植物多倍体培养
4月10日起
摘要：植物多倍体是指每个细胞中的染色体数具有3套或更多套数的植物。随着染色体组倍数的增加，有可能使一些作物的经济性状发生有利的变化。因此，植物多倍体的研究和利用是育种工作中值得重视的途径之一。本次实验就是通过用拟南芥种子作为实验材料，通过培育多倍体拟南芥，来熟悉掌握一般的多倍体诱导的方法。
1. 引言
1916年温克勒（H.Winkler）在番茄与龙葵的嫁接试验中发现，在愈伤组织长成的枝条中有番茄的四倍体。自1937年布莱克斯利（A.F.B.lakeslee）和埃弗里（A.G.Avery）利用秋水仙素诱发曼陀罗四倍体获得成功以后，各国相继展开人工诱发多倍体的试验研究。1947年，木原均、西山市三发表《利用三倍体无子西瓜之研究》，报导了三倍体无子西瓜选育成功。1959年，西贞夫等利用四倍体结球甘蓝和四倍体白菜杂交，成功地育成双二倍体新种——“白蓝”。目前，已有1000多种植的获得了多倍体。中国于20世纪50年代开始多倍体育种的研究。70年代以来，蔬菜多倍体育种取得许多重要进展，已培育出三倍体、四倍体西瓜，四倍体甜瓜以及萝卜、番茄、茄子、芦笋、辣椒和黄瓜等蔬菜多倍体材料。
多倍化后，多个等位基因互作产生了更多的组合和更多样的功能变化，从而比二倍体亲本拥有更高的杂合性和更迅速的环境适应力，表现为抗逆性增强及克服远缘杂交的不育性等特点而倍受园艺育种学家的青睐。
多倍化导致植物基因组发生部分或全部的重复，其后伴随着DNA排除、DNA同质化、基因沉默和染色体重排等，从而改变了二倍体祖先基因组中基因连锁关系、遗传平衡及遗传修饰式样赋予多倍体基因组新的细胞遗传学特性,使之在细胞形态、核型特征以及基因表达等方面表现出极大的生物学多样性，从而加速物种的进化。
经典理论认为，植物天然多倍体基因组主要起源于体细胞有丝分裂异常、未减数分裂配子融合和种间杂交三个途径。
目前的研究，特别是2003年拟南芥全基因组测序完成之后，多倍体的认识有了新的概念，像拟南芥这种典型的二倍体植物，基因组极小，但却是一个典型的endopolyploid，在生长过程中存在普遍的基因组多倍化事件，科学家研究认为是基因组的表达需要而使得拟南
芥在生长过程中基因组不断的复制自我，因此，自身的基因型以及内源加倍在目前也被认为是多倍体产生的一个重要途径。
人工诱导多倍体的方法很多（在以大蒜根尖多倍体鉴定中）已详细说明，分为物理的（温度剧变、机械损伤、各种射线处理等）和化学方法的（各种植物碱、麻醉剂、植物生长激素等）诱导方法。其中，秋水仙素是诱导多倍体的最有效的方法之一。秋水仙素是从百合科秋水仙素属的一个种，秋水仙（Colchicum autumnale. L.）的器官和种子内提炼出来的一种植物碱。它的化学分子式为C22H25O6N。因有剧毒，故使用时要特别注意，切勿使药液进入眼内或口中。
秋水仙素的作用在于阻止分裂细胞形成纺锤丝，而对染色体的结构和复制无显著影响。浓度适合，药物在细胞中扩散后，不致发生严重的毒害，细胞经一定时期后仍可恢复正常，继续分裂，只是染色体数目加倍成为多倍性细胞，并在此基础上进一步发育成为多倍体植物。
2. 实验材料
2.1. 试验材料
拟南芥种子
0.1%的秋水仙素，MS培养基，花泥 培养皿，Parafilm封口膜，超净工作台等 2.2. 实验方法 2.2.1. MS培养基的配置
先配制母液，再按照所需培养基的量，量取所需体积；按照每1000ml 7g、30g的比例加入琼脂和白砂糖。之后，加水至接近所需体积，调节pH至5.8～6.0，然后定容。 2.2.2. 消毒处理
