感受态细胞制备与保存方法的比较研究

第15卷第1期:52生　物　技　术V ol 115,N o 11:52

2005年2月BI OTECH NO LOGY Feb 12005生, 因此可以发现一些菌落有明显的滞后现象, 如图2中滞后的菌落为1、3、4号菌落。菌体电泳滞后的菌落经提取质粒酶切电泳确认, 电泳滞后的1、3、4号菌落所提取的质粒DNA 经提取质粒酶切后都能切下一条与外源片段大小相符的片段(图2) , 酶切分析的结果表明滞后的菌落都连接上了外源片段, 同时也说明菌液碱裂解法直接电泳筛选的结果是可靠的。筛选转化重组子有多种方法, PCR 菌落分析法能够最快地筛选到重组子, 但在实际运用中确实存在PCR 不稳定的现象, 而

α互补蓝色Π且需要合成反应引物, 增加了筛选成本[2]。白色

筛选是一种简单的筛选方法, 但在实际运用中存在不少的假阳性, 需要进一步验证。提取小量质粒DNA 进行限制性酶切电泳分析, 是一种最准确的分析, 但费时、成本高, 一般用于重组子的最后鉴定, 这种方法对没有筛选标记的载体进行大量的筛选时不仅会增加工作量也会增加实验成本。本文方法根据碱裂解提取质粒的原理, 用碱裂解菌液使质粒DNA 从宿主菌中释放出来, 然后直接进行琼脂糖电泳分析, 不仅省去了提

取质粒DNA 的繁琐步骤, 获得令人满意的结果。在悬浮液中加入RNase A 可以消除菌液裂解后产生大量RNA 的影响, 降低背景便于电泳分析, 在实际应用可以不添加。在运用这种方法筛选重组子过程中我们发现, 当载体为3kb 时, 外源片段大于100bp , 使用1%琼脂糖电泳就可以观察到明显的滞后现象, 片段越大滞后越明显。如果插入的片段过小时电泳滞后不明显时这种方法这不适用。对有蓝色Π白色筛选标记的载体, 此方法能够快速排除假阳性, 如果无蓝色Π白色筛选标记的载体, 这种方法可以进行大量的转化子筛选, 更体现为一种经济、快速的重组子筛选方法。

参考文献:

[1][美]J萨姆布鲁克,D W 拉塞尔. 分子克隆实验指南[M]1第3版1

北京:科学出版社,2003126-321

[2]金红, 李媛, 邓国华. [J]1生物技术,1998,8(6) :41-441

罗婵, 汤刚彬, , (, )

摘要:目的:。方法:比较CaCl 2法、TSS 法、超高效法制备感受态细胞的效果, (OD 值0. 2～1. 1) 的细菌对制备感受态细胞的影响, 并分别比较了不同冷冻保护剂(7-80℃冰箱保存感受态细胞的效果。结果:三种方法获得的感受态细

胞转化率差异极显著() 。,OD 值为0. 36(或0. 58) 时收集菌体可获得1. 1×10的高转化率的感受态细胞, 以7%的DMS O 107以上的转化率40d 以上。

关键词:大肠杆菌; ; 制备方法; 转化率; 保存

中图分类号:Q785;Q81311+1　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X (2005) 01-0052-03

Comparative Study on Preparation and Storage of Competent Escherichia coli Cells

LUO Chan ,T ANG G ang -bin ,XIE T i -san ,SHI De -shun

(Animal Reproduction Institute ,G uangxi University ,Nanning 530005,P. R. China )

Abstract :Objective :To establishing a high efficient protocol for preparation and storage of com petent E scherichia coli cells. Methods :Threemeth 2ods (SE M ,TSS and CaCl 2method ) were com pared for preparation of com petent cells ; E scherichia coli at different growth stages (optical density range from A 600=0. 2to 1. 1) were choosed for preparation of com petent cells bythe best method ,meanwhile different conditions were used for storage of com petent cells. R esults :Hightrans formation efficiency can be achieved by SE M at A 600of 0. 36or 0. 58;cells stored with dimethylsul 2foxide in -80℃could keep consistently high trans formation efficiency at least 40d.

