第１８卷第４期
Ｖ０１．１８
Ｎｏ．４
草
ＡＣＴＡ
地
学报
ＳｌＮＩＣＡ
２０１０拒Ｊｕｌ．
７月
２０１０
ＡＧＲＥＳＴＩＡ
紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化
靳苗苗１，杨青川孙，金
洪Ｈ，康俊梅２，龙瑞才３
（１．内蒙古农业大学，呼和浩特０１００１９｝２．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１００１９３；３．重庆大学，重庆４０００４４）
摘要：柠檬酸合成酶是调节植物体内有机酸的活性酶之一，增加植物体内的柠檬酸可以提高植物对土壤中磷的吸收以及抗铝毒性。通过从紫花苜蓿（ＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａＬ．）中克隆柠檬酸合成酶摹圜（Ｍｓ（：Ｓ），以期获得该基因全长，并为将来研究紫花苜蓿耐锊ｊ性以及对磷的吸收方向提供基础。首先利用ｃＤＮＡ末端快速扩增方法（ＲＡＣＥ），克隆获得ＭｓＣＳ的ｅＤＮＡ全序列，然后利用ｐＢｌｌ２１构建植物超表达载体ｐＢｌ—ＭｓＣＳ，通过农杆菌介导的叶盘法转化烟
草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）。结果显示：该基因序列全长为２０３１ｂｐ，开放阅读框１５５１ｂｐ，编码５１７个氨基酸。与其他物种的柠檬酸合成酶具有高度的同源性。获得１７株卡那抗性植株。经ＰＣＲ检测有６株为阳性植株，初步表明该基冈已整合到烟草的基因组中。
关键词：紫花苘蓿；柠檬酸合成酶基因；基因克隆；载体构建；转化
中图分类号：Ｑ９４６．５
文献标识码：Ａ
文章编号：１００７—０４３５（２０１０）０４－０５５０－０６
Ｃｌｏｎｉｎｇｏｆ
ＭｓＣＳ
Ｇｅｎｅｆｒｏｍ
Ｍｅｄｉｃａｇｏ
ｓａｔｉｖａＬ．
ａｎｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＴｏｂａｃｃｏｓ
ＪＩＮＭｉａｏ－ｍｉａ０１，ＹＡＮＧＱｉｎｇ—ｃｈｕａｎ孙，ＪＩＮＨｏｎｇ¨，ＫＡＮＧＪｕｎ－ｍｅｉ２，ＬＯＮＧＲｕｉ－ｃａｉ３
（１．ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｈｏｈｈｏｔ．ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎ０１００１９。Ｃｈｉｎａ
Ｃｈｉｎｅｓｅ
２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，
Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９４，ＣｈｉｎａＩ３．ＣｈｏｎｇＱｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００４４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｃｉｔｒａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ａｎａｃｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅ，ｃａｎｒｅｇｕｌａｔｅｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄｓｉｎｐｌａｎｔｓ．ＩｎｃｒｅａｓｉｎｇｃｉｔｒｉｃａｃｉｄｃａｎｉｍｐｒｏｖｅｐｌａｎｔｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆａｂｓｏｒｂｉｎｇｓｏｉｌｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓａｎｄａｌｓｏａｆｆｅｃｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏａｌｕｍｉｎｕｍｔＯＸ—ｉｃｉｔｙ．ＴｈｅｇｅｎｅｎａｍｅｄＭｓＣＳｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍａｌｆａｌｆａ（ＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａＬ．）ｆｏｒａｌｆａｌｆａｔｏｐｒｏｃｅｅｄｗｉｔｈｈａｓ—ｉＣｒｅｓｅａｒｃｈｏｆａｌｕｍｉｎｕｍｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｓｏｉｌａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｆｏｒｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ．Ｆｉｒｓｔａｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆＭｓＣＳｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）．ＴｈｅｎｔｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｎａｍｅｄｐＢＩ—
ＭｓＣＳ
ｐＢｌ１２ｌｖｅｃｔｏｒ，ａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｔｈｅｔｏｂａｃｃｏｂｙｕｓｉｎｇａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ—ｍｅｄｉａｔｅｄ．
ＲｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｔｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ２０３ｌｂｐａｎｄｉｎｃｌｕｄｅｄａ１５５１ｂｐｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ
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ｄｅｄｕｃｅｄｐｒｏｔｅｉｎｏｆ５ｌ７一ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ．Ｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｒｅ—
ｖｅａｌｅｄｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｃｉｔｒａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｏｆｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓ．Ｗｅｏｂｔａｉｎｅｄａｔｏｔａｌｏｆ１７ｋａｎａｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｃｏｎｆｉｒｍｅｄ６ｐｏｓｉｔｉｖｅｐｌａｎｔｓ，ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｉｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＭｓＣＳ
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ｗｏｒｄｓ：Ｍｅｄｉｃａｇｏ
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Ｌ．；＾以ＣＳｇｅｎｅ；Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ；Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
柠檬酸合成酶是三羧酸循环（ＴＣＡ）中合成柠檬酸的一个关键酶，而柠檬酸是ＴＣＡ循环中重要的中间产物。柠檬酸通过穿梭作用输入到细胞质中合成其他物质的重要碳源，如谷氨酸、脂肪酸［１］；另外，柠檬酸还可以从根部向外分泌，这也是植物适应逆境的重要机制之一。柠檬酸对二价和三价阳离子具有高亲和性，可与质膜外部不溶性磷酸盐中的金属离子，如铝离子，进行螫合作用，置换出磷酸根离子，使得磷素更易被植物吸收［２］，而且这种螯合作用
收稿日期：２０１０—０３—３０：修回日期：２０１０—０５—１８
基金项目：国家科技支撑计划（２００６ＢＡＤ０１Ａ１９—３）资助
也可以解决土壤中铝毒对植物的侵害。在Ｆｕｅｎｔｅ等‘３１研究中发现在将从细菌中分离出的柠檬酸合成酶基因导入番木瓜中，转基因番木瓜在３００肛ｍＬ叫铝浓度下仍能生根且根系生长良好；而对照在５０“ｍ・Ｌ＇１铝浓度下其根系生长受显著抑制。通过向植物体内转入外源的柠檬酸合成酶基因，可增强其体内柠檬酸酶活性，进一步修饰植物体内柠檬酸代谢。修饰有机酸代谢，可提高柠檬酸合成酶的活性，使植物体内生成更多的柠檬酸，增加植物根系
作者简介：靳菌苗（１９８４一），女，内蒙古鄂尔多斯人，硕士研究生，研究方向为植物资源利用与保护方面的研究，Ｅ—ｍａｉｌ：ｎａｎｃｙ０１９４｛园ｑｑ．
ｃｏｍ；＊通讯作者Ａｕｔｈｏｒｆｏｒｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，ｑｅｈｙａｎ９６６＠ｙａｈｏｏ．ｔｏｍ．ｃｎ，ｊｉｎｈｏｎ９９１５＠１６３．ｃｏｒｎ
第４期靳苗茁等：紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化
５５１
柠檬酸分泌量，达到鳌合酸性土壤中Ａ１３＋的目的，从而降低铝对植物的毒害Ｌ４Ｊ。增加植物体内的柠檬酸可以提高植物对土壤中磷的吸收以及抗铝毒性。
紫花苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ
ｓａｔｉｖａ
Ｌ．）（以下简称苜
蓿）是优良的豆科牧草，目前全世界种植面积达３０００多万ｈｍ２，我国属世界上栽培利用苜蓿较多的国家之一。全国共有１４个省区种植苜蓿，主产区以华北、西北为主［５］，但苜蓿在南方种植相当有限。苜蓿在南方种植受到抑制的主要因素是否为土壤偏酸性？根据近几年研究表明，部分半秋眠和非秋眠紫花苜蓿品种可在强酸性土壤中正常生长。李剑峰等［６１利用沙培方法研究了紫花苜蓿生长与土壤酸度的关系，发现仅就酸度而言，ｐＨ＝５的酸性环境最适于苜蓿的生长发育。因此，酸性土壤中除酸性外，还有其他因素限制苜蓿生长。其中，Ａ１３＋是酸性土壤中作物生长重要的限制因素之一［７矗］，一般通过提高营养液中钙的浓度［９Ｊ０］以及向红壤中施用石灰ｎＬ”ｏ等方法，来减轻Ａ１３＋对植物生长的抑制作用。但有研究显示，向土壤中过量施用石灰除成本较高外，也会给作物生长和土壤环境带来不良影
响ｕ３｜。因此，利用遗传转化的手段将柠檬酸合成酶
基因转化到不耐铝的植株中，提高植物的耐铝性，这样可以更好地从根本上解决Ａ１３＋对植物的毒害。
本研究利用ｃＤＮＡ末端快速扩增方法（ＲＡＣＥ）获得该基因的序列全长，构建了植物表达载体，并转化烟草以鉴定功能，为其应用于提高植株的耐酸性以及抗铝毒的基因Ｔ程打下理论基础。
１材料与方法
１．１实验材料
１．１．１
植物材料紫花苜蓿耐盐品种中苜一号
（Ｚｈｏｎｇｍｕ
ＮＯ．１），由中国农业科学院畜牧研究所
牧草研究室提供，烟草ＮＣ８９（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ
Ｌ．ＣＶ．ＮＣ８９）由本研究室保存。
１．１．２
药品与试剂ＲＡＣＥ试剂盒，Ｔ４连接酶，
ＰＭＤｌ９一Ｔ载体，限制性内切酶等均购自ＴａＫａＲａ公司，Ｔｒｚｏｌ试剂，反转录酶（ＲＴａｓｅ），ＲＮＡ酶抑制
剂（ＲｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ），大肠杆菌ＤＨ５ａ菌株购置北
京天根生物公司，高保真酶购自北京全式金公司，植物表达载体ＰＢｌｌ２１，农杆菌ＬＢＡ４４０４菌株由本实验室保存。
１．２实验方法
１．２．１
总ＲＮＡ的提取和保守序列的克隆ＴｒＺｏｌ
法提取生长期为１０ｄ的紫花苜蓿植株的总ＲＮＡ，将其逆转录成ｃＤＮＡ。在ＮＣＢＩ上查找其他植物的
同源基因，利用Ｐｒｉｍｅｒ５．０设计简并引物ＭｓＣ孓１：
５７一ＴＡＴＴＧＡＣＧＧＴＧＡＴＧＡＧＧＧＧＡＴＴＣＴＴ一３
７．
ＭｓＣＳ－２：５＇－Ｇ肖∞Ｔ℃ＣＡＡＡＡＣＣＡ（；ＡＧＡＧＣｌｌ］＿（）（；一
３’。以ｃＤＮＡ为模板用简并引物进行ＰＣＲ扩增，其程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ后，９４℃３０
ｓ，５５℃３０
ｓ，
７２℃ｌ
ｍｉｎ，３０个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产
物连接到Ｔ载体上，转化ＤＨ５ａ，筛选阳性克隆送华
大基因测序。
１．２．２
ＲＡＣＥ克隆根据所获得的保守序列，设计
引物，用ＳＭＡＴＴＭＲＡＣＥ试剂盒提供的３’引物与合成的ＭｓＣＳ３’ｒａｃｅ特异性引物（ＭｓＣＳ３，－１），根据说明书进行ＰＣＲ扩增，实验得到３’端序列。以同样的方法克隆出５’端序列。测序后，利用ＤＮＡｍａｎ拼接全长，根据全长重新设计引物，在引物５’端引入酶切位点ＸｂａＩ和ＳｍａＩ，利用高保真酶扩增ＭｓＣＳ全长的ｃＤＮＡ，连接到Ｔ载体上，转化ＤＨＳａ，筛选阳性克隆送华大基因测序。
１．２．３
载体构建用限制性内切酶双酶切带有柠
