酵母表达系统研究进展与展望1

第２３卷第２期２００８年４月

北京农学院学报

ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＢＥＩＪＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ

Ｖ０１．２３，Ｎｏ．２

Ａｐｒ．．２００８

酵母表达系统研究进展与展望

董清华

＇

沈元月

（北京农学院植物科学技术系，北京１０２２０６）

摘要：酵母不仅已成为现代分子生物学研究最重要的工具之一，也是表达外源基因比较理想的宿主。笔者概

括酵母表达系统的主要种类，并从外源基因特性、启动子的影响、外源基因拷贝数和稳定性及表达条件等方面综述影响酵母表达外源蛋白的因素，最后对酵母表达系统发展进行展望。

关键词：酵母表达系统；基因；外源表达；影响因素中图分类号：Ｑ８１６

文献标志码：Ａ

文章编号：１００２—３１８６（２００８）０２—００７２—０４

ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒｅｓｓａｎｄＰｒｏｓｐｅｃｔｓ

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ＹｅａｓｔＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

Ｓｙｓｔｅｍｓ

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（ＤｅｐｅｒｔｍｅｎｔｏｆＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅａｎｄ

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Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｙｅａｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓ；ｇｅｎｅ；ｆｏｒｅｉｇｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｆａｃｔｏｒｓ

随着基因组研究迅速发展，越来越多的新基因被克隆和分离，基因功能的研究已成为２１世纪生命科学领域中的重大课题。基因表达技术是基因工程技术的核心。至今，人们已建立许多基因表达系统，包括原核生物基因表达系统和真核生物基因表达系统，如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、曲霉、酵母、昆虫、哺乳动物细胞。一般而言，用原核细胞作宿主表达真核基因操作简单，成本低，但有时会因为所表达的外源基因的产物不能正确的折叠或缺少翻译后的修饰导致产物没有生物活性。虽然采用哺乳类细胞作宿主可以解决以上问题，但操作困难，产率低，且有时会导致病毒感染。

酵母是一种低等的单细胞真核生物，它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作等特

点，同时又具有真核生物蛋白质加工、折叠、翻译后修饰等的功能。特别是最近几年迅速发展起来的酵母第二代外源蛋白表达系统：甲醇酵母基因表达系统，还具有遗传稳定、高密度发酵、表达量高、易于纯化等优点。因此，酵母现已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型，是表达外源基因比较理想的宿主，笔者综述这方面的最新研究进展。

主要酵母表达系统

酵母一般分成三大类：（１）酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏ－

ｍｙｃｅｓ

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ），又称面包酵母；（２）粟酒裂殖酵

母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）；（３）非常规酵母

（Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｙｅａｓｔ），是指除酿酒酵母和粟酒

裂殖酵母外的酵母统称，主要有巴氏毕赤酵母

收稿日期：２００８—０１—１０；修订日期：２００８—０３－２０

基金项目：北京市自然科学基金资助项目（项目编号：６０８２００５）；北京市属市管高校人才强教计划资助项目（项目编号：

６０８２００５ＰＸＭ２００７０１４２０７），北京农学院引进人才项目（项目编号：６０８２００５９９９７１１６０３８）和重点项目（项目编号：

６０８２００５２０２６０１６００５）。

作者简介：董清华，１９６６年出生，研究方向：果树发育的分子生物学；＊通讯作者：沈元月，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｆｍｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｒｎ

万方数据　

２００８年第２期董清华等：酵母表达系统研究进展与展望

７３

（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、乳酸克鲁维

亚酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）、多形汉逊酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、烷烃利用型耶鲁酵母

（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）等属酵母。近年来，甲醇酵

母资源引起人们的强烈兴趣，其中尤以Ｐｉｃｈｉａｐａｓ—

ｔｏｒｉｓ使用最多、最广泛，已被认为最具有发展前景

的异源蛋白生产工具之一。

１．１酿酒酵母

酿酒酵母被应用于食品工业已有数千年的历史，是最早发展起来用于表达异源蛋白的真核基因表达系统，也是至今了解最完全的真核生物，其上千个基因已被分析。特别是１９９６完成的酿酒酵母基因组全序列测序工作为进一步深入研究和利用奠定坚实的基础。所以，第一个商品化的重组疫苗来自酿酒酵母［１］。之后，相继又有多种外源基因在该表达系统中表达成功［ｚ］。但是，由于该表达系统存在一些明显的局限性：（１）酿酒酵母是一种以发酵为主的酵母，多不适于高密度培养，而大多数外源基因表达需要的是以好氧条件下的营养生长蛋白质合成为条件，用酿酒酵母系统表达外源基因很难达到很高的水平；（２）酿酒酵母缺乏强有力的受严格调控的启动子；（３）酿酒酵母对外源基因表达产物的分泌不够理想；（４）表达菌株不够稳定，表达质粒易丢失，此外在翻译后加工方面也与天然蛋白存在一定的差异。因此，近１０年来，又开发出其他性能更优良的酵母表达系统。但是，由于酿酒酵母具有较高的安全性，在生产临床药剂方面仍占有重要的地位。

由于酿酒酵母本身有天然２肚ｍ环质粒，因此，酿酒酵母表达载体可以有自主复制型游离质粒和随染色体同步复制的整合型两种。自主复制型质粒由于含有来自酵母天然质粒２“ｍ复制起点序列ＡＲＳ