K eyw ords :E scherichia coli ;com petent cells ;methods of preparation ;trans formation efficiency ;storage 　　感受态细胞的制备是基因重组中一项基本技术, 是获得高质量基因文库的关键。由于诱导细菌进入感受态的机制尚不完全清楚, 且感受态细胞的转化率受诸多因素的影响, 实验室之间差异较大。尤其在室温较高时, 感受态制备的效果很不稳定, 摸索高温季节制备高效感受态细胞的方法仍十分必要。此外, 高效感受态细胞贮存不当会很快丧失其感受性, 如何较好地贮存感受态细胞亦是一个亟待解决的问题。本文首

α进入感受态的条件, 并对感次系统研究了诱导大肠杆菌DH5

受态细胞的保存条件进行了优化, 初步建立了适合南方高温季节制备高转化率大肠杆菌感受态细胞的有效方法。1. 1　材料图1　18℃

下大肠杆菌的生长曲线

α, 质粒pUC18均由本实验室1. 1. 1　菌株与质粒:E . coli DH5

保存。

1. 1. 2　主要试剂:①TSS 转化缓冲液:10%PEG, 5%DMSO , 20mm ol ΠL MgCl 2,84%LB培养基。②Inoue 转化缓冲液:将1. 088g MnCl 2・4H 2O 、0. 22g CaCl 2・2H 2O 、1. 865g K Cl 溶于80m L 纯水中, 然后加入2m L 0. 5m ol ΠL 的Hepes (pH6. 7) , 加纯水定容至100m L 。以上试剂均为S igma 产品。其余试剂配制参照文献[1]。

[1]

1. 1. 3　培养基:LB培养基、S OB 培养基参照文献。(

图2　不同OD 值制备感受态细胞的转化率注:该图转化率项设1为

10, 单位:个)

收稿日期:2004-07-31; 修回日期:2004-10-01

作者简介:罗婵(1981-) , 女, 在读硕士生, 研究方向:分子生物学; 3通讯作者:石德顺(1962-) , 男, 博士, 博导, 研究员, 研究方向:生殖生理,E -mail :ardsshi@gxu. edu. cn 。

1. 1. 4　实验仪器:数显振荡培养箱(BS -IE ) ,Allegra21R Centri 2fuge (G ermany ) , 小容量恒温摇床(HWY -100A ) , Refrigerant -80℃(Harris Manu facturing C o. ) , Refrigerant -20℃(E lectrolux ) , 8453型紫外分光光度计(惠普公司, 德国, 测OD 值用) , 光密度仪(Bio -Rad ,G S -710) , 电泳仪(ES250-90) , 紫外分析仪, 紫

2005年2月　　　　　　　　　　　　　　感受态细胞制备与保存方法的比较研究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　53

外分光光度计(Amershambiosciences , 测核酸浓度用) 。1. 2　方法1. 2. 1　标准质粒制备:常规碱裂解法抽提质粒, 琼脂糖凝胶电泳检测, 紫外分析仪下观察, 将显示为超螺旋DNA 带型的凝胶切下, 胶回收后电泳确保质粒全部为超螺旋状态, 紫外分光光

μ度计测其纯度及浓度,TE 稀释为1ng ΠL , 存于-20℃备用。

1. 2. 2　大肠杆菌18℃下生长状态的测定:取-80℃保存的α菌株划线接种于S OB 板,37℃DH5过夜培养12～16h 后挑取单菌落(直径2～3mm ) 接种于25m L S OB 液体培养基, 同时设对照组, 即挑同一菌落于含Am p 的S OB 培养液中,37℃,250～300r Πmin 振荡培养6～8h ; 将上述初始培养物以1∶100的比例接种于盛有50m L S OB 培养液的锥形瓶中,18℃200r Πmin 摇菌; 在接种1h 后每隔1h 取样测菌液的OD 600值, 绘制大肠杆菌的生长曲线。同时, 每次测OD 600值时, 均取菌液倍比稀释, 然后取0. 1m L 稀释液涂布于S OB 板,37℃倒置培养12～16h 后计数, 作OD 600-lg 活菌数图。1. 2. 3　大肠杆菌感受态细胞的制备(1) TSS 法:当菌液OD 值为0. 3时, 菌液冰浴10min ;4000r/

min 离心10min 收集菌体; 以5m L 预冷的TSS 转化缓冲液充分重悬菌体; 迅速将悬液分装到预冷的1. 5m L E p 管中, 贮于-80℃冰箱备用。

