第一章 磷脂代谢
磷脂是生物膜的重要组分,作为膜的结构和功能单位,膜磷脂以其规律的结构保证细胞的正常形态和功能,如生长、繁殖、细胞识别与消除、细胞间信息传递、细胞防御、能量转换等功能,影响血液粘滞性、血液凝固和红细胞形态,参与脂蛋白的组成。磷脂是膜上的各种脂类依赖性酶类起催化作用不可缺少的物质。
衰老及多种疾病的发生与膜磷脂构成改变有关。补充磷脂在抗衰老、防止动脉硬化、调节血糖、防治肝硬化、皮肤病、血液病、神经功能调节及智力开发等领域均有作用。
第一节 磷脂的分类、分布和性质
鞘脂(sphingolipids) 含鞘氨醇(sphingosine)或二氢鞘氨醇的脂类
由甘油构成的磷脂称为甘油磷脂(phosphoglyceride);
由鞘氨醇构成的磷脂,称为鞘磷脂(sphingolipid)。
磷脂结构特点是:具有由磷酸相连的取代基团(含氮碱或醇类) 构成的亲水头(hydrophilic head)和由脂肪酸链构成的疏水尾(hydrophobic tail)。
在生物膜中磷脂的亲水头部位于膜表面,而疏水尾位于膜内侧。因甘油磷脂有极性头(-0H 与P 形成脂键)、非极性尾(CH 长链),故这类化合物是两性脂类。
甘油磷脂类包括:
1. 磷脂酰胆碱(PC ) :又名为卵磷脂
2.磷脂酰乙醇胺(PE ):又名为脑磷脂
3.磷脂酰丝氨酸(PS )
4. 磷脂酰肌醇(PI ):
5. 磷脂酰甘油(PG )
6. 二磷脂酰甘油(DPG ):心磷脂(CL )
7. 溶血磷脂
8. 缩醛磷脂
9. 血小板活化因子
(一)磷脂酰胆碱(PC )
PC 是白色蜡状物质,极易吸水,其不饱和脂肪酸能很快被氧化。人体组织、脏器中都含有相当多的PC ,在脑、肾上腺、红细胞和精液中含量尤其丰富。卵黄中高达8~10%。PC 中的胆碱是季胺,碱性极强,可与氢氧化钠相比。在生物界分布广泛, 在肝脏中,胆碱能通过合成PC 来调节脂肪代谢;在神经组织中,胆碱参与合成的乙酰胆碱是一种神经递质,与神经兴奋的传导有关;在甲基转换中胆碱可提供甲基。
(二)磷脂酰乙醇胺(PE )
是动植物中含量最为丰富的磷脂,与血液凝固有关,可能是凝血酶激活酶的辅基。 PE中X= CH2—CH2—NH3
(三)磷脂酰丝氨酸(PS )
又称丝氨酸磷脂。其基本结构与PC 、PE 相似,只是磷酸基团与丝氨酸的羟基以酯键相连。
(四)磷脂酰肌醇(PI )
肌醇:六碳环状糖醇。PI 常与PE 等混合在一起,心肌及肝中多是磷脂酰肌醇一磷酸,而脑中多为磷脂酰肌醇二、三磷酸。
(五)磷脂酰甘油(PG )
其中极性基团是一个甘油分子。结构式中X=CH2—CHOH —CH2OH ,细菌的细胞膜中常含有PG 的氨基酸衍生物(特别是L-赖氨酸)。赖氨酸与甘油的第三个羟基以酯键相连,这种含氨基酸的脂称为脂氨酸。
(六)二磷脂酰甘油(DPG )
又称心磷脂(cardiolipin) (CL),是由甘油的C1和C3与两分子磷脂酸结合而成。心磷脂是线粒体内膜和细菌膜的重要成分,而且是唯一具有抗原性的磷脂分子。CL 共有3个分子甘油,2个P 基团,4个脂肪酸基团。
(七)溶血磷脂
是甘油磷脂失去一个脂肪酸后的产物。 它是一个表面活性物质,能够使红细胞溶解;对进入肠道食物中
的脂质,它又是一个乳化剂。
溶血磷脂分为:溶血磷脂酰胆碱(LPC ) 溶血磷脂酰乙醇胺(LPE )
溶血磷脂酰丝氨酸(LPS ) 溶血磷脂酰肌醇(LPI )等
(八)缩醛磷脂
又称浆磷脂,与一般甘油磷脂的差别是: 甘油1位碳上是一个脂烯醚,脂烯醚的水解产物是脂肪醛,脂肪醛与甘油缩合称缩醛反应,其产物失水成脂烯醚,含有脂烯醚的磷脂称为缩醛磷脂。
缩醛磷脂在心脏和红细胞膜中含量较多,从红细胞膜中可分离出19种缩醛磷脂。在组织化学中,由于缩醛磷脂能游离出脂肪醛,因而可用无色品红显色。
(九)血小板活化因子
血小板活化因子与缩醛磷脂的不同在于甘油1位碳是饱和长链醇,第2位的脂酰基为最简单的乙酰基。
(十)甘油磷脂的性质
1、溶解度:甘油磷脂溶于含有少量水的多数非极性溶剂中。用氯仿/甲醇很容易将组织和细胞中的甘油磷脂萃取出来。甘油磷脂不溶于丙酮,根据这个特点可用丙酮把磷脂中的其它脂类溶解除掉。磷脂能与氯化镉结合,生成不溶于乙醇的复盐,PE 的氯化镉复盐不溶于乙醚,而PC 与SM 的氯化镉复盐能溶于乙醚。根据复盐溶解度 的差别,可以进一步纯化磷脂,也是鉴定磷脂的定性方法。脂溶性的磷脂在水中扩散成胶体,具有乳化性质
磷脂的溶解性质
磷脂种类 乙醚 乙醇 丙酮
磷脂酰胆碱 溶 溶 不溶
磷脂酰乙醇胺 溶 不溶 不溶