（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ），能够独立于

酵母染色体外自主复制，拷贝数通常可达３０拷贝以上，但在多数情况下，如果没有选择压力，它们是不稳定的，容易丢失。整合型载体不含自主复制序列（ＡＲＳ），可整合到酵母宿主菌的染色体上，这类载体的优点是稳定性好，但它的缺点是拷贝数低。另外，酿酒酵母可利用本身的ａ因子前导肽序列可指导外源蛋白分泌，通常为将重组蛋白的成熟蛋白形式与ａ因子的前导肽序列融合。导肽序列可用Ｋｅｘ２酶的蛋白水解作用切去，这个步骤广泛存在于真核生物中。

１．２毕赤酵母

巴氏毕赤酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒ＇ｉｓ）是近年来迅速发展起

万　

方数据来的一种真核表达系统，是一种甲基营养型酵母，它能

以甲醇作为唯一的能源和碳源，可以在含有甲醇的培养基中生长。甲醇能够迅速诱导毕赤酵母合成大量的乙醇氧化酶（Ａｌｃｏｈｏｌｏｘｉｄａｓｅ，ＡＯＸ）。在巴氏毕赤酵母中发现存在两个基因（ＡＯＸｌ，ＡＯＸ２）编码Ａ（）ｘ，约占全部可溶性蛋白质的３０％以上。这两个基因序列有９２％的同源性，其编码蛋白质有９７％的同源性［ｚ］。其中Ａ０ｘｌ基因的编码产物在氧化过程中起主要作用，即ＡＯＸｌ基因的启动子受甲醇强烈诱导，而ＡＯＸ２基因的启动子则弱。而且ＡＯＸｌ基因在转录水平上受到严格的双重调控：当以甘油、葡萄糖或乙醇作为碳源

时，—６麟１几乎不表达；在碳饥饿状态下，甲醇能强烈诱

导启动ＡＯＸｌ的信号转录、翻译。

由于巴氏毕赤酵母没有稳定的天然质粒，所以其表达载体趋向采用整合载体。典型的巴氏毕赤酵母表达载体含有乙醇氧化酶基因５’ＡＯＸｌ启动子、多克隆位点、组氨醇脱氢酶基因ＨＩＳ４营养缺陷型筛选标志、３’ＡＯＸｌ终止子、大肠杆菌Ａｍｐ‘和ｏｒｉ序列。因此，属于一种能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，便于在大肠杆菌中复制、扩增和基因工程操作。但毕赤酵母表达载体中无酵母复制起点，它是靠ＡＯＸｌ或ＨＩＳ４基因的位置同源重组整合入酵母染色体ＤＮＡ中，并随酵母的生长传代稳定地存在。整合的方式可以是单交换插入，亦可双交换插入，一般来说前一种方式更容易发生，并且这一过程可重复发生，有多个表达单位插入基因组［４］。当整合载体转化受体时，它有３种整合模式：一是５’ＡＯＸｌ和３’ＡＯＸｌ能与染色体发生同源重组，使受体染色体带有一个拷贝的外源基因。这种情况有功能的ＡＯＸｌ基因被替换而丢失后，只能利用弱的Ａ（）ｘ２基因启动合成ＡＯＸ，就产生Ｈｉｓ＋Ｍｕｔ５表型

（ｍｅｔｈａｎｏｌｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｓｌｏｗ），在含甲醇的培养基中生长

缓慢。此时，甲醇利用率很低，但它表达外源基因的效率高；二是染色体ＡＯＸｌ区与载体质粒的ＡＯＸｌ区发生单位点互交换，外源基因的表达单位插入在基因区Ａ０Ⅺ基因的上游或下游，这一过程可重复发生，使得更多拷贝的表达单位插入基因组中。这种情况ＡＯＸｌ基因仍然有活性，在含甲醇的培养基中生长正常，产生的表型是Ｈｉｓ＋Ｍｕｔ＋；三是染色体ＨＩＳ４基因与载体的ＨＩｓ４基因发生置换，使得一个或多个表达单位插入在

ｈｉＳ４位点，产生的表型也是Ｈｉｓ＋Ｍｕｔ＋。

目前常用的毕赤酵母受体菌株有：组氨酸缺陷型的有ＧＳｌｌ５和ＳＭＤｌｌ６８，腺嘌呤缺陷型的有ＰＭＡＤｌｌ，ＰＭＡＤｌ６，其中ＫＭ７１，ＳＭＤｌｌ６８，ＰＭＡＤｌ６为蛋白水缺陷型，从而大大降低产物的降

７４北京农学院学报第２３卷

解。常用的载体有：ｐＡ０８１５，ｐＰＩＣ３．５，ｐＰＩＣＺａ

Ａ、

Ｂ、Ｃ，ｐＰＩＣ９，ｐＰＩＣ９Ｋ，ｐＰＭＥＴａ

Ａ、Ｂ、Ｃ。其中

ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ９Ｋ，ｐＰＭＥＴ口Ａ、Ｂ、Ｃ，ｐＰＩＣＺａＡ、Ｂ、Ｃ

为带ａ因子的分泌型载体。常用的试剂盒为美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司已开发推出多种新型的毕赤酵母表达系统试剂盒，如Ｍｕｌｔｉ—ｃｏｐｙ