(2) 超高效法[1]:当培养物的OD 600达到0. 55时, 于冰上迅〗速将培养物分至两个预冷的离心管内, 冰浴10min ; 4℃3900r/min 离心10min , 以8m L 预冷的Inoue 缓冲液重悬菌体后离心; 再次充分重悬于2m L Inoue 缓冲液; 加入DMS O 浓度同上, 轻轻混匀后冰上静置10min ; 迅速将悬液分装到预冷的1. 5m L E p 管中, 贮于-80℃冰箱备用。

(3) CaCl 2法:挑取单个菌落于20m L S OB 培养液中,37℃振摇过夜, 取菌液以1∶100的比例接种于50m L S OB 培养液,37℃继续摇至OD 值为0. 3～0. 4后, 菌液冰浴10min ,4000r/min 离心10min 收集菌体, 以30m L 预冷的0. 1m ol ΠL CaCl 2-MgCl 2溶液重悬, 离心同前, 以2m L 预冷的0. 1m ol ΠL CaCl 2再次重悬菌体, 加入DMS O 使终浓度达7%, 冰上静置15min 后分装于预冷的1. L E p 管。

1. 2. 4　转化及转化率测定:参照文献。转化率即每微克

DNA 转化后所产生的单菌落个数。1. 2. 5　贮存方法:新鲜制备的感受态细胞, 分批加入终浓度7%DMSO 、10%甘油, 分装后, 分别于-80℃和-20℃冰箱贮存, 每周检测转化率1次。

[2]

2　结果与分析

2. 1　大肠杆菌18℃下的生长曲线

为更好地控制集菌时间及探讨感受态细胞转化率与大肠杆菌生长状态的关系特绘制此生长曲线(图1) 。该生长曲线主要包括了大肠杆菌在18℃培养条件下群体生长周期中的迟缓期、对数期及稳定期初期。2. 2　不同方法制备大肠杆菌

感受态细胞的效果比较用3种方法制备的每批感受态细胞均取出3管进行转化, 取其平均值代表该批感受态细胞的转化率。该实验重复9次, 各取平均值为该种方法制备的感受态细胞的转化率(表1) 。经方差分析可知, 三种制备方法得到的感受态细胞的转化率差异极显著(F >F 0. 01,P

(图2) 。其中, 在OD 值为0. 36、0. 58时获得了最高转化率, 达

8[3]

到1. 1×10, 与Inoue H 报道结果一致。2. 4　不同贮存方法对转化率的影响

如图所示, -80℃保存效果明显优于-20℃保存, 二者至少相差1个数量级(见图3-6) ;DMS O 的保存效果优于甘油, 用DMS O 作为冷冻保护剂贮存于-80℃超低温冰箱的感受态细胞

在40多天后仍能保持1. 68×10的转化率(见图7) , 而用甘油作为冷冻保护剂贮存于-80℃的感受态细胞一周后已由1. 9×7610下降至6×10(图6、8) 。

3　讨论

三种方法制备的感受态细胞以超高效法转化率最高。可能是因为18℃培养使细菌合成的菌膜成分和物理性状更有利于攫取DNA , 从18℃生长曲线可知, 低温也有利于高效转化生长时相的延长。柯涛[5]等的研究也表明温度对感受态细胞的转化率有极大的影响。TSS 法的转化缓冲液中同时含有PEG 和

[1]

MgCl 2, 二者均可沉淀质粒DNA , 且PEG 有使细胞壁具有穿透性, 允许DNA 进入细菌体内的生物学功能, 这些可能是该法优于CaCl 2法的原因。使用CaCl 2法制备出的感受态细胞转化率相对较低。

表1　各方法制备的感受态细胞的转化率大肠杆菌群体生长周期包括迟缓期、对数期、稳定期、衰亡

() 期。结合所绘制的生长曲线可知:当OD 值为0. 36、0. 58时, 细T SS 法14. 419. 211. 417. 816. 811. 012. 521. 717. 7142. 515. 83

超高效法42. 147. 136. 032. 836. 141. 644. 145. 848. 437441. 56

菌正处于其对数期的中期, 此时, 细菌处于最理想的生长状态。C aC l 211. 414. 815. 012. 910. 214. 314. 013. 715. 2121. 513. 5

细菌在该期生命力强, 对转化缓冲液的反应性强, 被诱导处于

　　(注:各表转化率项均设1为1×106) 感受态的细菌较多; 同时, 细菌耐受冷打击、冷冻保存造成的物

理损伤、溶液效应的能力也更强, 故获得较高的转化率(1. 1×8[4]