神经磷脂 不溶 溶于热乙醇 不溶
2、电荷和极性
甘油磷脂在pH=7时,磷酸基团带的是负电荷,而PC 、PE 的极性头部带正电荷,因此这两种化合物本身是既带正电荷又带负电荷的兼性离子。
3、氧化性质:
纯的甘油磷脂是白色蜡状固体,与空气接触迅速变成黄色,久成褐色。甘油中脂肪酸有棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸和花生四烯酸。分子中50%是不饱和脂肪酸,一般在甘油1位碳上为饱和脂肪酸,2位上为不饱和脂肪酸。PC 与空气接触后颜色的变化,是由于不饱和脂肪酸被氧化,形成过氧化物,进一步形成褐色过氧化物的聚合物所致。
二、神经磷脂类(SM )
神经磷脂又称鞘磷脂,是神经组织各种膜的主要结构脂类之一。神经磷脂的基本结构是以神经氨基醇(鞘氨醇)为核心取代甘油磷脂类的甘油核心。神经氨基醇是一系列碳链长度不同的不饱和氨基醇,最常见的神经氨基醇含有18个碳原子,在磷脂中常以酰胺即神经酰胺形式存在。神经磷脂的极性头是磷酰乙醇胺或磷酰胆碱。
三、磷脂的分布
脑组织磷脂含量最多,其中70%为 PC、PE ,肝含量为脑中的一半,脾含磷脂为8%。骨髓中几乎没有。患贫血病时,磷脂和游离脂肪酸及固醇量增加。动物骨髓中磷脂随增龄而减少。性腺内磷脂含量与分泌机能有关。卵巢黄体中含磷脂较多,睾丸的磷脂分布在间质细胞和生精细胞中。
皮肤粘膜的磷脂含量以表皮基层最多,向浅层逐渐减少,表皮磷脂含量为1.9%。肌肉磷脂含量以心肌最高,骨骼肌磷脂含量与其机能有关。
第二节 磷脂的合成
合成全过程可分为三个阶段,即原料来源、活化和甘油磷脂生成。甘油磷脂的合成在细胞质滑面内质网上进行,通过高尔基体加工,最后可被组织生物膜利用或成为脂蛋白分泌出细胞。机体各种组织 ( 除成熟红细胞外) 即可以进行磷脂合成。
甘油磷脂的合成
1. 合成部位
全身各组织细胞内质网,肝、肾、肠等组织最活跃。
2. 合成原料及辅因子
脂酸、甘油、磷酸盐、胆碱、丝氨酸、肌醇、ATP 、CTP
3. 原料来源
原料为磷脂酸与取代基团。磷脂酸可由糖和脂转变生成的甘油和脂肪酸生成(详见甘油三酯合成代谢) ,但其甘油C2位上的脂肪酸多为必需脂肪酸,需食物供给。取代基团中胆碱和乙醇胺可由丝氨酸在体内转变生成或食物供给。
丝氨酸 乙醇胺 胆碱
4. 活化
磷脂酸和取代基团(胆碱、胆胺等)在反应之前,两者首先被CTP 活化(被CDP 携带);胆碱与乙醇胺可生成CDP-胆碱和CDP-乙醇胺,磷脂酸可生成CDP-甘油二酯。
5. 甘油磷脂生成
(1)磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺
这两种磷脂生成是由活化的CDP-胆碱与CDP-乙醇胺和甘油二酯生成。此外PE 在肝脏还可与硫腺苷蛋氨酸(SAM 提供甲基)结合转变为PC 。
(2)磷脂酰丝氨酸
体内PS 合成是通过Ca++激活的酰基交换反应生成,由PE 与丝氨酸反应生成磷脂酰丝氨酸和乙醇胺。
磷脂酰乙醇胺+丝氨酸 磷脂酰丝氨酸+乙醇胺
(3)磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和心磷脂
上述三者生成是由活化的CDP-甘油二酯与相应取代基团反应生成。
甘油磷脂合成还有其他方式,如
磷脂酰胆碱由磷脂酰乙醇胺从S-腺苷甲硫氨酸获得甲基生成。
磷脂酰丝氨酸由磷脂酰乙醇胺羧化或其乙醇胺与丝氨酸交换生成。
6、缩醛磷脂与血小板活化因子的合成
合成过程与磷脂合成过程类似。
不同之处在于由磷酸二羟丙酮转变生成脂酰磷酸二羟丙酮后,由一分子长链脂肪醇取代其第一位脂酰基,再经还原(由NADPH 供H) 、转酰基等步骤 合成磷脂酸的衍生物(而不是磷脂酸)。此产物替代磷脂酸为起始物,沿甘油三酯途径合成
胆碱或乙醇胺缩醛磷脂。
血小板活化因子与缩醛磷脂的不同在于长链脂肪醇是饱和长链醇,第2位的脂酰基为最简单的乙酰基。
二、神经磷脂的合成
神经磷脂大量存在于脑与神经组织,是神经髓鞘的主要成分。神经磷脂是构成生物膜的重要磷脂,常与PC 并存细胞膜的外侧。神经髓鞘含脂类甚多,占干重的97%,其中PC 占11%,SM 占5%;人红细胞膜磷脂中约20%~30%为SM 。
以脂酰CoA 和丝氨酸为原料,消耗NADPH 生成二氢鞘氨醇,进而经脂肪酰转移酶作用生成神经酰胺。 鞘磷脂的合成
1. 鞘氨醇的合成
部位:全身各细胞内质网,脑组织最活跃
原料:软脂酰CoA 、丝氨酸、磷酸吡哆醛NADPH+H+及FADH2
2. 鞘脂的合成
第三节 磷脂的分解
