流动相的调节是搞液相分析最重要的环节，也是液相水平高低的度量，每一种液相都有影响它的主要因素，抓住主要因素，问题就容易解决。欢迎大家讨论。一则可以为新手传播知识，二则大家相互学习共同提高！
先开个头：常用的是化学键合相色谱，分离中性化合较简单，主要是调节溶剂强度，可从有机相的比例合种类两个方面入手，例如：有机相占的比例大，出峰就早。分离酸碱化合物就就复杂一点，增加了添加剂，明白了添加剂的作用，然后从溶剂，酸碱性，添加剂等方面入手。问题就容易解决。
液相色谱采用键合硅胶可以分离绝大多数的分析物质，针对不同化学性质的单体采用不同的键合硅胶，现在有什么十八烷 、氨基柱、氰基、苯基太多了，再加上不同流动相也就是加入不同的抑制剂可以测许多成分，比如：酸性的可以用十八烷加入酸，加缓冲盐；碱性物质可以加缓冲盐，以个人来讲用离子对的形式较多，并且效果也很好，现在分析生物碱是比较难做的，
如用反相色谱柱时，一般先改变有机相与水相的比例；再考虑改变pH 值，酸性物质将pH 值调低，碱性物质将pH 值调高；如两者都无效，可考虑加入离子对试剂，如庚烷磺酸钠用于（碱性药物）
一. 反相HPLC 中的溶剂优化：1. 首先应调整k’值：强溶剂→20％递减→选择
合适的溶液强度，使得k’在1～20（tR ：3～35min ）。 一种方法是首先试用一种可能过强的流动相，在后面的试验中逐渐减小溶剂强度以增大k’。当所有谱峰符合1＜k’＜20的范围时，从溶剂强度的观点来说，其流动相已接近最佳了。(观察待分离组分的分离度) 。（反相色谱——溶剂极性弱洗脱能力强，组分k’减小）。另一种方法是首次用梯度洗脱试验。通过这一实验，有可能估计出使样品的k’值符合1＜k’＜20范围的大概溶剂成分。
2. 改变选择性(á)：根据分子间作用力将溶剂分组。不同组的溶剂选择性不同，根据溶剂分组改变溶剂种类即可改变选择性。
二. 离子对HPLC 中的溶剂优化: 离子对色谱法是分离离子，或可电离的分子的一种色谱技术。关于离子对色谱的机理，至今仍不十分明确，但己提出三种机理：离子对形成机理，离子交换机理，离子相互作用机理。在以下讨论中，采用离子对形成机理。
① 基本原理：有一色谱体系，固定相为非极性，如C18型键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子相反的离子B+，B+离子由于静电引力，与带负电的组分离子生成离子对，故称它为平衡离子或成对离子。由于离子对具有疏水性，因而被非极性固定相(即有机相) 提取。组分离子的性质不同，它与平衡离子形成离子对的能力大小不同，以及离子对的极性不同，导致各组分离子在固定相中滞留的时间不同，因而各离子先后离开色谱柱，这就是离子对色谱法的基本原理。以上这类色谱法称反相离子对色谱法。能用离子对色谱法分离的样品种类很多。它可以用于极性样品，如碱类、酸类、离子、以及带有可离解的多种官能团化合物的分离。可用于生理体液的分析，如甾族化合物以及体液中药物的分析。
反相离子对色谱中流动相的影响小结 ：1. 改变选择性：a. 改变溶剂种类: 改变溶剂选择性的方法，类似于键合相色谱所介绍的原则。选用不同选择性组别的溶剂，可使流动相的选择性得到明显改进。b. 改变pH: 组分离子与平衡离子的生成，离子对的形成，都与流动相的pH 值密切相关。改变流动相的pH 可以改变体系的选择性。流动相的pH 值应调节到能使不同组分有合适的离解度，而使提供平衡离子的化合物能完全离解。要符合这一要求，只有
使提供平衡离子的化合物在一个很宽的pH 范围内保持完全离解，因此，只有强酸盐(高氯酸盐或烷基磺酸盐) 和强碱盐(季铵盐) 才满足此要求。c. 系统选择:使用一种有机溶剂(甲醇) ；流动相的其它三种成分为pH=2.5(和pH=7.5的缓冲液以及另一种pH=5.5、其中含有最大浓度(例如：200mM) 的离子对试剂的缓冲液(D)。以组合不一的缓冲液(B—D) 进行七次实验，并变化甲醇(A)量以保持每次实验的k’值范围大致恒定。
三. 正相HPLC 中的溶剂优化
①溶剂
非极性溶剂：正己烷或FC-113（1,1,2-三氟-1,1,2-三氯乙烷）
极性溶剂：非定位、碱性定位和非碱性定位
按正相HPLC 中谱峰间距效应分类的溶剂
取代和定位是正相HPLC 流动相选择性的主要来源
②溶剂强度调节