10) 。Tsen S D 等用天然质粒转化E . coli 时发现E . coli 处于对数期时转化率最高。当OD 值为1. 1时, 细菌已处于稳定期, 转化率仅有0. 61×108, 这可能是受细菌的遗传特性影响的。

[6]

Finkel SE 等发现处于稳定期的E . coli 由于hofQ 发生突变而导致细菌吸收外源DNA 的能力显著下降。

图7　7%DMSO 保存细胞转化率的变化(该图转化率项设1为107, 单DMS O 的保存效果优于甘油。可能是因为DMS O 分子量位:个) (78. 14) 较甘油(92. 10) 小, 能更快地进入细胞膜, 与磷脂发生静2. 3　不同OD 值对大肠杆菌电反应, 提高膜的液态流动性, 降低膜脂质的相变温度, 从而增

感受态细胞转化率的影响选取OD 值0. 2～1. 1分别进行加生物膜对渗透压和细胞皱缩的耐受性, 保护了冷冻和解冻过感受态细胞制备, 发现感受态细胞的转化率与OD 值显著相关程中细胞膜的稳定性。同时,DMS O 也可诱导细胞膜上的某些

第15卷第1期:54生　物　技　术V ol 115,N o 11:54

2005年2月BI OTECH NO LOGY Feb 12005特殊的物质用于其微孔的形成, 减少运输阻力, 更有利于质粒DNA 进入。而甘油进入细胞膜所需时间较长, 且毒性较DMS O 大, 对感受态细胞的转化率也有影响。另外, 在本试验中, 发现-80℃超低温冰箱的冷冻保存效果优于-20℃冰箱, 可能由于-20℃只是使细胞处于过冷状态, 其对冷冻保护剂的损害还较敏感; 而在超低温保存时, 细胞处于休眠状态, 可能更能承受冷冻、化冻和保护剂的伤害。

使用超高效法, 在OD 值为0. 36(或0. 58) 时收获菌体可获

得1. 1×10的高转化率的大肠杆菌感受态细胞。将感受态细胞用7%DMSO 作为冷冻保护剂保存于-80℃时效果较好, 可维

持在10以上的转化率达一个多月。

参考文献:

[1]J萨姆布鲁克,D W 拉塞尔著. 黄培堂, 王嘉玺, 朱厚础, 等译. 分子克隆实验指南[M].第3版. 北京:科学出版社,2002,8187-96.

[2]卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M].北京:中国协和医科大学出版社,1999,121290-293.

[3]Inoue H ,N ojima H ,Okayma H. High efficiency trans formation of E scherichia coli with plasm ids[J].G ene ,1990,96:23-28.

[4]TsenS D. Natural plasm id trans formation in E . coli [J].Biomed . Sci ,2002, 9:246-252.

[5]柯涛, 张勇法, 潘园园, 等. 温度对大肠杆菌感受态细胞的影响[J].河南农业大学学报,2003,37(1) :57-60. [6]FinkelS E ,K olter R. DNA as a nutrient :novelrole for bacterial com petence gene hom ologs[J].B acterial ,2002,183:6288-6293.

杏鲍菇原生质体制备与再生条件初探

刘敏, 李娟, 周波, 贾乐

(山东农业大学生命科学学院, 山东泰安271018)

摘要:研究酶浓度、酶解时间、酶解温度、培养时间、稳渗剂种类、pH 7

响。最适条件为:在30℃、pH5. 5、1. 5%溶壁酶条件下, 以0. 6m ol ΠL , 2. 2. 90×10个Πm L 。将所得原生质体过滤、纯化、稀释后涂布再生培养基, 再生率为0. 础。

关键词:杏鲍菇; 原生质体; 形成; 再生

中图分类号:Q939.53　　文献标识码:A　　-311X 0054-02

Separation of Pleurotus erygll Proto Plast

Min ,LI Juan ,ZH OU Bo ,J I A Le

Science ,Shandong Agricultural University ,T aian 271018,P 1R 1China )