生物体内存在能使磷脂水解的多种磷脂酶。如磷脂酶A1、A2、B1、B2、C 、D 及溶血磷脂酶、神经磷脂酶等。各磷脂酶的作用部位如下图:
磷脂酶A1:自然界分布广泛,主要存在于细胞的溶酶体内,此外蛇毒及某些微生物中亦有,可有催化甘油磷脂的第1位酯键断裂,产物为脂肪酸和溶血磷脂2。
磷脂酶A2:普遍存在于动物各组织细胞膜及线粒体膜,能使甘油磷脂分子中第2位酯键水解,产物为溶血磷脂1及脂肪酸。 Ca2+是此酶的激活剂。胰腺组织含有磷脂酶A2原和溶血磷脂酶。
磷脂酶C :存在于细胞膜及某些细胞中,特异水解甘油磷脂分子中第3位磷酸酯键,其结果是释放磷酸胆碱或磷酸乙醇胺,并余下分子中的其他组分。
磷脂酶D :主要存在于植物,动物脑组织中亦有,催化磷脂分子中磷酸与取代基团 (如胆碱) 间的酯键,释放出取代基团。溶血磷脂是一类具有较强表面活性的性质,能使红细胞及其他细胞膜破裂,引起溶血或
细胞坏死。当经磷脂酶B 作用脱去脂肪酸后,转变成甘油磷酸胆碱或甘油磷酸乙醇胺,即失去溶解细胞膜的作用。
鞘磷脂经神经磷脂酶作用,水解产生磷酸胆碱和神经酰胺。脑、肝、脾肾等细胞的溶酶体中含有此酶,如缺乏此酶可引起肝、脾肿大及神经障碍如痴呆等鞘磷脂沉积症。
二、神经鞘磷脂的降解
神经鞘磷脂分解为磷脂胆碱,N-脂酰鞘氨醇
脑、肝、肾、脾等细胞溶酶体中的 神经鞘磷脂酶 (属于PLC 类)
说明:
1、磷脂酶存在部位: 溶于胞浆或整合于膜系统上。
2、膜内的磷脂酶不能使膜内的磷脂水解,而能水解胞内的磷脂。
3、胞浆内的磷脂酶却能分解结合于膜上的磷脂 。
4、食物中的磷脂被消化液中各种磷脂酶水解后吸收。肠粘膜内有催化溶血磷脂分解或再酯化的酶。保护细胞膜。
第四节 磷脂分子的重组与更新
在磷脂酶A1、A2及酰基转移酶的作用下,组织中的甘油磷脂可以不断的进行脱酰基与再酰化,使分子中的酯酰基得以随时变换。使人体各组织迅速调整各种磷脂的含量和比例,以适应环境和生理情况的变化。 膜系上的磷脂还可以整个分子交换的方式进行更新,但不是主要方式。
各种组织的细胞膜磷脂可与血浆或组织间液中的磷脂进行交换,而细胞内的膜系如核膜、线粒体膜及内质网膜的磷脂,也能与血浆或组织间液中的磷脂进行交换。细胞内各种膜的磷脂还可以进行膜间的交换。
通常内质网膜的磷脂交换较快,线粒体膜的磷脂交换较慢;PC 交换快,PE 交换慢。线粒体的DPG 基本上不进行交换。
乙炔雌二醇能加速人红细胞中脂肪酸的更新,主要是能激活红细胞中PE 酰基转移酶的活性。在非红细胞系统中,雌激素能够调节PC 的活性。
在红细胞中存在内源性磷脂酶,该酶催化内源性磷脂释放出游离脂肪酸和溶血磷脂。游离脂肪酸返回到血浆中,而溶血磷脂可在原位立即被再酰化,或被磷脂酶B 水解。
人红细胞中约60~70%的PC 和不到30%的神经磷脂,及少量的PE 与血浆的同系物自由交换,但PS 不能交换。 总之,成熟红细胞膜中磷脂的更新主要靠两条途径:磷脂的整分子交换和脂肪酸往磷脂的掺入。前者主要更新红细胞膜外单层的磷脂,尤其是多不饱和酰磷脂;后者主要更新红细胞膜内单层的磷脂,尤其是二饱和酰磷脂。
第二章 磷脂的生物学作用
第一节 生物膜脂质组成与结构
细胞膜又称质膜。质膜、细胞器膜和核膜统称为生物膜。膜厚约75~100Å,生物膜不仅是细胞的外被,还是生命三要素(生物能量交换、生物物质交换、生物信息的形成)不可缺少的结构。
一、膜脂质双层结构
1925年提出膜是由磷脂分子组成的双分子层,极性头排在外,疏水尾在内。 细胞膜质成分:磷脂、糖脂、胆固醇。外层主要是PC 和SM 。内层多为PE 和PS ,这表现膜质分布的不对称性。PE 、PS 有促血凝作用,一旦翻转于外部则可促凝血。与细胞识别有关的糖脂全部分布于外层,有利于提高细胞对外敏感性。磷脂在脂双层两侧分布的不对称性与其生理功能有关。如膜的流动性、通透性对酶活性的支持等,甚至细胞膜的柔韧性都是由磷脂双层的组分不同来决定的。
二、膜脂质的流动性
膜的流动性是指膜内部脂类和蛋白质两类分子的运动性。在生理状态下,细胞膜既不是固态也不是液态而是液晶态。它们即有液态分子的流动性,又有固态分子的有序排列。当温度降到某一点时,膜可由液晶转为晶态;当温度升高时晶态再熔为液晶态,这种变化叫相变。引起相变的这个温度叫相变温度
影响脂质流动性的因素:
磷脂所含脂肪酸不同,膜流动性不同。含不饱和脂肪酸多相变温度低;脂肪酸链越短相变温度越低。相变温度高膜流动性小。当有钙离子、镁离子存在时,相变温度升高。胆固醇可降低饱和磷脂的相变温度,而增高不饱和磷脂的相变温度, 故认为胆固醇在膜内有双向调节膜流动性的作用。
