总SOD 活性检测试剂盒( NBT法) 产品编号
S0107 产品名称 包装 总SOD 活性检测试剂盒(NBT法次
产品简介：
¾
¾
¾ 碧云天的总SOD 活性检测试剂盒(NBT法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一种基于NBT 的显色反应，通过比色来检测细胞、组织或其它样品中SOD 即超氧化物歧化酶活性的试剂盒。 超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)能催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢(H2O 2) 和氧气(O2) ，是生物体内一种重要的抗氧化酶。 本试剂盒采用经典的氮蓝四唑(NBT)显色法。通过黄嘌呤(Xanthine)及黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase)反应系统产生超氧
阴离子(O2-. ) ，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜(formazan)，后者在560nm 处有强吸收。而SOD 可清除超氧阴离子，从而抑制了甲臜的形成。反应液蓝色愈深，说明超氧化物岐化酶活性愈低，反之则酶活性愈高。据此通过比色分析就可以计算出超氧化物岐化酶活性水平。本试剂盒的检测原理图如下:
基于黄嘌呤氧化酶藕联反应体系和NBT 的SOD 酶活力检测原理图。XO ：xanthine oxidase。
¾ 本试剂盒可以检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、全血、红细胞裂解产物、血清等生物样品中的SOD 活性。一个试剂盒
共可以进行100次检测。 包装清单：
产品编号
S0107-1
S0107-2
S0107-3
S0107-4
— 产品名称 包装 SOD 检测缓冲液NBT 500µl 酶溶液稀释液 说明书 10ml 1份
保存条件：
4℃保存，半年有效。S0107-2 NBT溶液需避光保存。
注意事项：
样本-70℃可保存1个月。需注意反复冻融会导致部分SOD 失活。
抗氧化物会对本试剂盒的检测产生干扰，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都会使测定出来的吸光度上升约10%。此时尽管样品没有颜色，如果设置了使用说明中的空白对照3，就可以消除样品中的抗氧化物的干扰。
¾ 酶溶液可能会有少量沉淀，属正常现象，请混匀后使用。
¾ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 ¾ ¾
使用说明：
1. 样品的准备：
a. 细胞样品的准备：收集细胞，用4℃PBS 或生理盐水洗涤1-2遍。沉淀用碧云天的Western 及IP 细胞裂解液(P0013)裂解，或用其他适当的裂解液裂解，或进行匀浆。对于裂解液或匀浆液，4℃离心取上清作为待测样品。裂解或匀浆宜在冰浴或4℃进行操作。
b. 组织样品的准备：动物组织用生理盐水(0.9% NaCl，含有0.16mg/ml肝素钠) 灌流清除血液后获取组织样品。取适量的
组织样品，加入碧云天的Western 及IP 细胞裂解液(P0013)或其他适当溶液进行匀浆。对于匀浆产物，4℃离心取上清作为待测样品。裂解或匀浆宜在冰浴或4℃进行操作。
c. 红细胞或血浆样品的准备：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。4℃ 600g离心10分钟，移取上清至另一新的1ml 离心管
中，适量生理盐水稀释后即可作为血浆样本进行检测。红细胞样品可同细胞样品的准备，可以用碧云天的Western 及IP 细胞裂解液(P0013)或其他适当的裂解液裂解。
d. 上述样品准备完毕后可以用碧云天生产的BCA 蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋
白浓度。通常10-20微克蛋白的细胞或组织裂解液或匀浆液样品其中的SOD 平均活力约1个活力单位左右。每种样品准备20-100微克蛋白量通常已经足够用于后续检测。
e. 根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用本试剂盒提供的稀释液适当稀释样品。裂解好的样品通常至少需要加入等体积
的稀释液进行稀释。准备好的样品如果当日测定，可以冰浴保存，如果当天不能完成测定，可以-70℃冻存，但建议尽量当天完成测定。
2. 试剂盒的准备工作：