Abstract :Theconditions of and regeneration of Pleurotus erygii protoplast were studied in detail and systematically for the first time. Results show that the highest yield of protoplast can be obtained by using 1. 5%ly wallzyme made by 0. 6m ol Πl mannitol ,digesting for 2. 5hours at the condition of 30℃and pH value 5. 5. H owever ,taking account of the regeneration of protoplast ,it was m ost suitable to digest for 2. 5hours. The protoplast produced by 2. 5-hour enzym olysis was filtered ,purified and cultured in the regeneration medium. The highest regeneration rate was 0. 18%.This study has laid the foundation of transgenic research of Pleurotus erygii by using protoplast in the future. K ey w ords :Pleurotus erygii ;protoplast ;separation ;regeneration 　　原生质体技术在食用菌育种中具有重要意义。1972年荷1. 4. 1　酶液配制:称取适量溶壁酶(W ΠV ) , 溶于0. 6m ol ΠL 稳渗

μ兰De Vessels 首次用裂解酶分离了裂褶菌原生质体, 随后又分剂,0. 22m 微孔滤膜过滤除菌后备用。

离了双孢蘑菇和草菇的原生质体。1980年以后, 有关食用菌1. 4. 2　菌丝培养:取直径5mm 的菌丝块接种于盛有100m L 液

[1,2]

原生质体分离的报道大量增加。杏鲍菇(Pleurotus erygii ) 营体培养基的250m L 三角瓶中, 每瓶接种一块,25℃静置培养4养丰富、易于生长且适应性强、生物效率高, 近年来世界各地-6d 。

[3]

都有大量栽培。迄今为止国内有关杏鲍菇原生质体的研究1. 4. 3　原生质体制备与计数:将培养好的菌丝置于离心管中, 未见报道, 本文对杏鲍菇原生质体制备与再生条件进行了初3600r Πmin 离心10min , 弃去上清液, 用相应稳渗剂洗3次, 无菌步探索。滤纸吸取多余水分。每250mg 湿菌丝加1m L 酶液, 在适当温

度水浴中酶解一定时间, 吸取少许酶解液, 血球计数板计数。1　材料与方法

1. 5　原生质体再生[7,8]1. 1　菌种:杏鲍菇(Pleurotus erygii ) 本实验室保存。

1. 5. 1　原生质体纯化:用无菌双层擦镜纸过滤酶解液,4200r Π1. 2　培养基[4-6]

min 离心10min , 去上清液, 用渗透压稳定剂洗2次, 得到纯化1. 2. 1　液体培养基:马铃薯汁20%, 葡萄糖2%, 酵母粉0.

的原生质体。用适当稳渗剂稀释原生质体, 吸取少许悬液, 血2%, 水1000m L ,pH6. 0。

球计数板计数。1. 2. 2　原生质体再生培养基:①PDA 培养基:马铃薯汁20%,

1. 5. 2　原生质体再生:将适量原生质体悬液接种于相应液体葡萄糖2%, pH 5. 5; ②麦芽糖10g , 葡萄糖4g , 酵母粉4g ,

再生培养基中, 静置培养2-3d , 然后吸取1m L 培养液涂布再K H 2PO 41g ,MgS O 4・7H 2O 1g , 可溶性淀粉10g ,VB 11g ,pH 5. 5; ③

生固体平板。麦芽糖10g , 葡萄糖10g , 酵母粉4g ,pH 5. 5。以上三种培养基

原生质体再生率的计算:再生率=再生菌落数Π原生质体溶于0. 6m ol ΠL 渗透压稳定剂中, 至总体积为1000m L 。固体培

总数×100%。养基琼脂用量为2%。

1. 3　试剂

溶壁酶(Ly wallzyme ) , 广东省微生物研究所生产; 甘露醇, 上海三浦化工有限公司;MgS O 4, 天津博迪化工有限公司; 葡萄糖, 天津市凯通化学试剂有限公司; K Cl , 天津市科密欧化学试剂开发中心; 蔗糖, 广州化学试剂二厂。1. 4　原生质体制备[7,8]收稿日期:2004-09-19; 修回日期:2004-12-17基金项目:山东省教育厅资助项目(J01K 32)

作者简介:刘敏(1978-) , 女, 硕士生, 专业方向为应用真菌学; 3通讯作者:贾乐, 博士, 副教授, 硕士导, 研究方向为环境微生物学和真菌学,E -mail :jiale9015@163. com ,T el :0538-8242908。