③选择性影响
四、梯度洗脱
梯度洗脱给色谱分离带来很大的方使，已成为高效液相色谱法不可缺少的部分。所谓梯度洗脱，就是有两种(或两种以上) 不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续地改变，以改变流动相的配比和极性。通常用的流动相为二元的。
梯度期间，强溶剂B(如反相HPLC 中的甲醇) 的浓度增大。在下述讨论中，我们将这种溶剂的浓度写作 B％ 。
梯度洗脱对分离一定种类的样品很理想。可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度。梯度洗脱对于复杂混合物、特别是保留值相差较大的混合物的分离是极为重要的手段。因为这些样品的k’范围宽，不能用等度方法简单地处置。
１．梯度洗脱期间的平均k’值
tR=tm(1+k’)
VR=Vm(1+k’)=Vm+kVs
针对做生物碱的朋友：
1. 用常规的ODS 柱会出现一个最普遍的问题是：峰很宽，拖尾很严重！
原因：ODS 柱有很多未键合的硅羟基，与N 缔合造成。
解决方案：使用BDS 柱，他是用碱钝化残余的硅羟基，很好的避免了拖尾现象！
2. 用常规的SCX 离子交换柱会出现一个普遍的问题是：重现性差，随流动相的pH 值大小，R t 变化大！ 原因：所谓离子交换柱，就是阴阳正负离子的交换，由于流动相的离子浓度的变化，势必会影响交换平衡！ 解决方案：流动相用Buffer 缓冲液！
实际上用冰醋酸、三氟乙酸、柠檬酸的也不少！
酸的作用就是根据pKa 调节pH 值，一定程度上抑制样品组分的解离
反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH 值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。
对于弱酸，流动相的pH 值越小，组分的k 值越大，当pH 值远远小于弱酸的pKa 值时，弱酸主要以分子形
式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用磷酸(或乙酸、三氯乙酸、1%的甲酸、硫酸、50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液）作用可以抑制溶质的离子化, 获对称的色谱峰；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和或30mmol/L三乙胺溶液。
（注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。）
高效液相色谱法（HPLC ）复核细则
3．建立方法时，应考虑下列事项：
②流动相首选甲醇-水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相，如为碱性药物，流动相的pH 值应为7~8；如为酸性药物，流动相的pH 值应为3~4。
你是可以通过多种办法测定流动相和样品溶液的pH 值。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH 值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH 值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH 值会使硅胶溶解，太低的pH 值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。
分离方式是按固定相的分离机理分类的，选定了固定相（色谱柱）基本上就确定了分离方式。当然，即使同一根色谱柱，如果所用流动相和其它色谱条件不同，也可能成为不同的分离方式。选择分离方式大体上可以参照下图：
一般的钾盐溶解度要比钠盐的。高的缓冲盐浓度有较高的缓冲容量，但是在有机相多的情况下容易析出，高溶解度的钾盐要比钠盐有优势。但是钾盐要贵一点。
磷酸二氢铵嘛就是2个缓冲盐放一起了。缓冲能力、范围更好了，不过铵不稳定。这种体系的流动相不易长时间放置。最好一天一换。
加缓冲盐的目的究竟是什么,
