
度大，目前在实际样品分析中很少采用。因此，本文仅对多管发酵法、快速纸片法、滤膜法、酶底物法的研究及改进进展进行了综述和对比，以期为广大检测人员选择简单、准确的方法提供一定的参考。11．1
多管发酵法
检测方法：水样混匀后，取3个不同体积（清洁地表水一般为10ml、1ml、0．1ml，受污染的
收稿日期：2012－04－20
确，但检测操作步骤繁琐，并需要验证试验，耗时
分析测试人员较少或样品量较大时完成检测长，
任务有较大的难度。
1．3研究进展：水体中粪大肠菌群的检测主要是以粪大肠菌群的复发酵试验（即在44．5℃条件下仍能以产酸产气）加以判断，因此，吕琦，陈之江
尝试直接将地表水样接种于EC培养液中，按多管发酵标准法原理计算粪大肠杆菌群数，以）。便快速检测（该方法以下简称为“EC培养法”试验表明：不经过初发酵，把水样直接接种于EC培养液中，在44．5℃水浴中培养24h后，其检出值均落在多管发酵标准法95%可信限值内，两者总体无显著差异，排除偶然干扰后，直接用EC培
［4］
89
青海环境第23卷第2期（总第84期）2012年6月
养液培养法测定与标准法测定的结果极为一致。冯青英等则将水样接种至乳糖蛋白胨培养液后，在44．5℃±0．5℃培养箱中培养24h记录结“乳糖蛋白胨培养法”），果（该方法以下简称为同
两者在时与改进前的方法进行比对。结果表明，结果上无统计学意义的差别，即改进法用于地表
水和废水水样的检测结果是可靠的。
针对目前基层环境监测机构分析测试任务重、测试人员较少等问题，谢嵘将多管发酵标准法
表1
水样类型清洁的湖水、井水一般的江河、塘水城市内的河、湖、塘水城市原污水表2
接种量（ml）清洁地表水
受污染地表水和废水备注：高浓度应做更高的稀释
稀释比1：101：1001：10001：10000
［5］
［6，7］
。五管法是先将水样改进为五管法和十管法
10、1、混匀并适当稀释，取稀释后的水样100、
0．1、0．01ml各接种1管（表1），十管法则是每个
样品用二种不同的水样量接种，每种水样量接种初发酵和复发酵实验的方法和标准五管（表2），
方法相同。实验表明：五管法和十管法的测定结果与国家标准方法测定结果存在差异，但这种差异极小，可被忽略。
五管法水样接种表
接种水量（ml）10、1、取稀释后取水样100、0．1、0．01ml各接种1管
十管法水样接种表10取用
1取用取用
取用0．1
备注：若接种量为100ml，则试管内应装有50ml三倍乳糖蛋白胨培养液；若接种量为10ml，则试管内应装有5ml三倍乳则可接种于10ml单倍乳糖蛋白胨培养液中。糖蛋白胨培养液；若接种量为1ml或少于1ml，
2滤膜法
2．1检测方法：取混合均匀并适当稀释后的水样，
将水样注入已灭菌的放有滤膜（0．45um）的滤器经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜中，
44．5℃温度下培养24±2h，贴在M－FC培养基上，
选择在M－FC培养基上生长的蓝色或蓝绿色菌
落进行计数，以此计算每升水样中含有的粪大肠菌群数。
2．2方法特点：滤膜法可精确检测出1个粪大肠菌群，能够较为准确地判断水样的微生物污染状况
［2，8］
间内，但滤膜法M－FC培养基中不加玫瑰色酸
的测定结果与多管发酵法的结果偏差相对较小。3
快速纸片法
3．1检测方法：接种5张大纸片（纸片的规格是15cm×10cm），每张接种10ml水样；接种10张小纸片（纸片的规格是5cm×6cm），其中5张各接种1ml水样，另5张接种1：10稀释水样各1ml。置于45℃培养18～24h，观察结果（纸片上出现紫红色菌落，周围有黄圈者或出现片状红晕，周围为黄色者为阳性），根据阳性纸片张数，查MPN值表，
［10］
报出结果。3．2