檬酸合成酶ｃＤＮＡ的Ｔ载体和植物表达载体ｐＢｌｌ２１，载体构建策略如图１，切胶回收目的片段后，用Ｔ４连接酶进行连接，然后转化大肠杆菌，经抗生素的筛选后进一步提取质粒，然后酶切鉴定。
图１ＭｓＣＳ基因表达载体的构建图
Ｆｉ舀１
Ｓｃｈｅｍｅｓｏｆ００ｎｓｔｒＬ】ｃｔｉＩｌｇｏｆｅｘｐｒｅ％ｉｏｎ
ｖｅｃｔｏｒｓ
ｆｏｒ＾蠡ＣＳｇｅｎｅ
１．２．４烟草转化与鉴定制备农杆菌感受态，将得到的植物超表达载体质粒用冻融法导入农杆菌ＬＢＡ４４０４，叶盘法转化烟草。以转化再生植株的ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ所用的上下游引物分别为：ＭｓＣＳ７：５＇－ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡ
ＣＧＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ一３’，ＭｓＣＳ８：５’一ＡＴＣＣＣＧＧＧ—
ＴＡＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣＡＧＣＡＡＧ３’，其扩增程序为：
９４℃预变性５ｒａｉｎ后，９４℃３０
ｓ，５８℃３０
ｓ，７２℃
２
ｍｉｎ，３０个循环，７２℃延伸１０
ｍｉｎ。以质粒ｐＢＩ—
５５２
草地学报
第１８卷
ＭｓＣＳ为阳性对照，非转基因烟草ＤＮＡ为阴性对照。反应完成后做电泳检测。
用简并引物ＭｓＣＳ－１与ＭｓＣＳ－２ＰＣＲ扩增出了７５９ｂｐ的紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因保守序列，该序列与大豆等植物的柠檬酸合成酶基因保守区同源性达８０％以上。根据保守序列设计引物进行５７ＲＡＣＥ
与３７ＲＡＣＥ，分别经两轮巢式扩增，获得５’和３７序列（图２Ａ，Ｂ）。
２结果与分析
２．１
ＭｓＣＳ基因全长ｃＤＮＡ的克隆与序列分析
以紫花苜蓿总ＲＮＡ逆转录的ｅＤＮＡ为模板，
图２ＭｓＣＳ基因的５７端和３’端ＲＡＣＥ产物以及ＭｓＣＳ基因全长ＰＣＲ产物
Ｆｉｇ．２
５７，３７ＲＡＣＥａｎｄｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈＰＣＲｒｅｓｕｌｔｏｆｐｌｕｓＭａｒｋｅｒ，１：５１ＲＡＣＥ
ＰＣＲ
ｒｅｓｕｌｔｏｆ
ＭｓＣＳ
ｇｅｎｅ
Ｍ：ＤＮＡ
２０００
ＭｓＣＳｇｅｎｅ。２：３’ＲＡＣＥｒｅｓｕｌｔｏｆ
ＭｓＣＳ
ｇｅｎｅ
ＭｓＣＳｇｅｎｅ，３：Ｔｈｅ
ｐｒｏｄｕｃｔ
ｏｆｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈｏｆ
经序列拼接设计引物，扩增全长ｃＤＮＡ，如图２Ｃ。测序表明，该基因ｃＤＮＡ全序列共２０３１ｂｐ，其中５７端非编码区３９ｂｐ，３’端非编码区４３４ｂｐ，开放阅读框包含１５５１ｂｐ，编码５１７个氨基酸残基，所编码的蛋白质分子量为５６．７４３ＫＤａ。其核苷酸序列及其推导的氨基酸序列如图３。该核酸序列与大豆，葡萄，南瓜的ＣＳ基因同源性分别达８７％、８１％
和８０％。在ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｃａｎ—
ＭｓＣＳｃＤＮＡ的Ｔ＿载体和植物表达载体ｐＢｌｌ２１，分别回收切开的载体ｐＢｌｌ２１和带黏性末端的ＭｓＣＳ，用Ｔ４连接酶连接过夜，连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，菌落经ＰＣＲ扩增初步鉴定基因已连接于载体上。挑选阳性菌落摇菌，提取质粒，用Ｘ６口Ｉ和
Ｓｍａ
Ｉ进行双酶切鉴定（图５），得到目的片段大小
与预测一致。经测序表明，得到序列完全正确，植物超表达载体ｐＢｌｌ２１一ＭｓＣＳ构建成功。２．３转基因烟草的获得和鉴定
用冻融法将构建的植物表达载体ＰＢｌｌ２１一ＭｓＣＳ导人根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４中，挑取阳性菌落摇菌，提取质粒ＤＮＡ，双酶切鉴定，得到２个条带，大小与预期一致，说明植物超表达载体ｐＢｌｌ２１一ＭｓＣＳ已成功转入农杆菌中。叶盘于卡那抗性培养基上筛选培养，２周左右即长出愈伤，并从中长出丛生小芽。待芽长至１～２ｃｍ左右切下，放于培养基上生根培养，获得１７株抗性植株。提取抗性烟草植株的基因组ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增检测，以携带目的基因的质粒载体为阳性对照，非转基因的烟草基因组ＤＮＡ为阴性对照，电泳结果显示有６株为阳性
（图６）。
ｐｒｏｓｉｔｅ／上输入ＭｓＣＳ蛋白序列，其分析表明紫花苜蓿ＣＳ氨基酸序列包含植物ＣＳ的特征，含有一段１３个氨基酸的高等植物柠檬酸合成酶高度保守区域（图３）基因已登录在ＮＣＢＩ上，登录号为
ＡＤＧ３７６５５．１。
柠檬酸普遍存在于各种牛物的三羧酸循环中，对生物体内的糖代谢，脂肪及蛋白质的代谢具有重要的生理意义。利用ＤＮＡＭＡＮ和ＭＥＧＡ４软件将紫花苜蓿的ＣＳ与毛果杨，蓖麻，高粱，水稻，拟南芥，大豆的ＣＳ序列相似性比较，发现紫花苜蓿ＣＳ基因与大豆的ＣＳ基因相似性高达９０％以上（图４）。２．２植物表达载体的构建及酶切鉴定
用内切酶ＸｂａＩ和Ｓｍａ１分别双酶切带有
第４期靳苗苗等：紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化
５５３
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围３
Ｆｉｇ．３
Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ
ｔｈｅ
ＭｓＣＳ基因ｃＤＮＡ及其氨基酸序列
ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｐｒｅｄｉｃｔｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄ
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ｏｆ
ＭｓＣＳ
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ｒｅｇｉｏｎ（３７５—３８７，
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ｓｅｑｕｅｎｃｅ．
ｐｏｌｙｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ
ｂｏｘｅｄ
３讨论
柠檬酸合成酶基因是参与草酰乙酸和乙酰辅酶Ａ缩合产生柠檬酸的一个关键酶，这个生化反应在ＴＣＡ循环、脂肪酸的Ｂ一氧化作用和光呼吸的乙醛酸循环途径中起重要作用。酶的活性受ＡＴＰ、ＮＡＤＨ、琥珀酰辅酶Ａ和长链脂肪酰辅酶Ａ等抑