Ｐｉｃｈｉａ

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

Ｋｉｔ，ＥａｓｙｓｅｌｅｃｔＰｉｃｈｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ，Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈ－ａｎｏｌｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

Ｓｙｓｔｅｍ等。国内近年来已有多

篇在毕赤酵母中生产外源蛋白质成功的报道［５叫引。因此，从技术讲利用甲醇酵母表达系统表达一个外源基因已十分成熟。２

粟酒裂殖酵母

裂殖酵母是子囊菌真核单细胞生物，可以以产孢

或分裂的方式繁殖。与其他酵母不同，它具有许多与高等真核哺乳类细胞相似的特性，它表达的外源基因产物具有天然的构象和活性。但其作为外源基因表达系统的发展却远远落后于酿酒酵母和毕赤酵母。

裂殖酵母表达系统中通常采用以２弘ｍ环和ａｒｓｌ作质粒复制起始点的游离载体。ａｒｓｌ是从裂殖酵母的染色体中克隆出来的，作为质粒的自我复制序列（ＡＲＳ）。含有裂殖酵母的ａｒｓｌ的质粒能够以多拷贝的形式在细胞中存在，但当细胞进行有丝分裂时质粒容易丢失。裂殖酵母的稳定ｓｔｂ序列可以使转化子在有丝分裂和减数分裂时仍能稳定存在。将稳定的ｓｔｂ序列和ａｒｓｌ连接在一起构建的载体能够以多拷贝的形式在裂殖酵母细胞中稳定存在，其拷贝数为８０左右。在以抗生素Ｇ４１８为选择压力的情况下，可以提高质粒的拷贝并维持其稳定，在某些情况下每个细胞的质粒数高达２００。高效表达载体ｐＴＬ２Ｍ就属于此类载体，它含有高效的ｈＣＭＶ启动子，其不含有任何复制起点和营养缺陷型标记，使用时必须与转导载体（ｐＡＬＴ）共转化进入裂殖酵母宿主。在细胞内两个载体发生同源重组，成为一个载体在胞内复制。在表达载体ｐＴＬ２Ｍ中，外源基因的表达受ｈＣＭＶ启动子和抗生素Ｇ４１８的浓度的调控。采用此载体膜蛋白也可以得

到高效表达［１引。３

影响酵母表达外源蛋白的因素

转入酵母中的外源基因所表达的蛋白质水平的

高低与许多因素有关，如菌株的类型、载体的拷贝数和稳定性、外源基因序列的内在特性、培养条件等。只有对这些诸多因素进行全面了解和优化，克服影

万　

方数据响酵母表达外源蛋白水平不确定性因素，减少试验的盲目性，提高酵母外源基因表达产量。

３．１外源基因特性

主要涉及外源基因ｍＲＮＡ５’端非翻译区（５／一

ＵＴＲ）、Ａ＋Ｔ组成和密码子的使用频率。分述如下：（１）一个适当长度的５’非翻译区可极大地促进ｍＲＮＡ有效地翻译。ＵＴＲ太长或太短都会造成核糖体４０Ｓ亚单位识别的障碍，如ＡＯＸｌ基因５／－

ＵＴＲ长为１１４ｎｔ，并且富含Ａ＋Ｕ。因此，对于最

佳蛋白表达量，维持外源基因ｍＲＮＡ５／一ＵＴＲ尽可能和ＡＯＸｌ

ｔｕＲＮＡ

５７－ＵＴＲ相似是必需的，并且最

好是保持两者一致。另外５７一ＵＴＲ中应避免ＡＵＧ

序列以确保ｍＲＮＡ从实际翻译起始位点开始翻译。起始密码ＡＵＧ周围不应形成二级结构，这可以通过密码子的替换来达到目的；（２）许多高Ａ＋Ｔ含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录。因此，对ＡＴ含量丰富的基因，最好是重新设计序列，使其Ａ＋Ｔ含量在３０％～５５％范围内。用这种方法使破伤风毒素Ｃ片段得到高效表达［４１；（３）如果外源基因中含有稀有密码子，则在翻译过程中会产生瓶颈效应而影响表达。对１１０个酵母基因使用密码子的统计学分析表明密码子的嗜好性与基因表达量密切相关［１引。在酵母中表达量较高的基因往往采用的是酵母所偏爱的密码子。在所有的６１个密码子中有２５个是酵母所偏爱的ｕ引。对这些偏好密码子的使用程度和基因表达水平成正比。高效表达的基因几乎毫无例外地使用这２５个偏好密码子。３．２启动子的影响

一般说外源基因在酵母中的表达和基因的转录水平有密切的关系，所以，选用强启动子对高效表达就十分重要。如目前酿酒酵母组成型的强启动子ＰＧＫ，ＡＤＨｌ，ＧＰＤ等，诱导型强启动子ＧＡＬｌ，ＧＡＬ７等，巴氏毕赤酵母启动子ＡＯＸｌ已被克隆用于外源基因的表达。最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型三磷酸甘油醛脱氢酶启动子ＰＧＡＧ，在它的控制下Ｂ—ＬａｂＺ基因表达率比甲醇诱导下的Ｐ。ｏ。。驱动的产量更高，由于该组成型启动子不需要甲醇诱导，发酵工艺更简单，同时其产量更高，所以成为代替Ｐ。０ｘ，最有潜力的启动子。