a. NBT 工作液的配制：按照每1.8毫升SOD 检测缓冲液中加入50微升NBT 的比例进行配制(用SOD 检测缓冲液将NBT 稀释约36倍) ，混匀后即为NBT 工作液。可以根据实验需要配制适当量的NBT 工作液，配制好的NBT 工作液4℃可以保存1-2天，但建议尽量现配现用。
b. 酶工作液的配制：先把试剂盒中的酶溶液轻轻混匀，并轻轻离心沉淀酶溶液至管底。按照每200微升稀释液中加入5微升酶溶液的比例进行配制(用稀释液将酶溶液稀释约40倍) ，混匀后即为酶工作液。可以根据实验需要配制适当量的酶工作液，配制好的酶工作液4℃可保存1-2周，但建议尽量现配现用。
注意：由于酶溶液的用量比较少且易沉降，必须注意充分混匀。
c. (可选做)SOD 标准品准备：需自备SOD 标准品，用本试剂盒提供的稀释液将SOD 标准品稀释至如下系列浓度：100U/ml，50U/ml，20U/ml, 10U/ml， 5U/ml，1U/ml，0.1U/ml，0.01U/ml，0.001U/ml。在随后的检测中可以各取20微升，参考样品进行检测。说明：本试剂盒对于SOD 的检测并不需要SOD 作为标准品，但可以使用SOD 标准品作为阳性对照或作为对SOD 活性定量的参考。
3. 样品测定：
a. 参考下表使用96孔板设置样品孔和各种空白对照孔。参考下表依次加入待测样品和其他各种溶液。加入酶工作液后充分混匀。注意：加入酶工作液后反应即会开始，可以在低温操作或用排枪操作以减小各孔间因为加入酶工作液的时间先后而导致的误差。
样品(Sample) 空白对照1(Blank1)空白对照2(Blank2) 空白对照3 (Blank3)*
待测样品－ －稀释液 － 20µl 40µl 40µl
NBT 工作液酶工作液 20µl 20µl － －
*如果样品有颜色或含有抗氧化物质，则需设置空白对照3；如果样品没有颜色并且也不含有抗氧化物则没有必要设置空白对照3。
b. 37℃孵育20分钟。(说明：孵育20
分钟至30分钟检测出来的SOD 活力无显著差异)
c. 在560nm 测定吸光度。可以使用大于650nm 的波长作为参考波长进行双波长测定。
4. 样品中总SOD 活力的计算：
a. 抑制百分率的计算：
参考如下计算公式计算抑制百分率：
抑制百分率 ＝ [(A空白对照1－A 空白对照2) －(A样品－A 空白对照3)] / (A空白对照1－A 空白对照2) × 100%
如果没有设置空白对照3，则可以把计算公式简化为：
抑制百分率 ＝ (A空白对照1－A 空白对照2－A 样品) / (A空白对照1－A 空白对照2) × 100%
如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%，则通常需要把该样品重新测定。尽量使样品的抑制百分率在30-70%范围内。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样品；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样品。
b. SOD 酶活力单位的定义：在上述黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD 酶活力定义为
一个酶活力单位。
c. SOD 酶活力的计算：
参考上图A 和B ，SOD 的酶活力和抑制百分率呈非线性的关系，而1/SOD酶活力和1/抑制百分率成线性关系。由此得出SOD 酶活力的计算公式如下： 待测样品中SOD 酶活力单位＝检测体系中SOD 酶活力单位＝抑制百分率 / (1－抑制百分率) units 例如，当抑制百分率为50%时，待测样品中SOD 酶活力单位＝50% / (1－50％)units ＝1 unit；当抑制百分率为60%时，待测样品中SOD 酶活力单位＝60% / (1－60％)units ＝1.5 units。 d. 如果样品为细胞或组织的裂解液或匀浆液，可以根据样品的蛋白浓度和稀释倍数，将SOD 活力单位换算为U/g或U/mg蛋白。如果样品为红细胞抽提液，可以根据血红蛋白含量，可换算为U/克血红蛋白或U/毫克血红蛋白。 附1：SOD 酶活力计算的参考方案：可以先使用本试剂盒绘制SOD 标准品的抑制百分率曲线，然后根据样品检测到的抑制百分率对比标准品的抑制百分率曲线计算出样品中的SOD 酶活力单位。本方案仅供参考，使用本试剂盒时不必使用本方案进行检测和计算。 附2： SOD酶活力的动力学检测：如果条件许可，使用本试剂盒时也可以使用动力学方法检测SOD 的酶活力。通常在步骤3.a. 后可以37℃孵育同时在560nm 连续测定吸光度20分钟。根据20分钟内的吸光度变化的斜率计算出抑制百分率： 抑制百分率 ＝ [(斜率空白对照1－斜率空白对照2) －(斜率样品－斜率空白对照3)] / (斜率空白对照1－斜率空白对照2) × 100% 其余的计算方法同上述非动力学的计算方法。动力学方法的检测和计算更加精确一些，但检测起来相对要麻烦一些。使用本试剂盒通常使用非动力学方法即可。