在反相液相色谱分析中，流动相的PH 值一般在2－7之间，当被分析物在反相条件下可离解，或样品的PH 值在2－7之外时，就需要缓冲液。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基，他们的Pka 在1－11之间，选择正确的缓冲液PH 值可保证可离解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物的形式。如果样品的PH 值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。选择缓冲溶液在反相液相色谱方法中对于优化尖峰，捡出限，以及获得稳定的保留时间十分重要
PH 值一般在2-7的范围，还是要固定的调到某个值？
PH 值是一个固定值！1、变化PH 值可以影响出峰保留时间2、影响方法的重现性3、在选择缓冲液PH 值之前，应先了解被分析物的Pka ，高于或低于Pka 两个PH 值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰。溶液PH 值高于或低于Pka 两个单位，化合物中99％以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰. 因此最好是固定PH 值
新买的柱子要老化一下才能用的哦~
色谱柱老化：
在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。
A ．在反相条件下老化
要老化这类柱子，首先要使用乙腈或者甲醇淋洗，然后你选用的洗脱液进行平衡。
在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。
如果流动相中使用了添加物（例如缓冲液或离子对试剂），建议使用正确比例的但不含此添加物的流动相进行缓冲冲洗。缓冲冲洗应当首先以低流速进行，最后再使用正常流速。
B ．在正相条件下老化
柱效可能会受水与固定相的键合的严重影响。柱子的干燥（激活）或润湿（失活）可能是需要的。使用的溶剂可能是水饱和的或者是无水的。干燥柱子可以使用无水的二氯甲烷。
C ．对于极性键合柱的特殊说明
由于这些柱子可以用于反相或者正相条件，在进行老化以前，一定要首先检查你要使用的淋洗溶剂或洗脱液是否可以与封装在柱子里的溶剂相混溶。如果这些溶剂不能混溶，必须先使用一个合适的缓冲溶剂进行冲洗。
流动相的调节是搞液相分析最重要的环节，也是液相水平高低的度量，每一种液相都有影响它的主要因素，抓住主要因素，问题就容易解决。欢迎大家讨论。一则可以为新手传播知识，二则大家相互学习共同提高！
先开个头：常用的是化学键合相色谱，分离中性化合较简单，主要是调节溶剂强度，可从有机相的比例合种类两个方面入手，例如：有机相占的比例大，出峰就早。分离酸碱化合物就就复杂一点，增加了添加剂，明白了添加剂的作用，然后从溶剂，酸碱性，添加剂等方面入手。问题就容易解决。
液相色谱采用键合硅胶可以分离绝大多数的分析物质，针对不同化学性质的单体采用不同的键合硅胶，现在有什么十八烷 、氨基柱、氰基、苯基太多了，再加上不同流动相也就是加入不同的抑制剂可以测许多成分，比如：酸性的可以用十八烷加入酸，加缓冲盐；碱性物质可以加缓冲盐，以个人来讲用离子对的形式较多，并且效果也很好，现在分析生物碱是比较难做的，
如用反相色谱柱时，一般先改变有机相与水相的比例；再考虑改变pH 值，酸性物质将pH 值调低，碱性物质将pH 值调高；如两者都无效，可考虑加入离子对试剂，如庚烷磺酸钠用于（碱性药物）
一. 反相HPLC 中的溶剂优化：1. 首先应调整k’值：强溶剂→20％递减→选择
合适的溶液强度，使得k’在1～20（tR ：3～35min ）。 一种方法是首先试用一种可能过强的流动相，在后面的试验中逐渐减小溶剂强度以增大k’。当所有谱峰符合1＜k’＜20的范围时，从溶剂强度的观点来说，其流动相已接近最佳了。(观察待分离组分的分离度) 。（反相色谱——溶剂极性弱洗脱能力强，组分k’减小）。另一种方法是首次用梯度洗脱试验。通过这一实验，有可能估计出使样品的k’值符合1＜k’＜20范围的大概溶剂成分。
2. 改变选择性(á)：根据分子间作用力将溶剂分组。不同组的溶剂选择性不同，根据溶剂分组改变溶剂种类即可改变选择性。