2　结果与分析

2. 1　原生质体制备(图1) 2. 1. 1　酶浓度对杏鲍菇原生质体产量的影响

在30℃、pH5. 5、0. 6m ol ΠL 甘露醇为稳渗剂条件下, 不同的酶解浓度酶解3h , 结果见表1。溶壁酶浓度为2. 0%时, 原生

质体产量最大(2. 95×10个Πm L ) 。溶壁酶浓度过高或过低, 原生质体产量均明显下降。而溶壁酶浓度1. 5%与2. 0%的原生质体产量相近, 为减少酶用量, 故选用1. 5%为溶壁酶的最佳浓度。

2. 1. 2　酶解时间对杏鲍菇原生质体产量的影响在30℃、pH 5. 5、1. 5%溶壁酶条件下, 以0. 6m ol ΠL 甘露醇

第15卷第1期:52生　物　技　术V ol 115,N o 11:52

α互补蓝色Π且需要合成反应引物, 增加了筛选成本[2]。白色

参考文献:

[1][美]J萨姆布鲁克,D W 拉塞尔. 分子克隆实验指南[M]1第3版1

北京:科学出版社,2003126-321

[2]金红, 李媛, 邓国华. [J]1生物技术,1998,8(6) :41-441

罗婵, 汤刚彬, , (, )

胞转化率差异极显著() 。,OD 值为0. 36(或0. 58) 时收集菌体可获得1. 1×10的高转化率的感受态细胞, 以7%的DMS O 107以上的转化率40d 以上。

关键词:大肠杆菌; ; 制备方法; 转化率; 保存

中图分类号:Q785;Q81311+1　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X (2005) 01-0052-03

Comparative Study on Preparation and Storage of Competent Escherichia coli Cells

LUO Chan ,T ANG G ang -bin ,XIE T i -san ,SHI De -shun

(Animal Reproduction Institute ,G uangxi University ,Nanning 530005,P. R. China )

α进入感受态的条件, 并对感次系统研究了诱导大肠杆菌DH5

受态细胞的保存条件进行了优化, 初步建立了适合南方高温季节制备高转化率大肠杆菌感受态细胞的有效方法。1. 1　材料图1　18℃

下大肠杆菌的生长曲线

α, 质粒pUC18均由本实验室1. 1. 1　菌株与质粒:E . coli DH5

保存。

[1]

1. 1. 3　培养基:LB培养基、S OB 培养基参照文献。(

图2　不同OD 值制备感受态细胞的转化率注:该图转化率项设1为

10, 单位:个)

收稿日期:2004-07-31; 修回日期:2004-10-01

2005年2月　　　　　　　　　　　　　　感受态细胞制备与保存方法的比较研究　　　　　　　　　　　　　　　　　　　53

μ度计测其纯度及浓度,TE 稀释为1ng ΠL , 存于-20℃备用。

min 离心10min 收集菌体; 以5m L 预冷的TSS 转化缓冲液充分重悬菌体; 迅速将悬液分装到预冷的1. 5m L E p 管中, 贮于-80℃冰箱备用。

1. 2. 4　转化及转化率测定:参照文献。转化率即每微克

[2]

2　结果与分析

2. 1　大肠杆菌18℃下的生长曲线

(图2) 。其中, 在OD 值为0. 36、0. 58时获得了最高转化率, 达

8[3]

到1. 1×10, 与Inoue H 报道结果一致。2. 4　不同贮存方法对转化率的影响

在40多天后仍能保持1. 68×10的转化率(见图7) , 而用甘油作为冷冻保护剂贮存于-80℃的感受态细胞一周后已由1. 9×7610下降至6×10(图6、8) 。

3　讨论

[1]

表1　各方法制备的感受态细胞的转化率大肠杆菌群体生长周期包括迟缓期、对数期、稳定期、衰亡

() 期。结合所绘制的生长曲线可知:当OD 值为0. 36、0. 58时, 细T SS 法14. 419. 211. 417. 816. 811. 012. 521. 717. 7142. 515. 83

超高效法42. 147. 136. 032. 836. 141. 644. 145. 848. 437441. 56

菌正处于其对数期的中期, 此时, 细菌处于最理想的生长状态。C aC l 211. 414. 815. 012. 910. 214. 314. 013. 715. 2121. 513. 5

细菌在该期生命力强, 对转化缓冲液的反应性强, 被诱导处于

　　(注:各表转化率项均设1为1×106) 感受态的细菌较多; 同时, 细菌耐受冷打击、冷冻保存造成的物

理损伤、溶液效应的能力也更强, 故获得较高的转化率(1. 1×8[4]

[6]