生物膜的流动性使膜中蛋白质的适应功能发生变化,从而改变其分布与构型,这成为维持细胞功能的重要条件。
细胞吞噬与胞饮作用,神经突触释放递质以及细胞分裂与融合等都与膜流动性有关。细胞膜的Na+-K+-ATP酶需膜磷脂处于流动相时,才表现出充分的活性,可见膜的流动性与膜酶的活性密切相关。生物膜的流动性是膜生物学功能所必须的
三、脂质双层中磷脂的运动
膜脂分子的运动在相变温度以上的情况下(在液态时),膜脂的运动可归纳为:
1、横向扩散运动:沿膜平面横向移动交换位置。
2、旋转运动:膜脂分子围绕与膜平面垂直的轴进行快速旋转。
3、摆动运动:膜脂分子围绕与膜平面垂直的轴进行左右摆动。
4、伸缩振荡运动:膜脂的脂肪酸链沿与膜平面垂直的长轴伸缩振荡。
5、脂肪酸链的旋转异构运动:膜脂分子中脂肪酸的C-H 链做旋转运动。
6、翻转运动:膜脂分子从脂双层的一层翻转到另一层的运动,速度慢,极少发生。
第二节 磷脂与膜酶的相互作用
膜上整合酶的活性与磷脂关系密切。若用有机溶剂除去磷脂(用特异磷脂酶破坏磷脂)可使此类酶活性下降或完全丧失。
膜磷脂与膜酶的相互作用有以下一些特点:
1、大多数能被磷脂激活的酶在天然状态下是膜酶,但并不是所有膜酶都需要磷脂来激活。
2、一个酶去磷脂后用不同的磷脂来重激活,激活程度不同,激活所需的磷脂最适浓度也不同,酶对磷脂表现出高度的专一性。如:β -羟丁酸脱氢酶对PC 高度专一,而NADH 脱氢酶主要与DPG 结合。
3、同一生物膜上不同的酶对磷脂有不同的专一性,如牛心线粒体膜上的细胞色素氧化酶由DPG 来激活,而琥珀酸脱氢酶由磷脂激活。
4、膜中的脂质与 膜酶蛋白的相互作用 是非共价相互作用(可逆) 。
5、磷脂激活酶的活化能一般为20~40千卡/克分子,比一般水溶性酶(10~20千卡/克分子)大。
6、磷脂对激活酶的作用在于:
⑴调节酶与底物、抑制剂、辅助因子的结合。
⑵调节膜蛋白质的变构。
⑶改变膜酶的活化能
⑷增加膜蛋白质的稳定性。
⑸调节膜蛋白之间的相互作用。
⑹磷脂在蛋白质(酶)的远距离相互作用中起作用(媒介作用)。
第三节 心磷脂与线粒体
每一种生物膜都有其特殊的磷脂成分谱。除了以酶作为一种生物膜的标志外,某些磷脂也可作为特定生物膜的表线粒体内膜呼吸链上的NADH 脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的活性与磷脂和CoQ10均有密切关系。用磷脂酶处理上述酶则酶失活,添加磷脂与CoQ10
内 外
厚 50~70 Å 50~70 Å
形状 皱褶 伸展
表面 光滑 偶有突起
用丙酮提出磷脂 双层结构存在 双层结构破坏
通透性 分子量150以下通过 分子量1万以下通过
磷脂/蛋白 0.27 0.82
心磷脂 高 低
PC 低 高
胆固醇 低 高
CoQ10 有 无
二、CL 与其分布
CL 主要分布在线粒体,是构成线粒体的主要磷脂,占总磷脂的20%,此外其它膜中含少量CL 。线粒体内膜CL 占25%,外膜3%,CL 是线粒体内膜的特征性磷脂。线粒体膜的CL 中约90%是不饱和脂肪酸,其中亚油酸占59%。
三、CL 与线粒体内膜的流动性
磷脂中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值越高,膜的流动性越大。CL 能使线粒体内膜的流动性增大。
四、CL 与线粒体内膜蛋白的相互作用
在线粒体内膜上细胞色素氧化酶的周围的单层“界面脂”是由CL 、PC 和PE 等组成的。去磷脂后细胞色素氧化酶的活性消失,补充PC 仅恢复5~10%活性,再加入CL 则活性全部恢复。
第四节、肌醇脂质信使系统
肌醇脂质在细胞跨膜信号传递中起重要作用,这是受体学说的新突破。这一系统是环核苷酸以外的新的信使系统。多种激动剂包括激素、神经递质、生长因子等是通过肌醇脂质信使系统发挥作用的。
一、肌醇磷脂与肌醇磷脂酸
肌醇脂质包括:肌醇磷脂与肌醇磷酸脂。
肌醇磷酸酯是肌醇和磷酸形成的酯类。
细胞中主要有:肌醇-1-磷酸(IP )
肌醇-1, 4二磷酸(IP2)
肌醇-1,4,5三磷酸(IP3)
肌醇-1,3,4三磷酸(IP3)
1、 PI主要存在于细胞质膜的内侧, 约占总磷脂的5~10%,部分存在于内质网。在肝和心肌中多含PI ,而脑中神经元和胶质细胞膜上为多磷酸肌醇磷脂。
2、肌醇磷酸酯主要存在于细胞质中,且含量极少。肌醇磷酸酯溶于水,具有旋光性和红外吸收性,常用阴离子交换树脂柱层析法,高压电泳法或高效液相色谱法等分离。
二、肌醇磷脂循环