总SOD 活性检测试剂盒( NBT法) 产品编号
S0107 产品名称 包装 总SOD 活性检测试剂盒(NBT法次
产品简介：
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¾ 碧云天的总SOD 活性检测试剂盒(NBT法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一种基于NBT 的显色反应，通过比色来检测细胞、组织或其它样品中SOD 即超氧化物歧化酶活性的试剂盒。 超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)能催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢(H2O 2) 和氧气(O2) ，是生物体内一种重要的抗氧化酶。 本试剂盒采用经典的氮蓝四唑(NBT)显色法。通过黄嘌呤(Xanthine)及黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase)反应系统产生超氧
阴离子(O2-. ) ，将氮蓝四唑还原为蓝色的甲臜(formazan)，后者在560nm 处有强吸收。而SOD 可清除超氧阴离子，从而抑制了甲臜的形成。反应液蓝色愈深，说明超氧化物岐化酶活性愈低，反之则酶活性愈高。据此通过比色分析就可以计算出超氧化物岐化酶活性水平。本试剂盒的检测原理图如下:
基于黄嘌呤氧化酶藕联反应体系和NBT 的SOD 酶活力检测原理图。XO ：xanthine oxidase。
¾ 本试剂盒可以检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、全血、红细胞裂解产物、血清等生物样品中的SOD 活性。一个试剂盒
共可以进行100次检测。 包装清单：
产品编号
S0107-1
S0107-2
S0107-3
S0107-4
— 产品名称 包装 SOD 检测缓冲液NBT 500µl 酶溶液稀释液 说明书 10ml 1份
保存条件：
4℃保存，半年有效。S0107-2 NBT溶液需避光保存。
注意事项：
样本-70℃可保存1个月。需注意反复冻融会导致部分SOD 失活。
抗氧化物会对本试剂盒的检测产生干扰，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都会使测定出来的吸光度上升约10%。此时尽管样品没有颜色，如果设置了使用说明中的空白对照3，就可以消除样品中的抗氧化物的干扰。
¾ 酶溶液可能会有少量沉淀，属正常现象，请混匀后使用。
¾ 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。 ¾ ¾
使用说明：
1. 样品的准备：
a. 细胞样品的准备：收集细胞，用4℃PBS 或生理盐水洗涤1-2遍。沉淀用碧云天的Western 及IP 细胞裂解液(P0013)裂解，或用其他适当的裂解液裂解，或进行匀浆。对于裂解液或匀浆液，4℃离心取上清作为待测样品。裂解或匀浆宜在冰浴或4℃进行操作。
b. 组织样品的准备：动物组织用生理盐水(0.9% NaCl，含有0.16mg/ml肝素钠) 灌流清除血液后获取组织样品。取适量的
组织样品，加入碧云天的Western 及IP 细胞裂解液(P0013)或其他适当溶液进行匀浆。对于匀浆产物，4℃离心取上清作为待测样品。裂解或匀浆宜在冰浴或4℃进行操作。
c. 红细胞或血浆样品的准备：用抗凝管收集血液，颠倒混匀。4℃ 600g离心10分钟，移取上清至另一新的1ml 离心管
中，适量生理盐水稀释后即可作为血浆样本进行检测。红细胞样品可同细胞样品的准备，可以用碧云天的Western 及IP 细胞裂解液(P0013)或其他适当的裂解液裂解。
d. 上述样品准备完毕后可以用碧云天生产的BCA 蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0010S/P0011/P0012/P0012S)测定蛋
白浓度。通常10-20微克蛋白的细胞或组织裂解液或匀浆液样品其中的SOD 平均活力约1个活力单位左右。每种样品准备20-100微克蛋白量通常已经足够用于后续检测。
e. 根据蛋白浓度和预计的蛋白使用量，用本试剂盒提供的稀释液适当稀释样品。裂解好的样品通常至少需要加入等体积
的稀释液进行稀释。准备好的样品如果当日测定，可以冰浴保存，如果当天不能完成测定，可以-70℃冻存，但建议尽量当天完成测定。
2. 试剂盒的准备工作：