３．３外源基因拷贝数和稳定性

表达载体在酵母细胞中的拷贝数对外源基因表达有明显的影响。酿酒酵母和一些其他的酵母有多拷贝的内源质粒是建成高拷贝表达载体基础。如以

２

ｕｍ环为基础构建的酵母菌附加型质粒ＹＥｐ常以

２００８年第２期董清华等：酵母表达系统研究进展与展望

７５

３０或更多拷贝数存，但稳定性差。如果外源基因克隆进入２＂ｍ质粒上的Ｈｐａｌ位点，可使外源基因稳定高效表达；酵母核糖体ＲＮＡ的基因ｒＤＮＡ在染色体中具有１００～２００个重复，是提高外源基因拷贝数的最佳整合位点之一。Ｌｏｐｅｓ等［１６１构建的以ｒＤ—ＮＡ为整合位点的质粒ｐＭＩＲＹ，大大提高外源基因拷贝数，且稳定高；一般情况下，毕赤甲醇酵母中外源基因整合的拷贝数愈高，则蛋白表达量愈大。如在表达明胶、破伤风肠毒素Ｃ片段和鼠ｍＥＧＦ麦皮生长因子等时［１引，多拷贝产生非常高的表达量。然而一些情况高拷贝数对产量并没有什么效果［１８｜。

３．４表达条件的优化

表达条件的优化主要包括通气量、培养基、摇菌密度、蛋白酶、诱导剂的含量等。对这些诸多表达条件需要综合考虑，整体优化：（１）充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达是极其重要的。试验中采取多种措施如培养基体积不超过摇瓶体积１０％～３０％、提高摇床转速、用几层纱布等；（２）有多种培养基，如ＢＭＧＹ／ＢＭＭＹ，ＢＭＧ／ＢＭＭ，ＭＧＹ／ＭＭ等都可用来毕赤酵母表达。ＢＭＧＹ／ＢＭＭＹ中含有酵母膏和蛋白胨，可作为富营养物，使菌体更好地生长，从

而增加生物量；（３）通过调整培养基的ｐＨ值，在培养

基中添加１％酪氨酸蛋白水解物等措施来抑制蛋白酶活性，使降解程度减至最低。此外选用蛋白酶缺陷的受体菌是减弱蛋白酶作用的有效方法；（４）理论上来说，０Ｄ值越高，生物量越大，则总的表达量也越大。但是ＯＤ值越高，则培养基中的氧和营养供给越受限制。诱导前０Ｄ６。。一２～３，浓缩１０倍（）ｎ。。为２０～３０为宜。（５）诱导期间培养基中定期补充诱导剂，对于诱导表达外源蛋白十分重要。如对于毕赤甲醇酵母诱导期间培养基中每天应补加甲醇，以弥补甲醇的消耗和蒸发。一般每天添加到培养基中的甲醇含量为培养基体积的０．５％为宜［１

９‘。

４

展望

酵母这一传统的最简单的真核微生物，已成为现代分子生物学重要的模式工具和外源基因表达的重要宿主。尤其近几年，巴氏毕赤酵母表达系统已被证明是既可以用于分泌表达又可以胞内表达外源基因的一个理想的酵母表达系统。其完善的分子生物学操作方法，成熟的高密度发酵技术，已成为科学研究和生产商业化蛋白的重要表达系统之一。尽管已有许多蛋白在酵母中高效表达，但是，酵母作为一种表达系统还存在一些不够完善的地方：外源基因

万　

方数据在酵母细胞中的表达还有很多规律没有认识，一个基因能否在酵母中表达，能不能高效表达还有很大的随机性，表达高等生物基因产物与其天然蛋白在结构上还有待改进。可以相信，随着现代分子生物学技术的发展，人们将进一步地探索各种酵母表达系统的强启动子元件，分泌信号肽，翻译后蛋白的加工及修饰机制及外源蛋白表达的影响因素，有理由推测酵母表达系统将会有更大的发展。

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酵母表达系统研究进展与展望

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

董清华， 沈元月， DONG Qing-hua， SHEN Yuan-yue北京农学院植物科学技术系,北京,102206北京农学院学报

JOURNAL OF BEIJING AGRICULTURAL COLLEGE2008,23(2)2次

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本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_bjnxyxb200802020.aspx

第２３卷第２期２００８年４月

北京农学院学报

ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＢＥＩＪＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ

Ｖ０１．２３，Ｎｏ．２

Ａｐｒ．．２００８

酵母表达系统研究进展与展望

董清华

＇

沈元月

（北京农学院植物科学技术系，北京１０２２０６）

摘要：酵母不仅已成为现代分子生物学研究最重要的工具之一，也是表达外源基因比较理想的宿主。笔者概

括酵母表达系统的主要种类，并从外源基因特性、启动子的影响、外源基因拷贝数和稳定性及表达条件等方面综述影响酵母表达外源蛋白的因素，最后对酵母表达系统发展进行展望。

关键词：酵母表达系统；基因；外源表达；影响因素中图分类号：Ｑ８１６

文献标志码：Ａ

文章编号：１００２—３１８６（２００８）０２—００７２—０４

ＲｅｓｅａｒｃｈＰｒｏｇｒｅｓｓａｎｄＰｒｏｓｐｅｃｔｓ

ｏｎ

ＹｅａｓｔＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

Ｓｙｓｔｅｍｓ

ＤＯＮＧＱｉｎｇ—ｈｕａ，ＳＨＥＮＹｕａｎ—ｙｕｅ。

（ＤｅｐｅｒｔｍｅｎｔｏｆＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅａｎｄ

Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０２２０６，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｙｅａｓｔｉｓａｌｓｏ