Finkel SE 等发现处于稳定期的E . coli 由于hofQ 发生突变而导致细菌吸收外源DNA 的能力显著下降。

第15卷第1期:54生　物　技　术V ol 115,N o 11:54

使用超高效法, 在OD 值为0. 36(或0. 58) 时收获菌体可获

得1. 1×10的高转化率的大肠杆菌感受态细胞。将感受态细胞用7%DMSO 作为冷冻保护剂保存于-80℃时效果较好, 可维

持在10以上的转化率达一个多月。

参考文献:

[1]J萨姆布鲁克,D W 拉塞尔著. 黄培堂, 王嘉玺, 朱厚础, 等译. 分子克隆实验指南[M].第3版. 北京:科学出版社,2002,8187-96.

[2]卢圣栋. 现代分子生物学实验技术[M].北京:中国协和医科大学出版社,1999,121290-293.

[3]Inoue H ,N ojima H ,Okayma H. High efficiency trans formation of E scherichia coli with plasm ids[J].G ene ,1990,96:23-28.

[4]TsenS D. Natural plasm id trans formation in E . coli [J].Biomed . Sci ,2002, 9:246-252.

杏鲍菇原生质体制备与再生条件初探

刘敏, 李娟, 周波, 贾乐

(山东农业大学生命科学学院, 山东泰安271018)

摘要:研究酶浓度、酶解时间、酶解温度、培养时间、稳渗剂种类、pH 7

关键词:杏鲍菇; 原生质体; 形成; 再生

中图分类号:Q939.53　　文献标识码:A　　-311X 0054-02

Separation of Pleurotus erygll Proto Plast

Min ,LI Juan ,ZH OU Bo ,J I A Le

Science ,Shandong Agricultural University ,T aian 271018,P 1R 1China )

μ兰De Vessels 首次用裂解酶分离了裂褶菌原生质体, 随后又分剂,0. 22m 微孔滤膜过滤除菌后备用。

离了双孢蘑菇和草菇的原生质体。1980年以后, 有关食用菌1. 4. 2　菌丝培养:取直径5mm 的菌丝块接种于盛有100m L 液

[1,2]

[3]

度水浴中酶解一定时间, 吸取少许酶解液, 血球计数板计数。1　材料与方法

1. 5　原生质体再生[7,8]1. 1　菌种:杏鲍菇(Pleurotus erygii ) 本实验室保存。

1. 5. 1　原生质体纯化:用无菌双层擦镜纸过滤酶解液,4200r Π1. 2　培养基[4-6]

min 离心10min , 去上清液, 用渗透压稳定剂洗2次, 得到纯化1. 2. 1　液体培养基:马铃薯汁20%, 葡萄糖2%, 酵母粉0.

的原生质体。用适当稳渗剂稀释原生质体, 吸取少许悬液, 血2%, 水1000m L ,pH6. 0。

球计数板计数。1. 2. 2　原生质体再生培养基:①PDA 培养基:马铃薯汁20%,

1. 5. 2　原生质体再生:将适量原生质体悬液接种于相应液体葡萄糖2%, pH 5. 5; ②麦芽糖10g , 葡萄糖4g , 酵母粉4g ,

再生培养基中, 静置培养2-3d , 然后吸取1m L 培养液涂布再K H 2PO 41g ,MgS O 4・7H 2O 1g , 可溶性淀粉10g ,VB 11g ,pH 5. 5; ③

生固体平板。麦芽糖10g , 葡萄糖10g , 酵母粉4g ,pH 5. 5。以上三种培养基

原生质体再生率的计算:再生率=再生菌落数Π原生质体溶于0. 6m ol ΠL 渗透压稳定剂中, 至总体积为1000m L 。固体培

总数×100%。养基琼脂用量为2%。

1. 3　试剂

2　结果与分析

2. 1　原生质体制备(图1) 2. 1. 1　酶浓度对杏鲍菇原生质体产量的影响

在30℃、pH5. 5、0. 6m ol ΠL 甘露醇为稳渗剂条件下, 不同的酶解浓度酶解3h , 结果见表1。溶壁酶浓度为2. 0%时, 原生

2. 1. 2　酶解时间对杏鲍菇原生质体产量的影响在30℃、pH 5. 5、1. 5%溶壁酶条件下, 以0. 6m ol ΠL 甘露醇

感受态细胞制备与保存方法的比较研究

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