二. 离子对HPLC 中的溶剂优化: 离子对色谱法是分离离子，或可电离的分子的一种色谱技术。关于离子对色谱的机理，至今仍不十分明确，但己提出三种机理：离子对形成机理，离子交换机理，离子相互作用机理。在以下讨论中，采用离子对形成机理。
① 基本原理：有一色谱体系，固定相为非极性，如C18型键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子相反的离子B+，B+离子由于静电引力，与带负电的组分离子生成离子对，故称它为平衡离子或成对离子。由于离子对具有疏水性，因而被非极性固定相(即有机相) 提取。组分离子的性质不同，它与平衡离子形成离子对的能力大小不同，以及离子对的极性不同，导致各组分离子在固定相中滞留的时间不同，因而各离子先后离开色谱柱，这就是离子对色谱法的基本原理。以上这类色谱法称反相离子对色谱法。能用离子对色谱法分离的样品种类很多。它可以用于极性样品，如碱类、酸类、离子、以及带有可离解的多种官能团化合物的分离。可用于生理体液的分析，如甾族化合物以及体液中药物的分析。
反相离子对色谱中流动相的影响小结 ：1. 改变选择性：a. 改变溶剂种类: 改变溶剂选择性的方法，类似于键合相色谱所介绍的原则。选用不同选择性组别的溶剂，可使流动相的选择性得到明显改进。b. 改变pH: 组分离子与平衡离子的生成，离子对的形成，都与流动相的pH 值密切相关。改变流动相的pH 可以改变体系的选择性。流动相的pH 值应调节到能使不同组分有合适的离解度，而使提供平衡离子的化合物能完全离解。要符合这一要求，只有
使提供平衡离子的化合物在一个很宽的pH 范围内保持完全离解，因此，只有强酸盐(高氯酸盐或烷基磺酸盐) 和强碱盐(季铵盐) 才满足此要求。c. 系统选择:使用一种有机溶剂(甲醇) ；流动相的其它三种成分为pH=2.5(和pH=7.5的缓冲液以及另一种pH=5.5、其中含有最大浓度(例如：200mM) 的离子对试剂的缓冲液(D)。以组合不一的缓冲液(B—D) 进行七次实验，并变化甲醇(A)量以保持每次实验的k’值范围大致恒定。
三. 正相HPLC 中的溶剂优化
①溶剂
非极性溶剂：正己烷或FC-113（1,1,2-三氟-1,1,2-三氯乙烷）
极性溶剂：非定位、碱性定位和非碱性定位
按正相HPLC 中谱峰间距效应分类的溶剂
取代和定位是正相HPLC 流动相选择性的主要来源
②溶剂强度调节
③选择性影响
四、梯度洗脱
梯度洗脱给色谱分离带来很大的方使，已成为高效液相色谱法不可缺少的部分。所谓梯度洗脱，就是有两种(或两种以上) 不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续地改变，以改变流动相的配比和极性。通常用的流动相为二元的。
梯度期间，强溶剂B(如反相HPLC 中的甲醇) 的浓度增大。在下述讨论中，我们将这种溶剂的浓度写作 B％ 。
梯度洗脱对分离一定种类的样品很理想。可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度。梯度洗脱对于复杂混合物、特别是保留值相差较大的混合物的分离是极为重要的手段。因为这些样品的k’范围宽，不能用等度方法简单地处置。
１．梯度洗脱期间的平均k’值
tR=tm(1+k’)
VR=Vm(1+k’)=Vm+kVs
针对做生物碱的朋友：
1. 用常规的ODS 柱会出现一个最普遍的问题是：峰很宽，拖尾很严重！
原因：ODS 柱有很多未键合的硅羟基，与N 缔合造成。
解决方案：使用BDS 柱，他是用碱钝化残余的硅羟基，很好的避免了拖尾现象！
2. 用常规的SCX 离子交换柱会出现一个普遍的问题是：重现性差，随流动相的pH 值大小，R t 变化大！ 原因：所谓离子交换柱，就是阴阳正负离子的交换，由于流动相的离子浓度的变化，势必会影响交换平衡！ 解决方案：流动相用Buffer 缓冲液！
实际上用冰醋酸、三氟乙酸、柠檬酸的也不少！
酸的作用就是根据pKa 调节pH 值，一定程度上抑制样品组分的解离
反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH 值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。