2.2.2.1. 种子消毒：选取完整且颗粒饱满的拟南芥种子，先用70%的乙醇在离心管中消
毒处理1分钟；在换用2.5%的次氯酸钠溶液处理3分钟；之后立即用清水清洗4-5次。
2.2.2.2. 器具消毒：将培养皿、离心管、移液枪头，以及配置好的MS、所需无菌水、
配好的秋水仙素放入手动高温高压灭菌锅中，消毒灭菌。
2.2.3. 铺板
将消好毒的种子放入离心管中，加入悬浮液（0.3%～0.5%的琼脂溶液），此时拟南芥种子会悬浮在液体中，用移液枪吸取种子，均匀的涂抹在培养板上。然后将培养板一道22℃的有光培养室中培养。 2.2.4. 不同处理诱导多倍体
表1：处理方法
编号 A B
水仙素
C
0.1%秋水仙素的水溶
液
上B1、B2，继续培养；
铺板后，在处理1、2、3、4天后，分别取一部份种子移入新的纯MS培养基上，编号为C1、C2、C3、C4，继续培养；
培养基 纯MS培养基 纯MS培养基+0.1% 秋
铺板后，正常培养；
铺板后，正常培养15天，将所得幼苗分别移入两个纯MS培养板
处理方法
[2]
[1]
铺板后，处理1、2天后，分别取一部份种子移入新的纯MS培养
D
清水
基上，编号为D1、D2。
2.2.5. 移苗
在处理的幼苗长到四叶期（一半需要两周左右）时，准备花泥，将幼苗移入花泥中继续培养。移苗时，小心用镊子从培养皿中连根取出小苗,把苗种入花泥中。移苗结束后,用保鲜膜覆盖1～2天后揭膜，如果苗很弱，则在此基础上还需多覆盖几天。（在花泥中种植时，苗期不需要添加营养液，开始抽苔时及时添加营养液，一般需要添加2次，每次加入1升拟南芥营养液，2次添加最好间隔一段生长时期（7～10天）。）
3. 结果及讨论
3.1.
表2：后期处理及结果
编号 A B1 B2 C1
泥培养
C2
纯MS培养
长的迹象，但并未生根，最终还是变黄，死亡；
C3
纯MS培养
有生长迹象，很快变黄，死亡；
C4
纯MS培养
生长迹象，很快变坏，死亡；
D1
纯MS培养
正常植株；
D2
纯MS培养
长成正常植株；
在D中培养一天后，种子萌发，长出嫩叶；移入D1后，种子在D中培养一天后，种子萌发，露白；移入D1后，种子长成在C中培养三天，种子已见两片绿色叶片；移入C4之后，无在C中培养三天，种子已见绿色叶片；移入C3之后，基本没但相对正常植株，仍显矮壮，在四叶期之后移入花泥中；
在C中培养两天，种子已见绿芽；移入C2之后，仍有继续生
培养方式 移入花泥培养 纯MS培养 纯MS培养
纯MS培养，之后移入花
最终效果
一部分植株变黄枯萎；大部分能够正常生长；
在B中约10天后，已经长到两叶期，但是之后一直没长；移到B1、B2后，绿色渐渐褪去，最终变黄死亡；
在C中培养一天，种子已经萌动，露白；移入C1长势较好，
3.2. 植株外观
均是在4月21日同时处理并播种到培养皿上的，在不同处理下，都培养了20天，所观察到的不同植株外观。 3.2.1. A植株
正常培养，未做任何处理，正常植株，根细长，比地上部分要长出很多。但人比学长们所培养的拟南芥植株要小，初步分析是因为我们培养板上缩到的培养基过少。理论上，直径9cm的培养皿，所加M.S.培养基25～30ml，培养基过少会出现我们的情况，导致植株生根很短，植株个体过小；培养基过多，导致植株上部生长空间过小，以不利于植株的培养观察。
图1为整株；图2为根部放大。
图1 图2
3.2.2. B植株（B1、B2的处理完全一样）
在B中培养15天左右，后转入纯MS培养基中，秋水仙素起到了使染色体加倍的作用所得植株基本可以确定为多倍体。而且植株明显矮壮，根粗极短，长出的可以吸收营养物质的根须也很短、很少，这也预示着这样植株注定不可能成活。