ａｎ

ｎｏｔ

ｏｎｌｙ

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ｏｆｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏｏｌｓｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ

ｏｎ

ｍｏｄｅｒｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ，ｂｕｔ

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ｆｏｒｆｏｒｅｉｇｎｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｈｅｒｅ，ｗｅｄｅｓｃｒｉｂｅｍａｉｎｓｙｓｔｅｍｓｏｆｙｅａｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄ

ａｓ

ｓｕｍｍａｒｉｚｅｔｈｅｃｒｕｃｉａｌｆａｃｔｏｒｓｔｈａｔｍａｙａｆｆｅｃｔｔｈｅｙｅａｓｔ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｓｕｃｈｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，ｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒａｎｄ

ｇａｖｅｐｒｏｓｐｅｃｔｓ

ｏｎ

ｔｈｅｔｒａｉｔｓｏｆｆｏｒｅｉｇｎｇｅｎｅｓ，ｔｈｅ

ｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｆｏｒｅｉｇｎｇｅｎｅｓａｎｄ

ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ｆｉｎａｌｌｙ，ｗｅ

ｙｅａｓｔ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ—ｓｙｓｔｅｍｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｙｅａｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓ；ｇｅｎｅ；ｆｏｒｅｉｇｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｆａｃｔｏｒｓ

随着基因组研究迅速发展，越来越多的新基因被克隆和分离，基因功能的研究已成为２１世纪生命科学领域中的重大课题。基因表达技术是基因工程技术的核心。至今，人们已建立许多基因表达系统，包括原核生物基因表达系统和真核生物基因表达系统，如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、曲霉、酵母、昆虫、哺乳动物细胞。一般而言，用原核细胞作宿主表达真核基因操作简单，成本低，但有时会因为所表达的外源基因的产物不能正确的折叠或缺少翻译后的修饰导致产物没有生物活性。虽然采用哺乳类细胞作宿主可以解决以上问题，但操作困难，产率低，且有时会导致病毒感染。

酵母是一种低等的单细胞真核生物，它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作等特

点，同时又具有真核生物蛋白质加工、折叠、翻译后修饰等的功能。特别是最近几年迅速发展起来的酵母第二代外源蛋白表达系统：甲醇酵母基因表达系统，还具有遗传稳定、高密度发酵、表达量高、易于纯化等优点。因此，酵母现已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型，是表达外源基因比较理想的宿主，笔者综述这方面的最新研究进展。

主要酵母表达系统

酵母一般分成三大类：（１）酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏ－

ｍｙｃｅｓ

ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ），又称面包酵母；（２）粟酒裂殖酵

母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）；（３）非常规酵母

（Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｙｅａｓｔ），是指除酿酒酵母和粟酒

裂殖酵母外的酵母统称，主要有巴氏毕赤酵母

收稿日期：２００８—０１—１０；修订日期：２００８—０３－２０

基金项目：北京市自然科学基金资助项目（项目编号：６０８２００５）；北京市属市管高校人才强教计划资助项目（项目编号：

６０８２００５ＰＸＭ２００７０１４２０７），北京农学院引进人才项目（项目编号：６０８２００５９９９７１１６０３８）和重点项目（项目编号：

６０８２００５２０２６０１６００５）。

作者简介：董清华，１９６６年出生，研究方向：果树发育的分子生物学；＊通讯作者：沈元月，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｆｍｎ＠ｔｏｍ．ｃｏｒｎ

万方数据　

２００８年第２期董清华等：酵母表达系统研究进展与展望

７３

（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ，Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、乳酸克鲁维

亚酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）、多形汉逊酵母（Ｈａｎｓｅｎｕｌａｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、烷烃利用型耶鲁酵母

（Ｙａｒｒｏｗｉａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）等属酵母。近年来，甲醇酵

母资源引起人们的强烈兴趣，其中尤以Ｐｉｃｈｉａｐａｓ—

ｔｏｒｉｓ使用最多、最广泛，已被认为最具有发展前景

的异源蛋白生产工具之一。

１．１酿酒酵母

酿酒酵母被应用于食品工业已有数千年的历史，是最早发展起来用于表达异源蛋白的真核基因表达系统，也是至今了解最完全的真核生物，其上千个基因已被分析。特别是１９９６完成的酿酒酵母基因组全序列测序工作为进一步深入研究和利用奠定坚实的基础。所以，第一个商品化的重组疫苗来自酿酒酵母［１］。之后，相继又有多种外源基因在该表达系统中表达成功［ｚ］。但是，由于该表达系统存在一些明显的局限性：（１）酿酒酵母是一种以发酵为主的酵母，多不适于高密度培养，而大多数外源基因表达需要的是以好氧条件下的营养生长蛋白质合成为条件，用酿酒酵母系统表达外源基因很难达到很高的水平；（２）酿酒酵母缺乏强有力的受严格调控的启动子；（３）酿酒酵母对外源基因表达产物的分泌不够理想；（４）表达菌株不够稳定，表达质粒易丢失，此外在翻译后加工方面也与天然蛋白存在一定的差异。因此，近１０年来，又开发出其他性能更优良的酵母表达系统。但是，由于酿酒酵母具有较高的安全性，在生产临床药剂方面仍占有重要的地位。