对于弱酸，流动相的pH 值越小，组分的k 值越大，当pH 值远远小于弱酸的pKa 值时，弱酸主要以分子形
式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用磷酸(或乙酸、三氯乙酸、1%的甲酸、硫酸、50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液）作用可以抑制溶质的离子化, 获对称的色谱峰；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和或30mmol/L三乙胺溶液。
（注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。）
高效液相色谱法（HPLC ）复核细则
3．建立方法时，应考虑下列事项：
②流动相首选甲醇-水系统，应尽可能少用含有缓冲液的流动相，如为碱性药物，流动相的pH 值应为7~8；如为酸性药物，流动相的pH 值应为3~4。
你是可以通过多种办法测定流动相和样品溶液的pH 值。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH 值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH 值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH 值会使硅胶溶解，太低的pH 值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。
分离方式是按固定相的分离机理分类的，选定了固定相（色谱柱）基本上就确定了分离方式。当然，即使同一根色谱柱，如果所用流动相和其它色谱条件不同，也可能成为不同的分离方式。选择分离方式大体上可以参照下图：
一般的钾盐溶解度要比钠盐的。高的缓冲盐浓度有较高的缓冲容量，但是在有机相多的情况下容易析出，高溶解度的钾盐要比钠盐有优势。但是钾盐要贵一点。
磷酸二氢铵嘛就是2个缓冲盐放一起了。缓冲能力、范围更好了，不过铵不稳定。这种体系的流动相不易长时间放置。最好一天一换。
加缓冲盐的目的究竟是什么,
在反相液相色谱分析中，流动相的PH 值一般在2－7之间，当被分析物在反相条件下可离解，或样品的PH 值在2－7之外时，就需要缓冲液。在反相条件下可离解的化合物一般都有氨基和羧基，他们的Pka 在1－11之间，选择正确的缓冲液PH 值可保证可离解的官能团以一种形式存在，离子形式或中性化合物的形式。如果样品的PH 值对柱子有伤害，则缓冲溶液可使其变温和从而减小其危害。选择缓冲溶液在反相液相色谱方法中对于优化尖峰，捡出限，以及获得稳定的保留时间十分重要
PH 值一般在2-7的范围，还是要固定的调到某个值？
PH 值是一个固定值！1、变化PH 值可以影响出峰保留时间2、影响方法的重现性3、在选择缓冲液PH 值之前，应先了解被分析物的Pka ，高于或低于Pka 两个PH 值单位的，有助于获得好的、尖锐的峰。溶液PH 值高于或低于Pka 两个单位，化合物中99％以一种形式存在，而一种形式存在的化合物才能获得好的尖锐的峰. 因此最好是固定PH 值
新买的柱子要老化一下才能用的哦~
色谱柱老化：
在开始分析工作以前，柱子必须经过正确的老化。一个没有正确老化的柱子可能会带来问题，诸如很差的柱效或者分离情况发生变化等等。
A ．在反相条件下老化
要老化这类柱子，首先要使用乙腈或者甲醇淋洗，然后你选用的洗脱液进行平衡。
在发货以前，每根柱子都已经测试过并进行了老化。因此没有必要在第一次使用时用水冲洗）。
如果流动相中使用了添加物（例如缓冲液或离子对试剂），建议使用正确比例的但不含此添加物的流动相进行缓冲冲洗。缓冲冲洗应当首先以低流速进行，最后再使用正常流速。
B ．在正相条件下老化
柱效可能会受水与固定相的键合的严重影响。柱子的干燥（激活）或润湿（失活）可能是需要的。使用的溶剂可能是水饱和的或者是无水的。干燥柱子可以使用无水的二氯甲烷。
C ．对于极性键合柱的特殊说明
由于这些柱子可以用于反相或者正相条件，在进行老化以前，一定要首先检查你要使用的淋洗溶剂或洗脱液是否可以与封装在柱子里的溶剂相混溶。如果这些溶剂不能混溶，必须先使用一个合适的缓冲溶剂进行冲洗。