包括肌醇磷脂的合成、分解及第二信使的产生和降解。
磷脂酰肌醇合成后磷酸化生成磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2),后者在磷脂酶C 作用下水解为甘油二酯(DG )和肌醇三磷酸(IP3),DG 和IP3经一系列反应再合成PI ,以上形成的循环称为肌醇磷脂循环。
DG 的降解途径
DG 是细胞内的第二信使,在胞质中磷脂酶A2作用下,第二C 位上的花生四烯酸释放,用于前列腺素、白三烯、血栓素的合成。
DG和IP3是第二信使,它们的产生依赖于肌醇磷脂循环,故此循环在肌醇脂质信使系统的信号传递中起重要作用。
有人发现Li+抑制肌醇磷脂的循环,从而解释Li+(碳酸锂)的抗精神病作用机理。
三、肌醇脂质信使系统
多种激素作用于靶细胞膜上特异的受体后,通过特定的G 蛋白激活对磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C ,后者作用于PIP2,使之产生IP3和DG 。IP3可使细胞内钙离子浓度升高;DG 在细胞膜上激活蛋白激酶C (PKC ),使靶蛋白磷酸化而产生效应。如腺体分泌,肌肉的收缩血小板聚集,中性粒细胞活化及细胞生长、代谢、分化和肿瘤的生长等效应。IP3也能促进细胞内钙池释放Ca2+,也有重要的生理意义。
1、IP3的第二信使作用
IP3与钙通道上的受体结合,将钙离子储存库中的钙离子释放到细胞质。IP2进一步代谢为IP4(肌醇-1,3,4,5-四磷酸) ,它作用于细胞膜,引起细胞外的钙离子流入细胞内,使得钙库中的钙离子浓度维持高水平。
2、DG 和蛋白激酶C 的激活
1979年发现PIP2分解产物之一的DG 可以激活依赖钙离子的蛋白质磷酸化酶(C激酶,PKC) 。C 激酶在微量的钙离子介导下,与细胞膜的磷脂酰丝氨酸(PS)结合,形成钙离子-PS -酶复合物。DG 结合在这个复合物上就明显地增加了PKC 的活性。所以DG 和钙离子作为第二信使起作用。最近又提出一个在细胞应答时必需维持一定量DG 的机制。
作为第二信使的DG 主要功能是激活PKC ,可使对PI 专一的磷脂酶C 和磷脂酶A2活化,并降低细胞膜的流动性等。
PKC至少有12种,被PKC 磷酸化的底物有细胞膜受体、细胞骨架蛋白、酶和核蛋白质等。PKC 对机体的代谢、基因表达和细胞分化增殖等起调节作用。PKC 通过对靶蛋白的磷酸化而改变功能蛋白的活性和性质,启动一系列生理生化反应。
四、肌醇磷脂与血小板活化
血小板内含大量的磷脂酶C ,当凝血酶激活时,可活化磷脂酶C ,使血小板中的PI P2水解为DG 和IP3,IP3使PKC 活化,使血小板内膜的蛋白质磷酸化,,而激活血小板释放5-HT ,使血小板收缩聚集。
五、肌醇磷脂与中性粒细胞的氧化爆发
中性粒细胞寿命短,活跃,它有许多功能:趋向性、粘附、聚集、吞噬,脱颗粒和氧化爆发等。肌醇磷脂参与这些功能的完成。
六、肌醇磷脂与细胞增殖及癌变
一些癌基因可能通过编码一些促进肌醇磷脂代谢的蛋白质,从而干扰肌醇脂质信使系统而发挥致癌作用。许多有丝分裂的信号如:神经介质、激素、受精及各种生长因子等触发细胞增殖。细胞外的信号如何把信息从细胞表面有条不紊地传递到细胞核,研究表明与肌醇信使系统密切相关。
第三章 磷脂与疾病
第一节 红细胞磷脂含量及其测定方法
一、脂质的萃取方法:
1.样品的处理:红细胞、血浆、软骨和组织脏器等的处理。
2.样品中全脂质的萃取:氯仿:甲醇=1:1。
3.萃洗、浓缩。
二、总脂质的比色测定法:微量和半微量法。
三.总磷脂的测定方法:
每个磷脂分子中都含有一个磷酸根,可以根据磷的测定来代表磷脂含量。
1.硫氰亚铁铵比色法:原理 红色硫氰亚铁铵化合物不溶于氯仿,但与磷脂形成的复合物可溶于氯仿,按磷脂与硫氰亚铁铵(氯化铁和硫氰酸桉)形成的复合物颜色深浅进行比色。
2.消化法:原理 磷脂经过氯酸消化,使磷从磷脂中分离出来,加入钼酸桉试剂使磷结合成磷钼酸,再与抗坏血酸还原为钼蓝,以测定磷含量,由测得的磷换算成磷脂的含量。
3.酶法:原理 磷脂酶中磷脂酶D 水解作用的特异性不高,它能水解磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱与神经磷脂,但此三者占血清总磷脂得95%左右,故可用磷脂酶D 水解,测定释放出的胆碱,后者的测定如下:
胆碱氧化酶
胆碱 + 2O2 + H2O ———————— 甜菜碱 + 2H2O
过氧化物酶
2H 2O 2 + 4-氨基安替比林 + 酚 —————— 红色醌亚胺染料