图3为整株；图4为根部放大。
图3 图4
3.2.3. C植株
C1中的植株是在0.1%秋水仙素的水溶液处理1天后转入纯MS培养基中培养得到的植
株，种子在C中时已经萌动，露白，可以肯定秋水仙素在种子的早期有丝分裂中起到了使染色体加倍的作用。后期植株情况也显示出多倍的特性：植株粗壮，但相对矮小；根部亦比正常植株粗短，但是没有长出可以吸收营养物质的根须，看上去更像是棱角分明块状的根。
图5、图6为C1植株；图7、图8为C2植株；C3、C4的处理，并未得到可见的有根、有叶的植株。
图5 图6
图7 图8
3.2.4. D植株
D植株是在清水中发芽（1、2天），后转入纯MS培养基中培养。虽然并未用秋水仙素处理，但是从根的外观来看，与正常植株仍有差距，又很明显的主根分叉，没有根须，与A中的正常植株相比，根仍显粗短。初步原因分析是因为在培养过程中，由于多次被污染，我们几次转移植株，对植株可能造成了较大的损伤。
图9为D1植株。
图9
4. 注意事项
1) MS培养基的配置：注意各母液在4℃保存；一般先将MS溶液定容到接近所需体积，
再调整pH（因为体积变化很小时，对pH的影响微乎其微），最后加上琼脂粉； 2) 悬浮液：拟南芥种子所用的悬浮液为0.3%～0.5%的琼脂溶液；不同的铺板方法可
以不需要悬浮液；
3) 消毒问题：消毒时间一定把握好，由于拟南芥种子极小，很容易在消毒溶液中被杀
死；
4) 铺板问题：培养板中植株过密、不均匀，都不利于植株的生长；在A中培养的植株
由于铺板时不够均匀，我们不得不在二叶期时进行重新铺板，将苗铺均匀。 5) 将苗转入花泥之后，初期也要注意及时除去花泥表面的霉菌，否则影响植株生长；
后期苗长大之后，成了这个培养盒的优势种，对无菌条件的要求会低一些，而且霉菌也会不容易长起来。
[1]MS培养基配置方法：
植物多倍体培养
4月10日起
摘要：植物多倍体是指每个细胞中的染色体数具有3套或更多套数的植物。随着染色体组倍数的增加，有可能使一些作物的经济性状发生有利的变化。因此，植物多倍体的研究和利用是育种工作中值得重视的途径之一。本次实验就是通过用拟南芥种子作为实验材料，通过培育多倍体拟南芥，来熟悉掌握一般的多倍体诱导的方法。
1. 引言
1916年温克勒（H.Winkler）在番茄与龙葵的嫁接试验中发现，在愈伤组织长成的枝条中有番茄的四倍体。自1937年布莱克斯利（A.F.B.lakeslee）和埃弗里（A.G.Avery）利用秋水仙素诱发曼陀罗四倍体获得成功以后，各国相继展开人工诱发多倍体的试验研究。1947年，木原均、西山市三发表《利用三倍体无子西瓜之研究》，报导了三倍体无子西瓜选育成功。1959年，西贞夫等利用四倍体结球甘蓝和四倍体白菜杂交，成功地育成双二倍体新种——“白蓝”。目前，已有1000多种植的获得了多倍体。中国于20世纪50年代开始多倍体育种的研究。70年代以来，蔬菜多倍体育种取得许多重要进展，已培育出三倍体、四倍体西瓜，四倍体甜瓜以及萝卜、番茄、茄子、芦笋、辣椒和黄瓜等蔬菜多倍体材料。
多倍化后，多个等位基因互作产生了更多的组合和更多样的功能变化，从而比二倍体亲本拥有更高的杂合性和更迅速的环境适应力，表现为抗逆性增强及克服远缘杂交的不育性等特点而倍受园艺育种学家的青睐。
多倍化导致植物基因组发生部分或全部的重复，其后伴随着DNA排除、DNA同质化、基因沉默和染色体重排等，从而改变了二倍体祖先基因组中基因连锁关系、遗传平衡及遗传修饰式样赋予多倍体基因组新的细胞遗传学特性,使之在细胞形态、核型特征以及基因表达等方面表现出极大的生物学多样性，从而加速物种的进化。