由于酿酒酵母本身有天然２肚ｍ环质粒，因此，酿酒酵母表达载体可以有自主复制型游离质粒和随染色体同步复制的整合型两种。自主复制型质粒由于含有来自酵母天然质粒２“ｍ复制起点序列ＡＲＳ

（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ），能够独立于

酵母染色体外自主复制，拷贝数通常可达３０拷贝以上，但在多数情况下，如果没有选择压力，它们是不稳定的，容易丢失。整合型载体不含自主复制序列（ＡＲＳ），可整合到酵母宿主菌的染色体上，这类载体的优点是稳定性好，但它的缺点是拷贝数低。另外，酿酒酵母可利用本身的ａ因子前导肽序列可指导外源蛋白分泌，通常为将重组蛋白的成熟蛋白形式与ａ因子的前导肽序列融合。导肽序列可用Ｋｅｘ２酶的蛋白水解作用切去，这个步骤广泛存在于真核生物中。

１．２毕赤酵母

巴氏毕赤酵母（Ｐ．ｐａｓｔｏｒ＇ｉｓ）是近年来迅速发展起

万　

方数据来的一种真核表达系统，是一种甲基营养型酵母，它能

以甲醇作为唯一的能源和碳源，可以在含有甲醇的培养基中生长。甲醇能够迅速诱导毕赤酵母合成大量的乙醇氧化酶（Ａｌｃｏｈｏｌｏｘｉｄａｓｅ，ＡＯＸ）。在巴氏毕赤酵母中发现存在两个基因（ＡＯＸｌ，ＡＯＸ２）编码Ａ（）ｘ，约占全部可溶性蛋白质的３０％以上。这两个基因序列有９２％的同源性，其编码蛋白质有９７％的同源性［ｚ］。其中Ａ０ｘｌ基因的编码产物在氧化过程中起主要作用，即ＡＯＸｌ基因的启动子受甲醇强烈诱导，而ＡＯＸ２基因的启动子则弱。而且ＡＯＸｌ基因在转录水平上受到严格的双重调控：当以甘油、葡萄糖或乙醇作为碳源

时，—６麟１几乎不表达；在碳饥饿状态下，甲醇能强烈诱

导启动ＡＯＸｌ的信号转录、翻译。

由于巴氏毕赤酵母没有稳定的天然质粒，所以其表达载体趋向采用整合载体。典型的巴氏毕赤酵母表达载体含有乙醇氧化酶基因５’ＡＯＸｌ启动子、多克隆位点、组氨醇脱氢酶基因ＨＩＳ４营养缺陷型筛选标志、３’ＡＯＸｌ终止子、大肠杆菌Ａｍｐ‘和ｏｒｉ序列。因此，属于一种能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，便于在大肠杆菌中复制、扩增和基因工程操作。但毕赤酵母表达载体中无酵母复制起点，它是靠ＡＯＸｌ或ＨＩＳ４基因的位置同源重组整合入酵母染色体ＤＮＡ中，并随酵母的生长传代稳定地存在。整合的方式可以是单交换插入，亦可双交换插入，一般来说前一种方式更容易发生，并且这一过程可重复发生，有多个表达单位插入基因组［４］。当整合载体转化受体时，它有３种整合模式：一是５’ＡＯＸｌ和３’ＡＯＸｌ能与染色体发生同源重组，使受体染色体带有一个拷贝的外源基因。这种情况有功能的ＡＯＸｌ基因被替换而丢失后，只能利用弱的Ａ（）ｘ２基因启动合成ＡＯＸ，就产生Ｈｉｓ＋Ｍｕｔ５表型

（ｍｅｔｈａｎｏｌｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｓｌｏｗ），在含甲醇的培养基中生长

缓慢。此时，甲醇利用率很低，但它表达外源基因的效率高；二是染色体ＡＯＸｌ区与载体质粒的ＡＯＸｌ区发生单位点互交换，外源基因的表达单位插入在基因区Ａ０Ⅺ基因的上游或下游，这一过程可重复发生，使得更多拷贝的表达单位插入基因组中。这种情况ＡＯＸｌ基因仍然有活性，在含甲醇的培养基中生长正常，产生的表型是Ｈｉｓ＋Ｍｕｔ＋；三是染色体ＨＩＳ４基因与载体的ＨＩｓ４基因发生置换，使得一个或多个表达单位插入在

ｈｉＳ４位点，产生的表型也是Ｈｉｓ＋Ｍｕｔ＋。

目前常用的毕赤酵母受体菌株有：组氨酸缺陷型的有ＧＳｌｌ５和ＳＭＤｌｌ６８，腺嘌呤缺陷型的有ＰＭＡＤｌｌ，ＰＭＡＤｌ６，其中ＫＭ７１，ＳＭＤｌｌ６８，ＰＭＡＤｌ６为蛋白水缺陷型，从而大大降低产物的降