制［１４。，也是柠檬酸循环中的限速酶。Ｙａｎｇ等［１５３对决明的研究发现，柠檬酸的分泌与铝浓度密切相关，随着土壤中铝浓度不断升高，其分泌的量也随之增加；柠檬酸合成酶的活性及柠檬酸的积累均与铝胁迫存在一定关联。近年来对有机酸和植物受铝胁迫之间的关系较为重视。铝毒可诱导植物根系积累和分泌有机酸；而有机酸，尤其是低分子有机酸可影响
５５４
草地学报
第１８卷
ｉｃａ
Ｇｒｏｕｐ
Ｐ。———Ｈ
Ｏ．０２
图５双酶切鉴定
Ｆｉｇ．５Ｍ：ＤＮＡ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
２０００
图４紫花苜蓿ＣＳ与其它植物ＣＳ的相似性比较
Ｆｉｇ．４
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｐＢｌ—ＭｓＣＳ
ａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆＣＳ
ｇｅｎｅ
ｆｒｏｍ
ｐｌｕｓＭａｒｋｅｒ１：ｐＢｌｌ２１一ＭｓＣＳ
Ｓｍａ
ｂａｃｔｅｒｉａ，ｆｕｎｇｉ，ａｌｇａ，ａｎｄｐｌａｎｔｓ
ＸＰ
００２３２２８７５．１
ｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＸ６ｎＩａｎｄ
Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ毛果杨ｌ
ＸＰ００２５３２６８８．１
Ｉ
根尖的土壤环境，对植物的根际营养具有重要的作用ｍ］。当根系处于高水平铝环境中时，一些植物根际的ｐＨ值上升，从而刺激根系分泌柠檬酸、苹果酸等Ⅲｏ。柠檬酸亦可与三价铝离子形成稳定的螯合结构，这样在解铝毒方面要比苹果酸更为有效。
Ｒｉｃｉｎｕｓ
ｃｏｍｍｕｎｉｓ蓖麻ＩＸＰ
Ｏｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ
００２４５１８２８．１Ｓｏｒｇｈｕｍ
ｂｉｃｏｌｏｒ高粱；
１８１８０７．１
ＮＰ００１０４６３７３
ＪａｐｏｎｉｃａＧｒｏｕｐ水稻；ＮＰ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ拟南芥；ＡＤＧ３７６５５．１口ｆ如ｚｆａ紫花苜蓿；
ＢＡＧ０９３８９．１
Ｇｌｙｃｉｎｅ
ｍ口Ｔ大豆
图６烟草再生植株的ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ．６
ｏｂｔａｉｎｍｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＰＣＲ
Ａ：抗性烟草幼苗；Ｂ：抗性生根烟草；Ｃ：ＰＣＲ鉴定图
Ａ：ｔｏｂａｃｃｏ
ｓｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆａｎｔｉ—ｋａｎａｍｙｃｉｎ；Ｂ：ｔｏｂａｃｃｏｓｈｏｏｔｓｏｆ２０００
ａｎｔｉ—ｋａｎａｍｙｃｉｎ；Ｃ：ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｍ：ＤＮＡ
ｐｌｕｓＭａｒｋｅｒ；１：＋ＣＫ；２；一ＣＫ；３—８：ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓ
柠檬酸在植物对于土壤中难溶性磷的吸收也起着重要作用。磷是植物必需的营养元素，也是作物生长的一个主要限制因子。一般情况下，磷素只有在中性土壤ｐＨ值范同内才能被植物吸收。在酸性土壤中，磷酸根离子与铝离子形成低溶解性的磷酸铝化合物，极易对根系产生毒害作用。在低磷的环境下，许多植物通过调节有机酸代谢中酶的活性来提高有机酸的分泌量，以提高植物对土壤中难溶性磷的利用ｎ８‘。Ｋｏｙａｍａ等［１９】研究胡萝卜细胞系中过量表达拟南芥的线粒体型ＣＳｃＤＮＡ的实验中发现，转基因细胞在磷酸铝培养基上柠檬酸的分泌量是野生的２．８—４．０倍，最高ＣＳ活性为０．２４ｐ
・ｍｇ＿１
ｔｏｏｌ
大大提高，生长速率也高于野生型细胞。
柠檬酸对于植物的耐铝毒以及对土壤中磷的吸收等方面有很重要的调节作用，在尝试对柠檬酸代谢进行遗传操作时，从整体上考虑柠檬酸上游和下游的酶以及代谢产物亦很重要。增加与柠檬酸合成有关的酶类，如柠檬酸合成酶等的活性，可增加柠檬酸的生成量。研究紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因及其功能，进一步揭示紫花苜蓿柠檬酸合成与积累的机理，对于提高植物的耐铝性研究具有借鉴作用。
４
结论
紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因在ＮＣＢＩ上登录号
ｐｒｏ・ｒａｉｎ＿１是野生型细胞ＣＳ活性的１．９
倍。实验结果说明，转基因细胞对于磷酸盐的吸收
为ＡＤＧ３７６５５．１，该基因ｃＤＮＡ序列全长２０３１ｂｐ，
第４期靳苗莆等：紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化
５５５
其中５’端非编码区３９ｂｐ，３’端非编码区４３４ｂｐ，其包含一个完整的开放阅读框１５５１ｂｐ，编码５１７个氨基酸残基，所编码的蛋白质分子量为５６．７４３
ＫＤａ。
利用软件分析发现，该基因与大豆、拟南芥、水稻和高粱的ＣＳ基因具有高度的同源性，且都达到９０％以上。在对烟草进行遗传转化的实验中，成功地构建了植物表达载体ｐＢｌｌ２１－ＭｓＣＳ，并利用农杆菌介导法以及叶盘法，成功地将紫花苜蓿的柠檬酸合成酶基因转化到烟草中去，表明该基因可在烟草中初
步表达。参考文献
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［２０３刘小琳，康俊梅，孙彦，等．ＭｓＮＨＸｌ基因转化紫花苜蓿及转基
因植株的鉴定［Ｊ］．草地学报，２００８，１６（２）：１１９－１２０
（责任编辑李扬）
紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化
作者：作者单位：
靳苗苗， 杨青川， 金洪， 康俊梅， 龙瑞才， JIN Miao-miao， YANG Qing-chuan，JIN Hong， KANG Jun-mei， LONG Rui-cai
靳苗苗,金洪,JIN Miao-miao,JIN Hong(内蒙古农业大学,呼和浩特,010019)， 杨青川,康俊梅,YANG Qing-chuan,KANG Jun-mei(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193)，龙瑞才,LONG Rui-cai(重庆大学,重庆,400044)草地学报
ACTA AGRECTIR SINICA2010,18(4)6次
刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
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本文链接：http://d.wanfangdata.com.cn/Periodical_cdxb201004013.aspx
第１８卷第４期
Ｖ０１．１８
Ｎｏ．４
草
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地
学报
ＳｌＮＩＣＡ
２０１０拒Ｊｕｌ．
７月
２０１０
ＡＧＲＥＳＴＩＡ
紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化
靳苗苗１，杨青川孙，金
洪Ｈ，康俊梅２，龙瑞才３
（１．内蒙古农业大学，呼和浩特０１００１９｝２．中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京１００１９３；３．重庆大学，重庆４０００４４）
摘要：柠檬酸合成酶是调节植物体内有机酸的活性酶之一，增加植物体内的柠檬酸可以提高植物对土壤中磷的吸收以及抗铝毒性。通过从紫花苜蓿（ＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａＬ．）中克隆柠檬酸合成酶摹圜（Ｍｓ（：Ｓ），以期获得该基因全长，并为将来研究紫花苜蓿耐锊ｊ性以及对磷的吸收方向提供基础。首先利用ｃＤＮＡ末端快速扩增方法（ＲＡＣＥ），克隆获得ＭｓＣＳ的ｅＤＮＡ全序列，然后利用ｐＢｌｌ２１构建植物超表达载体ｐＢｌ—ＭｓＣＳ，通过农杆菌介导的叶盘法转化烟
草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）。结果显示：该基因序列全长为２０３１ｂｐ，开放阅读框１５５１ｂｐ，编码５１７个氨基酸。与其他物种的柠檬酸合成酶具有高度的同源性。获得１７株卡那抗性植株。经ＰＣＲ检测有６株为阳性植株，初步表明该基冈已整合到烟草的基因组中。
关键词：紫花苘蓿；柠檬酸合成酶基因；基因克隆；载体构建；转化
中图分类号：Ｑ９４６．５
文献标识码：Ａ
文章编号：１００７—０４３５（２０１０）０４－０５５０－０６
Ｃｌｏｎｉｎｇｏｆ
ＭｓＣＳ
Ｇｅｎｅｆｒｏｍ
Ｍｅｄｉｃａｇｏ
ｓａｔｉｖａＬ．
ａｎｄＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＴｏｂａｃｃｏｓ
ＪＩＮＭｉａｏ－ｍｉａ０１，ＹＡＮＧＱｉｎｇ—ｃｈｕａｎ孙，ＪＩＮＨｏｎｇ¨，ＫＡＮＧＪｕｎ－ｍｅｉ２，ＬＯＮＧＲｕｉ－ｃａｉ３
（１．ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｈｏｈｈｏｔ．ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｕｔｏｎｏｍｏｕｓＲｅｇｉｏｎ０１００１９。Ｃｈｉｎａ
Ｃｈｉｎｅｓｅ
２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，
Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ
ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９４，ＣｈｉｎａＩ３．ＣｈｏｎｇＱｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０００４４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅｃｉｔｒａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ａｎａｃｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅ，ｃａｎｒｅｇｕｌａｔｅｏｒｇａｎｉｃａｃｉｄｓｉｎｐｌａｎｔｓ．ＩｎｃｒｅａｓｉｎｇｃｉｔｒｉｃａｃｉｄｃａｎｉｍｐｒｏｖｅｐｌａｎｔｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆａｂｓｏｒｂｉｎｇｓｏｉｌｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓａｎｄａｌｓｏａｆｆｅｃｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏａｌｕｍｉｎｕｍｔＯＸ—ｉｃｉｔｙ．ＴｈｅｇｅｎｅｎａｍｅｄＭｓＣＳｗａｓｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍａｌｆａｌｆａ（ＭｅｄｉｃａｇｏｓａｔｉｖａＬ．）ｆｏｒａｌｆａｌｆａｔｏｐｒｏｃｅｅｄｗｉｔｈｈａｓ—ｉＣｒｅｓｅａｒｃｈｏｆａｌｕｍｉｎｕｍｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｓｏｉｌａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｆｏｒｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ．Ｆｉｒｓｔａｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈｃＤＮＡｏｆＭｓＣＳｗａｓｃｌｏｎｅｄｂｙｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）．ＴｈｅｎｔｈｅｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｎａｍｅｄｐＢＩ—
ＭｓＣＳ
ｐＢｌ１２ｌｖｅｃｔｏｒ，ａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｔｈｅｔｏｂａｃｃｏｂｙｕｓｉｎｇａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ—ｍｅｄｉａｔｅｄ．
ＲｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｔｈｅｌｅｎｇｔｈｏｆｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓ２０３ｌｂｐａｎｄｉｎｃｌｕｄｅｄａ１５５１ｂｐｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ
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ｖｅａｌｅｄｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙｗｉｔｈｃｉｔｒａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅｏｆｏｔｈｅｒｐｌａｎｔｓ．Ｗｅｏｂｔａｉｎｅｄａｔｏｔａｌｏｆ１７ｋａｎａｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｃｏｎｆｉｒｍｅｄ６ｐｏｓｉｔｉｖｅｐｌａｎｔｓ，ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｉｅｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＭｓＣＳ
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Ｌ．；＾以ＣＳｇｅｎｅ；Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｖｅｃｔｏｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ；Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
柠檬酸合成酶是三羧酸循环（ＴＣＡ）中合成柠檬酸的一个关键酶，而柠檬酸是ＴＣＡ循环中重要的中间产物。柠檬酸通过穿梭作用输入到细胞质中合成其他物质的重要碳源，如谷氨酸、脂肪酸［１］；另外，柠檬酸还可以从根部向外分泌，这也是植物适应逆境的重要机制之一。柠檬酸对二价和三价阳离子具有高亲和性，可与质膜外部不溶性磷酸盐中的金属离子，如铝离子，进行螫合作用，置换出磷酸根离子，使得磷素更易被植物吸收［２］，而且这种螯合作用
收稿日期：２０１０—０３—３０：修回日期：２０１０—０５—１８
基金项目：国家科技支撑计划（２００６ＢＡＤ０１Ａ１９—３）资助
也可以解决土壤中铝毒对植物的侵害。在Ｆｕｅｎｔｅ等‘３１研究中发现在将从细菌中分离出的柠檬酸合成酶基因导入番木瓜中，转基因番木瓜在３００肛ｍＬ叫铝浓度下仍能生根且根系生长良好；而对照在５０“ｍ・Ｌ＇１铝浓度下其根系生长受显著抑制。通过向植物体内转入外源的柠檬酸合成酶基因，可增强其体内柠檬酸酶活性，进一步修饰植物体内柠檬酸代谢。修饰有机酸代谢，可提高柠檬酸合成酶的活性，使植物体内生成更多的柠檬酸，增加植物根系
作者简介：靳菌苗（１９８４一），女，内蒙古鄂尔多斯人，硕士研究生，研究方向为植物资源利用与保护方面的研究，Ｅ—ｍａｉｌ：ｎａｎｃｙ０１９４｛园ｑｑ．
ｃｏｍ；＊通讯作者Ａｕｔｈｏｒｆｏｒｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，ｑｅｈｙａｎ９６６＠ｙａｈｏｏ．ｔｏｍ．ｃｎ，ｊｉｎｈｏｎ９９１５＠１６３．ｃｏｒｎ
第４期靳苗茁等：紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化
５５１
柠檬酸分泌量，达到鳌合酸性土壤中Ａ１３＋的目的，从而降低铝对植物的毒害Ｌ４Ｊ。增加植物体内的柠檬酸可以提高植物对土壤中磷的吸收以及抗铝毒性。
紫花苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ
ｓａｔｉｖａ
Ｌ．）（以下简称苜
蓿）是优良的豆科牧草，目前全世界种植面积达３０００多万ｈｍ２，我国属世界上栽培利用苜蓿较多的国家之一。全国共有１４个省区种植苜蓿，主产区以华北、西北为主［５］，但苜蓿在南方种植相当有限。苜蓿在南方种植受到抑制的主要因素是否为土壤偏酸性？根据近几年研究表明，部分半秋眠和非秋眠紫花苜蓿品种可在强酸性土壤中正常生长。李剑峰等［６１利用沙培方法研究了紫花苜蓿生长与土壤酸度的关系，发现仅就酸度而言，ｐＨ＝５的酸性环境最适于苜蓿的生长发育。因此，酸性土壤中除酸性外，还有其他因素限制苜蓿生长。其中，Ａ１３＋是酸性土壤中作物生长重要的限制因素之一［７矗］，一般通过提高营养液中钙的浓度［９Ｊ０］以及向红壤中施用石灰ｎＬ”ｏ等方法，来减轻Ａ１３＋对植物生长的抑制作用。但有研究显示，向土壤中过量施用石灰除成本较高外，也会给作物生长和土壤环境带来不良影
响ｕ３｜。因此，利用遗传转化的手段将柠檬酸合成酶
基因转化到不耐铝的植株中，提高植物的耐铝性，这样可以更好地从根本上解决Ａ１３＋对植物的毒害。
本研究利用ｃＤＮＡ末端快速扩增方法（ＲＡＣＥ）获得该基因的序列全长，构建了植物表达载体，并转化烟草以鉴定功能，为其应用于提高植株的耐酸性以及抗铝毒的基因Ｔ程打下理论基础。
１材料与方法
１．１实验材料
１．１．１
植物材料紫花苜蓿耐盐品种中苜一号
（Ｚｈｏｎｇｍｕ
ＮＯ．１），由中国农业科学院畜牧研究所
牧草研究室提供，烟草ＮＣ８９（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ
Ｌ．ＣＶ．ＮＣ８９）由本研究室保存。
１．１．２
药品与试剂ＲＡＣＥ试剂盒，Ｔ４连接酶，
ＰＭＤｌ９一Ｔ载体，限制性内切酶等均购自ＴａＫａＲａ公司，Ｔｒｚｏｌ试剂，反转录酶（ＲＴａｓｅ），ＲＮＡ酶抑制
剂（ＲｎａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ），大肠杆菌ＤＨ５ａ菌株购置北
京天根生物公司，高保真酶购自北京全式金公司，植物表达载体ＰＢｌｌ２１，农杆菌ＬＢＡ４４０４菌株由本实验室保存。
１．２实验方法
１．２．１
总ＲＮＡ的提取和保守序列的克隆ＴｒＺｏｌ
法提取生长期为１０ｄ的紫花苜蓿植株的总ＲＮＡ，将其逆转录成ｃＤＮＡ。在ＮＣＢＩ上查找其他植物的
同源基因，利用Ｐｒｉｍｅｒ５．０设计简并引物ＭｓＣ孓１：
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７．
ＭｓＣＳ－２：５＇－Ｇ肖∞Ｔ℃ＣＡＡＡＡＣＣＡ（；ＡＧＡＧＣｌｌ］＿（）（；一
３’。以ｃＤＮＡ为模板用简并引物进行ＰＣＲ扩增，其程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ后，９４℃３０
ｓ，５５℃３０
ｓ，
７２℃ｌ
ｍｉｎ，３０个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产
物连接到Ｔ载体上，转化ＤＨ５ａ，筛选阳性克隆送华
大基因测序。
１．２．２
ＲＡＣＥ克隆根据所获得的保守序列，设计
引物，用ＳＭＡＴＴＭＲＡＣＥ试剂盒提供的３’引物与合成的ＭｓＣＳ３’ｒａｃｅ特异性引物（ＭｓＣＳ３，－１），根据说明书进行ＰＣＲ扩增，实验得到３’端序列。以同样的方法克隆出５’端序列。测序后，利用ＤＮＡｍａｎ拼接全长，根据全长重新设计引物，在引物５’端引入酶切位点ＸｂａＩ和ＳｍａＩ，利用高保真酶扩增ＭｓＣＳ全长的ｃＤＮＡ，连接到Ｔ载体上，转化ＤＨＳａ，筛选阳性克隆送华大基因测序。