方法特点：该方法是将粪大肠菌群细菌所需要的营养成分、作用底物乳糖、指示剂（溴甲酚紫、红四氮唑）和选择性抑菌剂吸附于限定的纸片上。如有大肠菌群细菌生长，则分解乳糖产酸使纸片变黄；并作用于底物使之脱氢，氢与红四氮唑结合生成不可逆的红色化合物，使菌落形成红色或红晕，指示粪大肠菌群细菌的存在。与发酵法需两步监测报出结果相比，纸片法只需一步，45℃培
，但检测多个水样时需要准备大量已灭菌的
且若发现可疑菌落时需进行验证试验。滤器，
2．3研究进展：滤膜法虽可准确检测粪大肠菌群数量，但其检测结果与多管发酵法所得结果的可比性一直备受关注。桂芳
［9］
以兰州市城水供水地
面水水源为样本，对M－FC培养基采用加玫瑰色酸和不加玫瑰色酸两种方法与多管发酵法进行对
结果表明：培养基中加与不加玫瑰色酸的检测比，
结果虽都在多管发酵法检测结果的95%置信区90
水中粪大肠菌群检测方法及其研究进展
养18～24h即可报出结果。纸片法快速省时省力、简便易行，适宜污染事故的应急监测和监测
［11］工作量大、人员少的监测单位应用。
3．3研究进展：快速测定纸片由山东省疾病预防
张济龙何吉明等
人力要求以及实验过程中的样品污染风险明显低于传统的多管发酵法。缺点一是该方法使用的培养基目前只有国外生产商供应，使得检测成本较高；二是在定量检测时（51孔），酶底物法的定量检测能力（最大200MPN/100ml）不如多管发酵法（最大1600MPN/100ml），对于污染比较严重的生活饮用水，酶底物法只能先将水样适当稀释后再进行检测。4．3
研究进展：由于酶底物法在我国应用时间较且试剂较昂贵，目前国内对于酶底物法的研究短，
基本集中在该方法与传统多管发酵法结果的一致
［16，17，18］
性上。大量的比对实验表明：固定底物酶底物法与多管发酵法检测结果虽有一定差异，但偏差极小，两者在结果一致性方面无统计学意义上的显著性差异，即两种方法可以等效。5结语及展望
快速纸片法以其操作简便、检测周期短等优点目前备受检测人员的青睐，但其尚未被认定为国家标准方法；酶底物法目前已经被世界各国及地方实验室和世界各组织机构认可，我国也已将《生活饮用水标准检测方法》（GB/T5750—其列入2006）中，若其培养基实现国产化，这两项检测技术在未来具有广阔的应用前景。而经过改进的多管发酵法，如EC培养法、乳糖蛋白胨培养法，检测时间大大缩短，且无需验证试验；五管法、十管法亦大幅减少了样品培养管数，大大降低了人力和时间的投入。由于多管发酵法本身具有易推广性且目前已被广大检测人员掌握，若再加以验证完善，亦可得到应用与普及。
研究表明：纸片法检测污水中控制中心研制而成，
粪大肠菌群与试管发酵法检测结果符合率达
95%以上，快检试纸检测阳性结果与发酵法完全一致，纸片法与发酵法检测出阳性结果的最高稀
［12］
释度完全相同，出现的阳性份数基本相近。赵凌宇
以苏州地表水样品为样本，研究了不同培养时间对测定值的影响，结果表明：纸片法的培养时间对阳性管率有明显影响，且培养16h以后的MPN值均无显著差异。但由于培养时间过长，纸片容易干，对分析结果的准确性和及时性有影响，认为16～18h是比较理想的培养时间。44．1
酶底物法
检测方法：根据水样的污染程度，用无菌瓶取已适当稀释并混合均匀的待测水样100ml，加
［13］
入Colilert（科立得）试剂1份，充分混匀溶解，倒入51孔或97孔定量盘，封口，放入44．5℃±0．2℃培养箱中培养24h后与标准比色盘比较，孔中水样变黄者为粪大肠菌群阳性，据阳性孔数对照MPN表，再根据稀释度计算出原水样的粪大肠
［2，14，15］
。菌群数4．2
方法特点：固定底物酶底物法具有操作简
便，检测时间短，在普通实验室（无需在无菌室内
使用）即可完成检测工作，可在24h内同时检测总大肠菌群和粪大肠菌群数，且无需确认实验，可精确检测出100ml水样中的1个粪大肠菌群，单次样品操作时间极短（一般不超过1分钟），实验室