四、磷脂组成薄层色谱分析
1.制作硅胶板 2.点样 3.展开
4.显色 5.磷脂的定量:
(1)薄层色谱扫描
(2)洗脱定量
第二节 冠心病(冠状动脉粥样硬化性心脏病)
一、冠心病人细胞膜的改变
RBC膜是细胞膜的窗口,红细胞膜总磷脂下降是冠心病临床生化的重要指标。此患者细胞膜胆固醇/磷脂升高,SM /PC 升高。
二、磷脂防治动脉粥样硬化的作用
磷脂作为膜结构的成分,补充磷脂可嵌入细胞膜,从而使生物膜的流动性增强,促进粥样硬化斑的消散。用PC0.125g /kg 治冠心病人, 可使血脂降低。
三、控制磷脂代谢对心肌细胞膜的影响
用低磷脂和高磷脂喂豚鼠,3个月后心肌胆固醇/磷脂及SM/PC均降低,而心肌细胞色素氧化酶活性升高。高磷脂组上述变化明显,故预防和治疗动脉粥样硬化,应给老年人多补充磷脂。
第三节 肺泡表面活性物质缺乏病
1929年发现肺内表面活性物质来源于肺泡上皮的分泌型细胞。 二软脂酰胆碱由Ⅱ型肺泡上皮细胞合成,可降低肺泡表面张力。
一、肺表面活性物质缺乏病
1、新生儿呼吸窘迫综合症(NRDS )
病理上 称肺透明膜病(HMD ),以肺泡及细支气管壁上附嗜伊红透明膜为特征。
Ⅱ型肺泡细胞分泌肺表面活性物质,此物降低肺泡表面张力,主要成分是磷脂(约86%),磷脂中的 77.8%是PC (二软脂酰PC ), 又称饱和磷脂。
肺泡合成PC 有两条途径:由磷酸胆碱移换酶和甲基移换酶催化。第一途径合成的活性强,但在胎龄32W 后才合成,第二途径在胎龄22-24W 即可检出。只是活性不强。故早产儿易患NRDS 。可产前诊断:测羊水中饱和PC 含量。
2、成人呼吸窘迫综合症
在某些疾病过程中(烧伤、创伤、感染) 出现,是以进行性缺氧和呼吸困难为特征的急性呼吸衰竭综合症。肺泡表面活性物质降低与病因有关。
3、神经原性肺水肿
起因交感神经改变了全身及肺循环的 血流状态。如脑外伤后出现的肺水肿,是因交感神经兴奋使大量无活性的肺表面活性物质分泌出来所致。
4、矽肺 实验性矽肺的大鼠肺组织中,PC 、PG 及表面活性物质中饱和PC 含量显著增高。
二、影响肺表面活性物质分泌的因素
(一)植物性神经系统对表面活性物质分泌的影响
1、交感神经和α受体激动剂的作用
交感神经兴奋和α受体激动剂可使肺表面活性物质分泌降低。
2、β受体激动剂及其拮抗剂的作用
β受体激动剂可增加肺泡表面活性物质的分泌。其拮抗剂如Ad 、异丙肾上腺素、心得安可对抗作用。
3、副交感神经和M 受体激动剂的作用
电刺激兔颈迷走神经2h ,肺灌洗液中磷脂含量增加31%。
(一)环核苷酸和前列腺素(PG )对肺表面活性物质分泌的影响
1、cAMP 可增加肺表面活性物质的释放
2、PGE2增加新生兔灌洗液中PC 的释放。而消炎痛则抑制释放。
(二)某些化学物质对表面活性物质的释放
KCI 促饱和PC 释放,阿托品和心得安拮抗。
微丝破坏剂细胞松弛素B 和微管破坏剂秋水仙素、长春花碱可减少表面活性物质释放。
三、肺表面活性物质替代疗法
1964年外源性二软脂酰PC 制成气雾剂,疗效不定。1980年用牛肺中提出的表面活性物质加磷脂制成气雾剂,治疗NRDS 获成功。
目前国际临床用替代疗法有三种:
1、人工合成的肺表面活性物质。
2、天然表面活性物质(牛、猪或人羊水提取)
3、人工合成加天然肺表面活性物质。发现天然制剂优于人工合成,可能是天然制剂中存在非血原性小分子蛋白,对磷脂的摄取、分泌、吸收能力等有促进作用。
第四节 磷脂酶A 与急性胰腺炎
一、磷脂酶A 性质
磷脂酶A (PLA )包括A1和A2。
A1性质不稳定,主要在动物脑组织中。
A2主要在胰腺和蛇毒中。A2在胰腺中以酶原的形式存在。PLA2水解细胞膜上的PC 产生溶血PC ,破坏组织细胞致坏死。毒蛇咬伤后的中毒症状,如肺出血、心室纤颤、强直收缩及呼吸抑制等都与PLA2作用有关。
二、 PLA2与胰腺炎的关系
1882年确立胰腺炎发病机制的自身消化学说,1960年发现急性胰腺炎组织的坏死是由PLA2引起。动物实验证实PLA2注射后短时引起严重的出血坏死性胰腺炎。急性胰腺炎病人胰腺组织中PC 降低,溶血PC 升高,血及门静脉血液中PLA2升高。
三、PLA2与胰腺炎时多发脏器衰竭的关系
急性胰腺炎时胰腺PLA2溢出到肝、肾、肺、脑、心,引发多脏器衰竭。
四、 PLA2抑制剂
已发现30多种抑制PLA2活性的物质,如CaNa-EDTA ,尚未发现内源性PLA2活性抑制剂。
五、 PLA2测定方法
1、荧光法 2、溶血法 3、PC 法 4、蛋黄法
第五节 大骨节病