７４北京农学院学报第２３卷

解。常用的载体有：ｐＡ０８１５，ｐＰＩＣ３．５，ｐＰＩＣＺａ

Ａ、

Ｂ、Ｃ，ｐＰＩＣ９，ｐＰＩＣ９Ｋ，ｐＰＭＥＴａ

Ａ、Ｂ、Ｃ。其中

ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ９Ｋ，ｐＰＭＥＴ口Ａ、Ｂ、Ｃ，ｐＰＩＣＺａＡ、Ｂ、Ｃ

为带ａ因子的分泌型载体。常用的试剂盒为美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司已开发推出多种新型的毕赤酵母表达系统试剂盒，如Ｍｕｌｔｉ—ｃｏｐｙ

Ｐｉｃｈｉａ

Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

Ｋｉｔ，ＥａｓｙｓｅｌｅｃｔＰｉｃｈｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｉｔ，Ｐｉｃｈｉａｍｅｔｈ－ａｎｏｌｉａＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

Ｓｙｓｔｅｍ等。国内近年来已有多

篇在毕赤酵母中生产外源蛋白质成功的报道［５叫引。因此，从技术讲利用甲醇酵母表达系统表达一个外源基因已十分成熟。２

粟酒裂殖酵母

裂殖酵母是子囊菌真核单细胞生物，可以以产孢

或分裂的方式繁殖。与其他酵母不同，它具有许多与高等真核哺乳类细胞相似的特性，它表达的外源基因产物具有天然的构象和活性。但其作为外源基因表达系统的发展却远远落后于酿酒酵母和毕赤酵母。

裂殖酵母表达系统中通常采用以２弘ｍ环和ａｒｓｌ作质粒复制起始点的游离载体。ａｒｓｌ是从裂殖酵母的染色体中克隆出来的，作为质粒的自我复制序列（ＡＲＳ）。含有裂殖酵母的ａｒｓｌ的质粒能够以多拷贝的形式在细胞中存在，但当细胞进行有丝分裂时质粒容易丢失。裂殖酵母的稳定ｓｔｂ序列可以使转化子在有丝分裂和减数分裂时仍能稳定存在。将稳定的ｓｔｂ序列和ａｒｓｌ连接在一起构建的载体能够以多拷贝的形式在裂殖酵母细胞中稳定存在，其拷贝数为８０左右。在以抗生素Ｇ４１８为选择压力的情况下，可以提高质粒的拷贝并维持其稳定，在某些情况下每个细胞的质粒数高达２００。高效表达载体ｐＴＬ２Ｍ就属于此类载体，它含有高效的ｈＣＭＶ启动子，其不含有任何复制起点和营养缺陷型标记，使用时必须与转导载体（ｐＡＬＴ）共转化进入裂殖酵母宿主。在细胞内两个载体发生同源重组，成为一个载体在胞内复制。在表达载体ｐＴＬ２Ｍ中，外源基因的表达受ｈＣＭＶ启动子和抗生素Ｇ４１８的浓度的调控。采用此载体膜蛋白也可以得

到高效表达［１引。３

影响酵母表达外源蛋白的因素

转入酵母中的外源基因所表达的蛋白质水平的

高低与许多因素有关，如菌株的类型、载体的拷贝数和稳定性、外源基因序列的内在特性、培养条件等。只有对这些诸多因素进行全面了解和优化，克服影

万　

方数据响酵母表达外源蛋白水平不确定性因素，减少试验的盲目性，提高酵母外源基因表达产量。

３．１外源基因特性

主要涉及外源基因ｍＲＮＡ５’端非翻译区（５／一

ＵＴＲ）、Ａ＋Ｔ组成和密码子的使用频率。分述如下：（１）一个适当长度的５’非翻译区可极大地促进ｍＲＮＡ有效地翻译。ＵＴＲ太长或太短都会造成核糖体４０Ｓ亚单位识别的障碍，如ＡＯＸｌ基因５／－

ＵＴＲ长为１１４ｎｔ，并且富含Ａ＋Ｕ。因此，对于最

佳蛋白表达量，维持外源基因ｍＲＮＡ５／一ＵＴＲ尽可能和ＡＯＸｌ

ｔｕＲＮＡ

５７－ＵＴＲ相似是必需的，并且最

好是保持两者一致。另外５７一ＵＴＲ中应避免ＡＵＧ

序列以确保ｍＲＮＡ从实际翻译起始位点开始翻译。起始密码ＡＵＧ周围不应形成二级结构，这可以通过密码子的替换来达到目的；（２）许多高Ａ＋Ｔ含量的基因常会由于提前终止而不能有效转录。因此，对ＡＴ含量丰富的基因，最好是重新设计序列，使其Ａ＋Ｔ含量在３０％～５５％范围内。用这种方法使破伤风毒素Ｃ片段得到高效表达［４１；（３）如果外源基因中含有稀有密码子，则在翻译过程中会产生瓶颈效应而影响表达。对１１０个酵母基因使用密码子的统计学分析表明密码子的嗜好性与基因表达量密切相关［１引。在酵母中表达量较高的基因往往采用的是酵母所偏爱的密码子。在所有的６１个密码子中有２５个是酵母所偏爱的ｕ引。对这些偏好密码子的使用程度和基因表达水平成正比。高效表达的基因几乎毫无例外地使用这２５个偏好密码子。３．２启动子的影响