表3
检测方法
国标多管发酵法EC培养法乳糖蛋白胨培养法五管法十管法滤膜法快速纸片法酶底物法
检测时间48h24h24h48h48h48h24h24h
粪大肠菌群各监测方法一览表
检测步骤繁琐简易简易繁琐繁琐繁琐简易简易
验证实验需要不需要不需要需要需要需要不需要不需要
准确性较准确较准确较准确较准确较准确较准确较准确精确
检测费用便宜便宜便宜便宜便宜便宜较便宜较昂贵
91
青海环境参考文献：
第23卷第2期（总第84期）
～120．
2012年6月
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水中粪大肠菌群检测方法及其研究进展张济龙何吉明等
水中粪大肠菌群检测方法及其研究进展
张济龙，何吉明，何
（巴中市环境监测站，四川
摘
敏
巴中636000）
要：水体受粪便污染后可导致肠道病毒的扩散和传播，粪大肠菌群恰可准确地反映水体受粪便污染的
状况，因此，对粪大肠菌群的检测是否精确、快速对疾病的预防有至关重要的作用。本文对目前粪大肠菌群的分析方法及其研究改进进行了综述和比较，认为目前水中粪大肠菌群的检测可优先选择纸片法和酶底物法，而经过改进的多管发酵法（EC培养法，乳糖蛋白胨培养法），若再加以验证完善，亦可成为一个好的选择。
关键词：水体；粪大肠菌群；检测方法中图分类号：X830．2
文献标识码：A
文章编号：1007－2454（2012）02－089－04
粪大肠菌群是能在44．5℃±0．5℃温度下生
长的耐热的大肠菌群，属于总大肠菌群的一部分，即属于革兰氏阴性无芽孢杆菌。粪大肠菌群来源于粪便中的细菌，它与水中某些病毒有直接的关系，肠道病毒离开活的宿主不会繁殖，但在水环境
存活时间长达数天或数中有显著的存活能力，月
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水样适当稀释）的水样，接种于乳糖蛋白胨中进
行初发酵，同一体积的水样要接种5管，在37℃±0．5℃培养24±2h后观察其是否产酸产气，若产酸产气，则将水样继续接种EC培养基并在44．5℃±0．5℃下培养24±2h加以验证，如仍产
查MPN表计算酸产气则认定为粪大肠菌群阳性，
［2、3］
。最可能数
1．2方法特点：多管发酵法是粪大肠菌群检测的［3］
经典方法，也是目前的国标方法，该方法技术要求相对较低、分析成本亦较低、得到结果较准
。一旦被粪便污染，就存在肠道病原菌污染
引起肠道传染病甚至流行病的可能。因此，粪大肠菌群的检测可准确及时地监控水源水受粪便污
染的状况，为相关部门有效预报和控制流行疾病的发生与传播提供重要依据。
目前，粪大肠菌群的检测方法可分为多管发酵法、快速纸片法、滤膜法、酶底物法、荧光原位杂
PCR技术等。由于荧光原位杂交（FISH）技术、
PCR技术分析仪器昂贵、交（FISH）技术、操作难
度大，目前在实际样品分析中很少采用。因此，本文仅对多管发酵法、快速纸片法、滤膜法、酶底物法的研究及改进进展进行了综述和对比，以期为广大检测人员选择简单、准确的方法提供一定的参考。11．1
多管发酵法
检测方法：水样混匀后，取3个不同体积（清洁地表水一般为10ml、1ml、0．1ml，受污染的
收稿日期：2012－04－20
确，但检测操作步骤繁琐，并需要验证试验，耗时
分析测试人员较少或样品量较大时完成检测长，
任务有较大的难度。
1．3研究进展：水体中粪大肠菌群的检测主要是以粪大肠菌群的复发酵试验（即在44．5℃条件下仍能以产酸产气）加以判断，因此，吕琦，陈之江
尝试直接将地表水样接种于EC培养液中，按多管发酵标准法原理计算粪大肠杆菌群数，以）。便快速检测（该方法以下简称为“EC培养法”试验表明：不经过初发酵，把水样直接接种于EC培养液中，在44．5℃水浴中培养24h后，其检出值均落在多管发酵标准法95%可信限值内，两者总体无显著差异，排除偶然干扰后，直接用EC培