大骨节病原因不明主要侵犯运动系统的地方性骨关节病,病人的代谢改变:
1、低硒所致血液谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px )活性降低;
2、血液及红细胞一些酶活性改变(CK 、γ-GT 、LDH 、GOT );
3、RBC 膜结构功能改变,患儿RBC 膜磷脂减少,以PC 减少为主,SM 升高,膜流动性降低,红细胞出现靶状、棘状、口状;
4、软骨病变的分子生物学特征:患儿骨骺及关节软骨DNA 量低于正常儿,且软骨中PC 降低。
第六节 克山病
以心肌坏死,心肌线粒体损害为主要特征的地方性心肌病。
1、克山病磷脂代谢障碍:病人红细胞膜及心肌总磷脂量减少,以PC 降低为主;
2、心磷脂与克山病的发病机制:患者膜结构和功能障碍主要是膜磷脂代谢障碍,尤其心肌线粒体脂质组成异常,心磷脂缺乏,细胞色素氧化酶活性显著降低。
现已确定克山病发病的三个基本环节:
1)、作为心肌线粒体膜本身必要的组分磷脂,尤其心磷脂的减少是发病的“结构性因素”。
2)、引发组织氧化损伤的氧自由基所谓“伤害性因素”的增加。
3)、在体内发挥抗氧化作用的硒、VE 、VC 等“保护性因素”的缺乏。
第七节 血栓形成
一 、血小板在血栓形成中的作用
磷脂占血小板全部脂质的76%,当血小板受ADP 、胶原等刺激后,其浆膜内侧面磷脂中含的血小板第3因子可翻转到膜外侧,为凝血提供相互结合的表面,促进凝血因子Ⅹ的活化,促进血液凝固。
二、RBC 膜与血栓形成的关系
当RBC 膜内层的PS 暴露在外时,RBC 有较强的促凝血作用;RBC 膜老化时,RBC 变形能力降低,易发血液淤滞与堵塞。
第八节 磷脂与皮肤病
一、伤口愈合中磷脂的作用
伤口涂磷脂的细胞间隙中组织液增多,细胞发育旺盛,愈合时间可缩短。
二、磷脂对毛发生长的作用
兔子涂磷脂能促毛生长;PI 有治疗脱发的作用。
三、磷脂对几种皮肤病的作用
1、脚癣:霉菌引起,涂磷脂3周后,脱皮痊愈。
2、牛皮癣:口服磷脂40g/日,同时低脂肪饮食,60%有效,停药复发。
3、脱发症、皮肤癌:PI 治脱发,PC 治褥疮及皮肤干裂,用10%的PC 肌注治棘细胞上皮癌。
四、磷脂抗衰老
口服磷脂可从细胞本身达到抗衰老;磷脂制成化妆品外敷有抗皮肤衰老的功能。
第九节 胆结石
胆汁中PC 占固体成分的25-30%。胆固醇在胆汁中保持溶解状态(分散)是由于它和胆盐、PC 形成微胶粒存在。PC 可使胆盐溶解胆固醇的能力增强。如PC 降低,胆固醇易析出沉淀形成结石,胆固醇结石的预防:适量限制饱和脂肪酸的摄入,避免不饱和脂肪酸的缺乏。口服PC 可防治胆固醇结石。
第十节 肝脏病
一、肝脏疾病磷脂的构成改变
脂肪肝病人肝中PC 升高,PE 降低。RBC 膜流动性降低。;急性肝炎病人血清HDL 中的磷脂降低。
二、磷脂对肝硬化的防治
第十一节 糖尿病
一、糖尿病人RBC 膜组分的改变,RBC 变形能力降低,膜流动性降低,膜Ch/磷脂升高。
二、磷脂在糖尿病中的应用
实验证明:磷脂能加强和延长胰岛素降低血糖的效应。
第十二节 神经系统疾病
一、磷脂对神经组织的作用
动物补充磷脂后神经细胞体积增大,纤维和轴突横经加粗,小剂量磷脂提高闹的兴奋性。
二、磷脂对老年性痴呆的作用
老年痴呆患者大脑皮层广泛分布老年斑和全脑萎缩。此病与脑磷脂的过氧化有关。口服磷脂症状改善。
三、 磷脂对其它神经系统疾病的作用
磷脂还可治疗神经衰弱的病人。
第十三节 血液疾病
小剂量磷脂刺激造血,再障、地中海贫血、遗传性球状RBC 病摄入一定量的磷脂协助改善症状。
第十四节 碘缺乏病
动物实验发现:T3、T4不足可造成大脑磷脂分子组成紊乱。说明,T3、T4不足可能通过脑磷脂组成改变影响脑细胞膜结构、功能、受体、酶活性及细胞心系信息传递,导致不同程度的CNS 损伤和发育落后。
第四章 磷脂的过氧化及抗氧化体系
第一节 脂质过氧化作用(LPO )
一、 脂质过氧化的产生
LPO是指多不饱和脂肪酸(PUFA )中发生的一系列自由基反应,形成脂质过氧化物(LOOD ), 后者的分解产物能引起细胞成分的损伤,导致细胞功能和结构的改变。
胞膜和亚细胞器膜是脂质过氧化损伤的主要部位。后者对过氧化更敏感。
二、自由基的概念、种类、产生与清除
自由基学说是1956年由Harman 提出的。
自由基是指含有未配对电子的原子、分子和原子团或离子。
体内常见的自由基有:
超氧阴离子自由基 氢自由基 有机过氧自由基 过氧化脂质自由基 羟自由基 有机自由基 脂质自由基 单线态氧 过氧化羟自由基 烷氧基自由基 氧化脂质自由基