１．２．３
载体构建用限制性内切酶双酶切带有柠
檬酸合成酶ｃＤＮＡ的Ｔ载体和植物表达载体ｐＢｌｌ２１，载体构建策略如图１，切胶回收目的片段后，用Ｔ４连接酶进行连接，然后转化大肠杆菌，经抗生素的筛选后进一步提取质粒，然后酶切鉴定。
图１ＭｓＣＳ基因表达载体的构建图
Ｆｉ舀１
Ｓｃｈｅｍｅｓｏｆ００ｎｓｔｒＬ】ｃｔｉＩｌｇｏｆｅｘｐｒｅ％ｉｏｎ
ｖｅｃｔｏｒｓ
ｆｏｒ＾蠡ＣＳｇｅｎｅ
１．２．４烟草转化与鉴定制备农杆菌感受态，将得到的植物超表达载体质粒用冻融法导入农杆菌ＬＢＡ４４０４，叶盘法转化烟草。以转化再生植株的ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ所用的上下游引物分别为：ＭｓＣＳ７：５＇－ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＴＣＡＡ
ＣＧＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣ一３’，ＭｓＣＳ８：５’一ＡＴＣＣＣＧＧＧ—
ＴＡＴＣＣＣＡＧＡＴＣＣＡＧＣＡＡＧ３’，其扩增程序为：
９４℃预变性５ｒａｉｎ后，９４℃３０
ｓ，５８℃３０
ｓ，７２℃
２
ｍｉｎ，３０个循环，７２℃延伸１０
ｍｉｎ。以质粒ｐＢＩ—
５５２
草地学报
第１８卷
ＭｓＣＳ为阳性对照，非转基因烟草ＤＮＡ为阴性对照。反应完成后做电泳检测。
用简并引物ＭｓＣＳ－１与ＭｓＣＳ－２ＰＣＲ扩增出了７５９ｂｐ的紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因保守序列，该序列与大豆等植物的柠檬酸合成酶基因保守区同源性达８０％以上。根据保守序列设计引物进行５７ＲＡＣＥ
与３７ＲＡＣＥ，分别经两轮巢式扩增，获得５’和３７序列（图２Ａ，Ｂ）。
２结果与分析
２．１
ＭｓＣＳ基因全长ｃＤＮＡ的克隆与序列分析
以紫花苜蓿总ＲＮＡ逆转录的ｅＤＮＡ为模板，
图２ＭｓＣＳ基因的５７端和３’端ＲＡＣＥ产物以及ＭｓＣＳ基因全长ＰＣＲ产物
Ｆｉｇ．２
５７，３７ＲＡＣＥａｎｄｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈＰＣＲｒｅｓｕｌｔｏｆｐｌｕｓＭａｒｋｅｒ，１：５１ＲＡＣＥ
ＰＣＲ
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ｇｅｎｅ
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２０００
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ＭｓＣＳ
ｇｅｎｅ
ＭｓＣＳｇｅｎｅ，３：Ｔｈｅ
ｐｒｏｄｕｃｔ
ｏｆｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈｏｆ
经序列拼接设计引物，扩增全长ｃＤＮＡ，如图２Ｃ。测序表明，该基因ｃＤＮＡ全序列共２０３１ｂｐ，其中５７端非编码区３９ｂｐ，３’端非编码区４３４ｂｐ，开放阅读框包含１５５１ｂｐ，编码５１７个氨基酸残基，所编码的蛋白质分子量为５６．７４３ＫＤａ。其核苷酸序列及其推导的氨基酸序列如图３。该核酸序列与大豆，葡萄，南瓜的ＣＳ基因同源性分别达８７％、８１％
和８０％。在ｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｓｃａｎ—
ＭｓＣＳｃＤＮＡ的Ｔ＿载体和植物表达载体ｐＢｌｌ２１，分别回收切开的载体ｐＢｌｌ２１和带黏性末端的ＭｓＣＳ，用Ｔ４连接酶连接过夜，连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，菌落经ＰＣＲ扩增初步鉴定基因已连接于载体上。挑选阳性菌落摇菌，提取质粒，用Ｘ６口Ｉ和
Ｓｍａ
Ｉ进行双酶切鉴定（图５），得到目的片段大小
与预测一致。经测序表明，得到序列完全正确，植物超表达载体ｐＢｌｌ２１一ＭｓＣＳ构建成功。２．３转基因烟草的获得和鉴定
用冻融法将构建的植物表达载体ＰＢｌｌ２１一ＭｓＣＳ导人根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４中，挑取阳性菌落摇菌，提取质粒ＤＮＡ，双酶切鉴定，得到２个条带，大小与预期一致，说明植物超表达载体ｐＢｌｌ２１一ＭｓＣＳ已成功转入农杆菌中。叶盘于卡那抗性培养基上筛选培养，２周左右即长出愈伤，并从中长出丛生小芽。待芽长至１～２ｃｍ左右切下，放于培养基上生根培养，获得１７株抗性植株。提取抗性烟草植株的基因组ＤＮＡ，ＰＣＲ扩增检测，以携带目的基因的质粒载体为阳性对照，非转基因的烟草基因组ＤＮＡ为阴性对照，电泳结果显示有６株为阳性
（图６）。
ｐｒｏｓｉｔｅ／上输入ＭｓＣＳ蛋白序列，其分析表明紫花苜蓿ＣＳ氨基酸序列包含植物ＣＳ的特征，含有一段１３个氨基酸的高等植物柠檬酸合成酶高度保守区域（图３）基因已登录在ＮＣＢＩ上，登录号为
ＡＤＧ３７６５５．１。
柠檬酸普遍存在于各种牛物的三羧酸循环中，对生物体内的糖代谢，脂肪及蛋白质的代谢具有重要的生理意义。利用ＤＮＡＭＡＮ和ＭＥＧＡ４软件将紫花苜蓿的ＣＳ与毛果杨，蓖麻，高粱，水稻，拟南芥，大豆的ＣＳ序列相似性比较，发现紫花苜蓿ＣＳ基因与大豆的ＣＳ基因相似性高达９０％以上（图４）。２．２植物表达载体的构建及酶切鉴定
用内切酶ＸｂａＩ和Ｓｍａ１分别双酶切带有
第４期靳苗苗等：紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化
５５３
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围３
Ｆｉｇ．３
Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆ
ｔｈｅ
ＭｓＣＳ基因ｃＤＮＡ及其氨基酸序列
ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｐｒｅｄｉｃｔｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｏｆ
ＭｓＣＳ
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Ａ
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ｔｈｅｄｅｄｕｃｅｄａｍｉｎｏａｃｉｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ．
ｐｏｌｙｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ
ｂｏｘｅｄ
３讨论