一般说外源基因在酵母中的表达和基因的转录水平有密切的关系，所以，选用强启动子对高效表达就十分重要。如目前酿酒酵母组成型的强启动子ＰＧＫ，ＡＤＨｌ，ＧＰＤ等，诱导型强启动子ＧＡＬｌ，ＧＡＬ７等，巴氏毕赤酵母启动子ＡＯＸｌ已被克隆用于外源基因的表达。最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型三磷酸甘油醛脱氢酶启动子ＰＧＡＧ，在它的控制下Ｂ—ＬａｂＺ基因表达率比甲醇诱导下的Ｐ。ｏ。。驱动的产量更高，由于该组成型启动子不需要甲醇诱导，发酵工艺更简单，同时其产量更高，所以成为代替Ｐ。０ｘ，最有潜力的启动子。

３．３外源基因拷贝数和稳定性

表达载体在酵母细胞中的拷贝数对外源基因表达有明显的影响。酿酒酵母和一些其他的酵母有多拷贝的内源质粒是建成高拷贝表达载体基础。如以

２

ｕｍ环为基础构建的酵母菌附加型质粒ＹＥｐ常以

２００８年第２期董清华等：酵母表达系统研究进展与展望

７５

３０或更多拷贝数存，但稳定性差。如果外源基因克隆进入２＂ｍ质粒上的Ｈｐａｌ位点，可使外源基因稳定高效表达；酵母核糖体ＲＮＡ的基因ｒＤＮＡ在染色体中具有１００～２００个重复，是提高外源基因拷贝数的最佳整合位点之一。Ｌｏｐｅｓ等［１６１构建的以ｒＤ—ＮＡ为整合位点的质粒ｐＭＩＲＹ，大大提高外源基因拷贝数，且稳定高；一般情况下，毕赤甲醇酵母中外源基因整合的拷贝数愈高，则蛋白表达量愈大。如在表达明胶、破伤风肠毒素Ｃ片段和鼠ｍＥＧＦ麦皮生长因子等时［１引，多拷贝产生非常高的表达量。然而一些情况高拷贝数对产量并没有什么效果［１８｜。

３．４表达条件的优化

表达条件的优化主要包括通气量、培养基、摇菌密度、蛋白酶、诱导剂的含量等。对这些诸多表达条件需要综合考虑，整体优化：（１）充足的通气量对于诱导阶段外源蛋白的表达是极其重要的。试验中采取多种措施如培养基体积不超过摇瓶体积１０％～３０％、提高摇床转速、用几层纱布等；（２）有多种培养基，如ＢＭＧＹ／ＢＭＭＹ，ＢＭＧ／ＢＭＭ，ＭＧＹ／ＭＭ等都可用来毕赤酵母表达。ＢＭＧＹ／ＢＭＭＹ中含有酵母膏和蛋白胨，可作为富营养物，使菌体更好地生长，从

而增加生物量；（３）通过调整培养基的ｐＨ值，在培养

基中添加１％酪氨酸蛋白水解物等措施来抑制蛋白酶活性，使降解程度减至最低。此外选用蛋白酶缺陷的受体菌是减弱蛋白酶作用的有效方法；（４）理论上来说，０Ｄ值越高，生物量越大，则总的表达量也越大。但是ＯＤ值越高，则培养基中的氧和营养供给越受限制。诱导前０Ｄ６。。一２～３，浓缩１０倍（）ｎ。。为２０～３０为宜。（５）诱导期间培养基中定期补充诱导剂，对于诱导表达外源蛋白十分重要。如对于毕赤甲醇酵母诱导期间培养基中每天应补加甲醇，以弥补甲醇的消耗和蒸发。一般每天添加到培养基中的甲醇含量为培养基体积的０．５％为宜［１

９‘。

４

展望

酵母这一传统的最简单的真核微生物，已成为现代分子生物学重要的模式工具和外源基因表达的重要宿主。尤其近几年，巴氏毕赤酵母表达系统已被证明是既可以用于分泌表达又可以胞内表达外源基因的一个理想的酵母表达系统。其完善的分子生物学操作方法，成熟的高密度发酵技术，已成为科学研究和生产商业化蛋白的重要表达系统之一。尽管已有许多蛋白在酵母中高效表达，但是，酵母作为一种表达系统还存在一些不够完善的地方：外源基因

万　

方数据在酵母细胞中的表达还有很多规律没有认识，一个基因能否在酵母中表达，能不能高效表达还有很大的随机性，表达高等生物基因产物与其天然蛋白在结构上还有待改进。可以相信，随着现代分子生物学技术的发展，人们将进一步地探索各种酵母表达系统的强启动子元件，分泌信号肽，翻译后蛋白的加工及修饰机制及外源蛋白表达的影响因素，有理由推测酵母表达系统将会有更大的发展。

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酵母表达系统研究进展与展望

作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：被引用次数：

董清华， 沈元月， DONG Qing-hua， SHEN Yuan-yue北京农学院植物科学技术系,北京,102206北京农学院学报

JOURNAL OF BEIJING AGRICULTURAL COLLEGE2008,23(2)2次

参考文献(19条)

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本文读者也读过(5条)

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引证文献(2条)

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