经典理论认为，植物天然多倍体基因组主要起源于体细胞有丝分裂异常、未减数分裂配子融合和种间杂交三个途径。
目前的研究，特别是2003年拟南芥全基因组测序完成之后，多倍体的认识有了新的概念，像拟南芥这种典型的二倍体植物，基因组极小，但却是一个典型的endopolyploid，在生长过程中存在普遍的基因组多倍化事件，科学家研究认为是基因组的表达需要而使得拟南
芥在生长过程中基因组不断的复制自我，因此，自身的基因型以及内源加倍在目前也被认为是多倍体产生的一个重要途径。
人工诱导多倍体的方法很多（在以大蒜根尖多倍体鉴定中）已详细说明，分为物理的（温度剧变、机械损伤、各种射线处理等）和化学方法的（各种植物碱、麻醉剂、植物生长激素等）诱导方法。其中，秋水仙素是诱导多倍体的最有效的方法之一。秋水仙素是从百合科秋水仙素属的一个种，秋水仙（Colchicum autumnale. L.）的器官和种子内提炼出来的一种植物碱。它的化学分子式为C22H25O6N。因有剧毒，故使用时要特别注意，切勿使药液进入眼内或口中。
秋水仙素的作用在于阻止分裂细胞形成纺锤丝，而对染色体的结构和复制无显著影响。浓度适合，药物在细胞中扩散后，不致发生严重的毒害，细胞经一定时期后仍可恢复正常，继续分裂，只是染色体数目加倍成为多倍性细胞，并在此基础上进一步发育成为多倍体植物。
2. 实验材料
2.1. 试验材料
拟南芥种子
0.1%的秋水仙素，MS培养基，花泥 培养皿，Parafilm封口膜，超净工作台等 2.2. 实验方法 2.2.1. MS培养基的配置
先配制母液，再按照所需培养基的量，量取所需体积；按照每1000ml 7g、30g的比例加入琼脂和白砂糖。之后，加水至接近所需体积，调节pH至5.8～6.0，然后定容。 2.2.2. 消毒处理
2.2.2.1. 种子消毒：选取完整且颗粒饱满的拟南芥种子，先用70%的乙醇在离心管中消
毒处理1分钟；在换用2.5%的次氯酸钠溶液处理3分钟；之后立即用清水清洗4-5次。
2.2.2.2. 器具消毒：将培养皿、离心管、移液枪头，以及配置好的MS、所需无菌水、
配好的秋水仙素放入手动高温高压灭菌锅中，消毒灭菌。
2.2.3. 铺板
将消好毒的种子放入离心管中，加入悬浮液（0.3%～0.5%的琼脂溶液），此时拟南芥种子会悬浮在液体中，用移液枪吸取种子，均匀的涂抹在培养板上。然后将培养板一道22℃的有光培养室中培养。 2.2.4. 不同处理诱导多倍体
表1：处理方法
编号 A B
水仙素
C
0.1%秋水仙素的水溶
液
上B1、B2，继续培养；
铺板后，在处理1、2、3、4天后，分别取一部份种子移入新的纯MS培养基上，编号为C1、C2、C3、C4，继续培养；
培养基 纯MS培养基 纯MS培养基+0.1% 秋
铺板后，正常培养；
铺板后，正常培养15天，将所得幼苗分别移入两个纯MS培养板
处理方法
[2]
[1]
铺板后，处理1、2天后，分别取一部份种子移入新的纯MS培养
D
清水
基上，编号为D1、D2。
2.2.5. 移苗
在处理的幼苗长到四叶期（一半需要两周左右）时，准备花泥，将幼苗移入花泥中继续培养。移苗时，小心用镊子从培养皿中连根取出小苗,把苗种入花泥中。移苗结束后,用保鲜膜覆盖1～2天后揭膜，如果苗很弱，则在此基础上还需多覆盖几天。（在花泥中种植时，苗期不需要添加营养液，开始抽苔时及时添加营养液，一般需要添加2次，每次加入1升拟南芥营养液，2次添加最好间隔一段生长时期（7～10天）。）
3. 结果及讨论
3.1.