柠檬酸合成酶基因是参与草酰乙酸和乙酰辅酶Ａ缩合产生柠檬酸的一个关键酶，这个生化反应在ＴＣＡ循环、脂肪酸的Ｂ一氧化作用和光呼吸的乙醛酸循环途径中起重要作用。酶的活性受ＡＴＰ、ＮＡＤＨ、琥珀酰辅酶Ａ和长链脂肪酰辅酶Ａ等抑
制［１４。，也是柠檬酸循环中的限速酶。Ｙａｎｇ等［１５３对决明的研究发现，柠檬酸的分泌与铝浓度密切相关，随着土壤中铝浓度不断升高，其分泌的量也随之增加；柠檬酸合成酶的活性及柠檬酸的积累均与铝胁迫存在一定关联。近年来对有机酸和植物受铝胁迫之间的关系较为重视。铝毒可诱导植物根系积累和分泌有机酸；而有机酸，尤其是低分子有机酸可影响
５５４
草地学报
第１８卷
ｉｃａ
Ｇｒｏｕｐ
Ｐ。———Ｈ
Ｏ．０２
图５双酶切鉴定
Ｆｉｇ．５Ｍ：ＤＮＡ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ
２０００
图４紫花苜蓿ＣＳ与其它植物ＣＳ的相似性比较
Ｆｉｇ．４
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｐＢｌ—ＭｓＣＳ
ａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆＣＳ
ｇｅｎｅ
ｆｒｏｍ
ｐｌｕｓＭａｒｋｅｒ１：ｐＢｌｌ２１一ＭｓＣＳ
Ｓｍａ
ｂａｃｔｅｒｉａ，ｆｕｎｇｉ，ａｌｇａ，ａｎｄｐｌａｎｔｓ
ＸＰ
００２３２２８７５．１
ｄｉｇｅｓｔｅｄｗｉｔｈＸ６ｎＩａｎｄ
Ｐｏｐｕｌｕｓｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ毛果杨ｌ
ＸＰ００２５３２６８８．１
Ｉ
根尖的土壤环境，对植物的根际营养具有重要的作用ｍ］。当根系处于高水平铝环境中时，一些植物根际的ｐＨ值上升，从而刺激根系分泌柠檬酸、苹果酸等Ⅲｏ。柠檬酸亦可与三价铝离子形成稳定的螯合结构，这样在解铝毒方面要比苹果酸更为有效。
Ｒｉｃｉｎｕｓ
ｃｏｍｍｕｎｉｓ蓖麻ＩＸＰ
Ｏｒｙｚａ
ｓａｔｉｖａ
００２４５１８２８．１Ｓｏｒｇｈｕｍ
ｂｉｃｏｌｏｒ高粱；
１８１８０７．１
ＮＰ００１０４６３７３
ＪａｐｏｎｉｃａＧｒｏｕｐ水稻；ＮＰ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ拟南芥；ＡＤＧ３７６５５．１口ｆ如ｚｆａ紫花苜蓿；
ＢＡＧ０９３８９．１
Ｇｌｙｃｉｎｅ
ｍ口Ｔ大豆
图６烟草再生植株的ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ．６
ｏｂｔａｉｎｍｅｎｔｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙＰＣＲ
Ａ：抗性烟草幼苗；Ｂ：抗性生根烟草；Ｃ：ＰＣＲ鉴定图
Ａ：ｔｏｂａｃｃｏ
ｓｅｅｄｉｎｇｓ
ｏｆａｎｔｉ—ｋａｎａｍｙｃｉｎ；Ｂ：ｔｏｂａｃｃｏｓｈｏｏｔｓｏｆ２０００
ａｎｔｉ—ｋａｎａｍｙｃｉｎ；Ｃ：ＰＣＲｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｍ：ＤＮＡ
ｐｌｕｓＭａｒｋｅｒ；１：＋ＣＫ；２；一ＣＫ；３—８：ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓ
柠檬酸在植物对于土壤中难溶性磷的吸收也起着重要作用。磷是植物必需的营养元素，也是作物生长的一个主要限制因子。一般情况下，磷素只有在中性土壤ｐＨ值范同内才能被植物吸收。在酸性土壤中，磷酸根离子与铝离子形成低溶解性的磷酸铝化合物，极易对根系产生毒害作用。在低磷的环境下，许多植物通过调节有机酸代谢中酶的活性来提高有机酸的分泌量，以提高植物对土壤中难溶性磷的利用ｎ８‘。Ｋｏｙａｍａ等［１９】研究胡萝卜细胞系中过量表达拟南芥的线粒体型ＣＳｃＤＮＡ的实验中发现，转基因细胞在磷酸铝培养基上柠檬酸的分泌量是野生的２．８—４．０倍，最高ＣＳ活性为０．２４ｐ
・ｍｇ＿１
ｔｏｏｌ
大大提高，生长速率也高于野生型细胞。
柠檬酸对于植物的耐铝毒以及对土壤中磷的吸收等方面有很重要的调节作用，在尝试对柠檬酸代谢进行遗传操作时，从整体上考虑柠檬酸上游和下游的酶以及代谢产物亦很重要。增加与柠檬酸合成有关的酶类，如柠檬酸合成酶等的活性，可增加柠檬酸的生成量。研究紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因及其功能，进一步揭示紫花苜蓿柠檬酸合成与积累的机理，对于提高植物的耐铝性研究具有借鉴作用。
４
结论
紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因在ＮＣＢＩ上登录号
ｐｒｏ・ｒａｉｎ＿１是野生型细胞ＣＳ活性的１．９
倍。实验结果说明，转基因细胞对于磷酸盐的吸收
为ＡＤＧ３７６５５．１，该基因ｃＤＮＡ序列全长２０３１ｂｐ，
第４期靳苗莆等：紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化
５５５
其中５’端非编码区３９ｂｐ，３’端非编码区４３４ｂｐ，其包含一个完整的开放阅读框１５５１ｂｐ，编码５１７个氨基酸残基，所编码的蛋白质分子量为５６．７４３
ＫＤａ。
利用软件分析发现，该基因与大豆、拟南芥、水稻和高粱的ＣＳ基因具有高度的同源性，且都达到９０％以上。在对烟草进行遗传转化的实验中，成功地构建了植物表达载体ｐＢｌｌ２１－ＭｓＣＳ，并利用农杆菌介导法以及叶盘法，成功地将紫花苜蓿的柠檬酸合成酶基因转化到烟草中去，表明该基因可在烟草中初
步表达。参考文献
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（责任编辑李扬）
紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化
作者：作者单位：
靳苗苗， 杨青川， 金洪， 康俊梅， 龙瑞才， JIN Miao-miao， YANG Qing-chuan，JIN Hong， KANG Jun-mei， LONG Rui-cai
靳苗苗,金洪,JIN Miao-miao,JIN Hong(内蒙古农业大学,呼和浩特,010019)， 杨青川,康俊梅,YANG Qing-chuan,KANG Jun-mei(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100193)，龙瑞才,LONG Rui-cai(重庆大学,重庆,400044)草地学报
ACTA AGRECTIR SINICA2010,18(4)6次
刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：
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