［4］
89
青海环境第23卷第2期（总第84期）2012年6月
养液培养法测定与标准法测定的结果极为一致。冯青英等则将水样接种至乳糖蛋白胨培养液后，在44．5℃±0．5℃培养箱中培养24h记录结“乳糖蛋白胨培养法”），果（该方法以下简称为同
两者在时与改进前的方法进行比对。结果表明，结果上无统计学意义的差别，即改进法用于地表
水和废水水样的检测结果是可靠的。
针对目前基层环境监测机构分析测试任务重、测试人员较少等问题，谢嵘将多管发酵标准法
表1
水样类型清洁的湖水、井水一般的江河、塘水城市内的河、湖、塘水城市原污水表2
接种量（ml）清洁地表水
受污染地表水和废水备注：高浓度应做更高的稀释
稀释比1：101：1001：10001：10000
［5］
［6，7］
。五管法是先将水样改进为五管法和十管法
10、1、混匀并适当稀释，取稀释后的水样100、
0．1、0．01ml各接种1管（表1），十管法则是每个
样品用二种不同的水样量接种，每种水样量接种初发酵和复发酵实验的方法和标准五管（表2），
方法相同。实验表明：五管法和十管法的测定结果与国家标准方法测定结果存在差异，但这种差异极小，可被忽略。
五管法水样接种表
接种水量（ml）10、1、取稀释后取水样100、0．1、0．01ml各接种1管
十管法水样接种表10取用
1取用取用
取用0．1
备注：若接种量为100ml，则试管内应装有50ml三倍乳糖蛋白胨培养液；若接种量为10ml，则试管内应装有5ml三倍乳则可接种于10ml单倍乳糖蛋白胨培养液中。糖蛋白胨培养液；若接种量为1ml或少于1ml，
2滤膜法
2．1检测方法：取混合均匀并适当稀释后的水样，
将水样注入已灭菌的放有滤膜（0．45um）的滤器经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜中，
44．5℃温度下培养24±2h，贴在M－FC培养基上，
选择在M－FC培养基上生长的蓝色或蓝绿色菌
落进行计数，以此计算每升水样中含有的粪大肠菌群数。
2．2方法特点：滤膜法可精确检测出1个粪大肠菌群，能够较为准确地判断水样的微生物污染状况
［2，8］
间内，但滤膜法M－FC培养基中不加玫瑰色酸
的测定结果与多管发酵法的结果偏差相对较小。3
快速纸片法
3．1检测方法：接种5张大纸片（纸片的规格是15cm×10cm），每张接种10ml水样；接种10张小纸片（纸片的规格是5cm×6cm），其中5张各接种1ml水样，另5张接种1：10稀释水样各1ml。置于45℃培养18～24h，观察结果（纸片上出现紫红色菌落，周围有黄圈者或出现片状红晕，周围为黄色者为阳性），根据阳性纸片张数，查MPN值表，
［10］
报出结果。3．2
方法特点：该方法是将粪大肠菌群细菌所需要的营养成分、作用底物乳糖、指示剂（溴甲酚紫、红四氮唑）和选择性抑菌剂吸附于限定的纸片上。如有大肠菌群细菌生长，则分解乳糖产酸使纸片变黄；并作用于底物使之脱氢，氢与红四氮唑结合生成不可逆的红色化合物，使菌落形成红色或红晕，指示粪大肠菌群细菌的存在。与发酵法需两步监测报出结果相比，纸片法只需一步，45℃培
，但检测多个水样时需要准备大量已灭菌的
且若发现可疑菌落时需进行验证试验。滤器，
2．3研究进展：滤膜法虽可准确检测粪大肠菌群数量，但其检测结果与多管发酵法所得结果的可比性一直备受关注。桂芳
［9］
以兰州市城水供水地
面水水源为样本，对M－FC培养基采用加玫瑰色酸和不加玫瑰色酸两种方法与多管发酵法进行对
结果表明：培养基中加与不加玫瑰色酸的检测比，
结果虽都在多管发酵法检测结果的95%置信区90
水中粪大肠菌群检测方法及其研究进展
养18～24h即可报出结果。纸片法快速省时省力、简便易行，适宜污染事故的应急监测和监测