a. NBT 工作液的配制：按照每1.8毫升SOD 检测缓冲液中加入50微升NBT 的比例进行配制(用SOD 检测缓冲液将NBT 稀释约36倍) ，混匀后即为NBT 工作液。可以根据实验需要配制适当量的NBT 工作液，配制好的NBT 工作液4℃可以保存1-2天，但建议尽量现配现用。
b. 酶工作液的配制：先把试剂盒中的酶溶液轻轻混匀，并轻轻离心沉淀酶溶液至管底。按照每200微升稀释液中加入5微升酶溶液的比例进行配制(用稀释液将酶溶液稀释约40倍) ，混匀后即为酶工作液。可以根据实验需要配制适当量的酶工作液，配制好的酶工作液4℃可保存1-2周，但建议尽量现配现用。
注意：由于酶溶液的用量比较少且易沉降，必须注意充分混匀。
c. (可选做)SOD 标准品准备：需自备SOD 标准品，用本试剂盒提供的稀释液将SOD 标准品稀释至如下系列浓度：100U/ml，50U/ml，20U/ml, 10U/ml， 5U/ml，1U/ml，0.1U/ml，0.01U/ml，0.001U/ml。在随后的检测中可以各取20微升，参考样品进行检测。说明：本试剂盒对于SOD 的检测并不需要SOD 作为标准品，但可以使用SOD 标准品作为阳性对照或作为对SOD 活性定量的参考。
3. 样品测定：
a. 参考下表使用96孔板设置样品孔和各种空白对照孔。参考下表依次加入待测样品和其他各种溶液。加入酶工作液后充分混匀。注意：加入酶工作液后反应即会开始，可以在低温操作或用排枪操作以减小各孔间因为加入酶工作液的时间先后而导致的误差。
样品(Sample) 空白对照1(Blank1)空白对照2(Blank2) 空白对照3 (Blank3)*
待测样品－ －稀释液 － 20µl 40µl 40µl
NBT 工作液酶工作液 20µl 20µl － －
*如果样品有颜色或含有抗氧化物质，则需设置空白对照3；如果样品没有颜色并且也不含有抗氧化物则没有必要设置空白对照3。
b. 37℃孵育20分钟。(说明：孵育20
分钟至30分钟检测出来的SOD 活力无显著差异)
c. 在560nm 测定吸光度。可以使用大于650nm 的波长作为参考波长进行双波长测定。
4. 样品中总SOD 活力的计算：
a. 抑制百分率的计算：
参考如下计算公式计算抑制百分率：
抑制百分率 ＝ [(A空白对照1－A 空白对照2) －(A样品－A 空白对照3)] / (A空白对照1－A 空白对照2) × 100%
如果没有设置空白对照3，则可以把计算公式简化为：
抑制百分率 ＝ (A空白对照1－A 空白对照2－A 样品) / (A空白对照1－A 空白对照2) × 100%
如果计算出来的抑制百分率小于30%或大于70%，则通常需要把该样品重新测定。尽量使样品的抑制百分率在30-70%范围内。如果测定出来的抑制百分率偏高，则需适当稀释样品；如果测定出来的抑制百分率偏低，则需重新准备浓度比较高的待测样品。
b. SOD 酶活力单位的定义：在上述黄嘌呤氧化酶藕联反应体系中抑制百分率为50%时，反应体系中的SOD 酶活力定义为
一个酶活力单位。
c. SOD 酶活力的计算：
参考上图A 和B ，SOD 的酶活力和抑制百分率呈非线性的关系，而1/SOD酶活力和1/抑制百分率成线性关系。由此得出SOD 酶活力的计算公式如下： 待测样品中SOD 酶活力单位＝检测体系中SOD 酶活力单位＝抑制百分率 / (1－抑制百分率) units 例如，当抑制百分率为50%时，待测样品中SOD 酶活力单位＝50% / (1－50％)units ＝1 unit；当抑制百分率为60%时，待测样品中SOD 酶活力单位＝60% / (1－60％)units ＝1.5 units。 d. 如果样品为细胞或组织的裂解液或匀浆液，可以根据样品的蛋白浓度和稀释倍数，将SOD 活力单位换算为U/g或U/mg蛋白。如果样品为红细胞抽提液，可以根据血红蛋白含量，可换算为U/克血红蛋白或U/毫克血红蛋白。 附1：SOD 酶活力计算的参考方案：可以先使用本试剂盒绘制SOD 标准品的抑制百分率曲线，然后根据样品检测到的抑制百分率对比标准品的抑制百分率曲线计算出样品中的SOD 酶活力单位。本方案仅供参考，使用本试剂盒时不必使用本方案进行检测和计算。 附2： SOD酶活力的动力学检测：如果条件许可，使用本试剂盒时也可以使用动力学方法检测SOD 的酶活力。通常在步骤3.a. 后可以37℃孵育同时在560nm 连续测定吸光度20分钟。根据20分钟内的吸光度变化的斜率计算出抑制百分率： 抑制百分率 ＝ [(斜率空白对照1－斜率空白对照2) －(斜率样品－斜率空白对照3)] / (斜率空白对照1－斜率空白对照2) × 100% 其余的计算方法同上述非动力学的计算方法。动力学方法的检测和计算更加精确一些，但检测起来相对要麻烦一些。使用本试剂盒通常使用非动力学方法即可。