表2：后期处理及结果
编号 A B1 B2 C1
泥培养
C2
纯MS培养
长的迹象，但并未生根，最终还是变黄，死亡；
C3
纯MS培养
有生长迹象，很快变黄，死亡；
C4
纯MS培养
生长迹象，很快变坏，死亡；
D1
纯MS培养
正常植株；
D2
纯MS培养
长成正常植株；
在D中培养一天后，种子萌发，长出嫩叶；移入D1后，种子在D中培养一天后，种子萌发，露白；移入D1后，种子长成在C中培养三天，种子已见两片绿色叶片；移入C4之后，无在C中培养三天，种子已见绿色叶片；移入C3之后，基本没但相对正常植株，仍显矮壮，在四叶期之后移入花泥中；
在C中培养两天，种子已见绿芽；移入C2之后，仍有继续生
培养方式 移入花泥培养 纯MS培养 纯MS培养
纯MS培养，之后移入花
最终效果
一部分植株变黄枯萎；大部分能够正常生长；
在B中约10天后，已经长到两叶期，但是之后一直没长；移到B1、B2后，绿色渐渐褪去，最终变黄死亡；
在C中培养一天，种子已经萌动，露白；移入C1长势较好，
3.2. 植株外观
均是在4月21日同时处理并播种到培养皿上的，在不同处理下，都培养了20天，所观察到的不同植株外观。 3.2.1. A植株
正常培养，未做任何处理，正常植株，根细长，比地上部分要长出很多。但人比学长们所培养的拟南芥植株要小，初步分析是因为我们培养板上缩到的培养基过少。理论上，直径9cm的培养皿，所加M.S.培养基25～30ml，培养基过少会出现我们的情况，导致植株生根很短，植株个体过小；培养基过多，导致植株上部生长空间过小，以不利于植株的培养观察。
图1为整株；图2为根部放大。
图1 图2
3.2.2. B植株（B1、B2的处理完全一样）
在B中培养15天左右，后转入纯MS培养基中，秋水仙素起到了使染色体加倍的作用所得植株基本可以确定为多倍体。而且植株明显矮壮，根粗极短，长出的可以吸收营养物质的根须也很短、很少，这也预示着这样植株注定不可能成活。
图3为整株；图4为根部放大。
图3 图4
3.2.3. C植株
C1中的植株是在0.1%秋水仙素的水溶液处理1天后转入纯MS培养基中培养得到的植
株，种子在C中时已经萌动，露白，可以肯定秋水仙素在种子的早期有丝分裂中起到了使染色体加倍的作用。后期植株情况也显示出多倍的特性：植株粗壮，但相对矮小；根部亦比正常植株粗短，但是没有长出可以吸收营养物质的根须，看上去更像是棱角分明块状的根。
图5、图6为C1植株；图7、图8为C2植株；C3、C4的处理，并未得到可见的有根、有叶的植株。
图5 图6
图7 图8
3.2.4. D植株
D植株是在清水中发芽（1、2天），后转入纯MS培养基中培养。虽然并未用秋水仙素处理，但是从根的外观来看，与正常植株仍有差距，又很明显的主根分叉，没有根须，与A中的正常植株相比，根仍显粗短。初步原因分析是因为在培养过程中，由于多次被污染，我们几次转移植株，对植株可能造成了较大的损伤。
图9为D1植株。
图9
4. 注意事项
1) MS培养基的配置：注意各母液在4℃保存；一般先将MS溶液定容到接近所需体积，
再调整pH（因为体积变化很小时，对pH的影响微乎其微），最后加上琼脂粉； 2) 悬浮液：拟南芥种子所用的悬浮液为0.3%～0.5%的琼脂溶液；不同的铺板方法可
以不需要悬浮液；
3) 消毒问题：消毒时间一定把握好，由于拟南芥种子极小，很容易在消毒溶液中被杀
死；
4) 铺板问题：培养板中植株过密、不均匀，都不利于植株的生长；在A中培养的植株
由于铺板时不够均匀，我们不得不在二叶期时进行重新铺板，将苗铺均匀。 5) 将苗转入花泥之后，初期也要注意及时除去花泥表面的霉菌，否则影响植株生长；
后期苗长大之后，成了这个培养盒的优势种，对无菌条件的要求会低一些，而且霉菌也会不容易长起来。
[1]MS培养基配置方法：