［11］工作量大、人员少的监测单位应用。
3．3研究进展：快速测定纸片由山东省疾病预防
张济龙何吉明等
人力要求以及实验过程中的样品污染风险明显低于传统的多管发酵法。缺点一是该方法使用的培养基目前只有国外生产商供应，使得检测成本较高；二是在定量检测时（51孔），酶底物法的定量检测能力（最大200MPN/100ml）不如多管发酵法（最大1600MPN/100ml），对于污染比较严重的生活饮用水，酶底物法只能先将水样适当稀释后再进行检测。4．3
研究进展：由于酶底物法在我国应用时间较且试剂较昂贵，目前国内对于酶底物法的研究短，
基本集中在该方法与传统多管发酵法结果的一致
［16，17，18］
性上。大量的比对实验表明：固定底物酶底物法与多管发酵法检测结果虽有一定差异，但偏差极小，两者在结果一致性方面无统计学意义上的显著性差异，即两种方法可以等效。5结语及展望
快速纸片法以其操作简便、检测周期短等优点目前备受检测人员的青睐，但其尚未被认定为国家标准方法；酶底物法目前已经被世界各国及地方实验室和世界各组织机构认可，我国也已将《生活饮用水标准检测方法》（GB/T5750—其列入2006）中，若其培养基实现国产化，这两项检测技术在未来具有广阔的应用前景。而经过改进的多管发酵法，如EC培养法、乳糖蛋白胨培养法，检测时间大大缩短，且无需验证试验；五管法、十管法亦大幅减少了样品培养管数，大大降低了人力和时间的投入。由于多管发酵法本身具有易推广性且目前已被广大检测人员掌握，若再加以验证完善，亦可得到应用与普及。
研究表明：纸片法检测污水中控制中心研制而成，
粪大肠菌群与试管发酵法检测结果符合率达
95%以上，快检试纸检测阳性结果与发酵法完全一致，纸片法与发酵法检测出阳性结果的最高稀
［12］
释度完全相同，出现的阳性份数基本相近。赵凌宇
以苏州地表水样品为样本，研究了不同培养时间对测定值的影响，结果表明：纸片法的培养时间对阳性管率有明显影响，且培养16h以后的MPN值均无显著差异。但由于培养时间过长，纸片容易干，对分析结果的准确性和及时性有影响，认为16～18h是比较理想的培养时间。44．1
酶底物法
检测方法：根据水样的污染程度，用无菌瓶取已适当稀释并混合均匀的待测水样100ml，加
［13］
入Colilert（科立得）试剂1份，充分混匀溶解，倒入51孔或97孔定量盘，封口，放入44．5℃±0．2℃培养箱中培养24h后与标准比色盘比较，孔中水样变黄者为粪大肠菌群阳性，据阳性孔数对照MPN表，再根据稀释度计算出原水样的粪大肠
［2，14，15］
。菌群数4．2
方法特点：固定底物酶底物法具有操作简
便，检测时间短，在普通实验室（无需在无菌室内
使用）即可完成检测工作，可在24h内同时检测总大肠菌群和粪大肠菌群数，且无需确认实验，可精确检测出100ml水样中的1个粪大肠菌群，单次样品操作时间极短（一般不超过1分钟），实验室
表3
检测方法
国标多管发酵法EC培养法乳糖蛋白胨培养法五管法十管法滤膜法快速纸片法酶底物法
检测时间48h24h24h48h48h48h24h24h
粪大肠菌群各监测方法一览表
检测步骤繁琐简易简易繁琐繁琐繁琐简易简易
验证实验需要不需要不需要需要需要需要不需要不需要
准确性较准确较准确较准确较准确较准确较准确较准确精确
检测费用便宜便宜便宜便宜便宜便宜较便宜较昂贵
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青海环境参考文献：
第23卷第2期（总第84期）
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2012年6月
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