自由基产生部位:线粒体、内质网、胞浆、浆膜等。
自由基性质:极不稳定,非常活泼,一旦产生就立即和其它物质进行反应。半衰期极短,平均10-3秒,浓度低。
自由基的形成:
是由于某些原因使分子中的共价键断裂后,共享的电子对分属于两个原子或原子团: A-B→A ·+B·,从而产生含奇数电子的离子。
自由基产生因素:
单电子氧化还原反应、高能辐射及光分解(主要是紫外线)等原因引起。空气中的氧化性污染物,例如:O3、NO2和NO 等也能在体内引起自由基反应。
体内一些酶促反应:
例如黄嘌呤氧化酶、二氢乳清酸脱氢酶等某些需氧脱氢酶所催化的反应中能产生自由基的中间产物。 自由基有两个特性:
1、非常活泼又称瞬时中间体。
2、连锁反应,分为三个阶段:引发阶段,蔓延阶段,终止阶段。
引发阶段:连锁反应第一阶段,产生最初的自由基。
蔓延阶段:自由基一旦产生立即和周围物质进行反应,本身消失产生新的自由基。
终止阶段:两个自由基进行反应生成稳定的化合物,分为偶联终止和歧化终止反应两类。前者在体内占重要地位。
人体依靠某些酶和抗氧化物质来清除自由基。它们有自身组织含有的, 有从食物摄入体内的。 抗自由基的物质有:
超氧化物岐化酶(SOD )、胆红素、过氧化氢酶、辅酶Q10、半胱氨酸、谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶、组氨酸、巯基基团、牛磺酸等;饮食中的抗氧化物质有:花红素、维生素C 、β-胡萝卜素、生物黄酮类、姜黄色素、甘露醇、蛋氨酸、植物酚酸、多酚类、维生素E 、硒、锌及合成的抗氧化物质如二叔丁对甲酚(bht )、叔丁对甲氧酚(bha )等等。
三、脂质过氧化对细胞的损伤
脂质过氧化对细胞膜的结构和功能产生严重损伤,影响膜的功能:
1、自由基与膜上的酶和/或受体共价结合,改变膜组分的活性。
2、可共价结合膜组成成分,改变膜结构和/或抗原性。
3、使巯基氧化,不饱和脂肪酸与蛋白质比率改变,造成膜运输过程紊乱。
4、脂质不饱和脂肪酸的过氧化直接影响膜结构,以及有关的过氧化产物影响膜的流动性、交联、结构和功能,使膜脆性增加。
四、脂质过氧化与衰老
近来关于衰老的理论大体上分两类:一类认为衰老是按预定的遗传程序进行的,衰老可为特异的“衰老”基因所表达,或为可用基因的最终耗竭。另一理论认为,衰老是无计划的、随机发生的一系列紊乱所引起。 衰老是细胞器的进行性和积累性毁坏,或是大分子信息的误差,导致产生不正常的大分子的结果。细胞的老化是机体衰老的基础。
衰老过程分为生理和病理变化两类。
二者难以区分,生理衰老现象以疾病的形式表现,而许多疾病又促进生理衰老的进程。LPO 既是细胞膜衰
老的诱因,也是细胞老化的结果。
膜脂质总量的相对增加与类脂成分改变可作为细胞分化和老化的指标。
处于不同发育阶段的膜脂类含量是不同的,随着增龄,膜胆固醇量增加。SM 增多,而PC 、PE 量大大降低。
膜胆固醇/磷脂(CH/PL);SM/PC;饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸(SFA/PUFA)在老化时升高。
结果使膜的脆性增加,K+通透性增加,导致细胞内酶活性特别是依赖DNA 的RNA 聚合酶活性受抑制,蛋白
质的合成下降,引起细胞老化。
但自由基不足也引起机体一系列变化:
1、机体吞噬细菌的能力降低。
2、机体解毒作用受损。
3、胶原蛋白的合成受损。
4、前列腺素合成功能受损。
5、凝血功能受阻。
6、过高的SOD 易引起精神错乱。
第二节 机体的抗脂质过氧化系统
机体的抗氧化系统包括:抗氧化酶和抗氧化剂。
1. 抗氧化酶系:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px )、 谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽硫转移酶、过氧化氢酶及单胺氧化酶、亚铁氧化酶等。
2. 抗氧化剂:VitE 、VitC 、Se 、含巯基化合物(GSH 、半胱氨酸)等。
一、SOD 的种类和分布
SOD 是一种金属酶, 迄今发现有三种不同的类型, 各含不同的辅基:
1、含Cu 、Zn-SOD ,呈蓝绿色,主要在真核细胞胞质中。
2、含Mn ,称锰SOD ,呈紫红色,主要在真核细胞线粒体及原核生物。(红细胞无)
3、含Fe ,称Fe-SOD ,呈黄褐色,主要存在于原核生物细胞中。肝脏中活性均较高。
由于SOD 能清除·O2ˉ,所以在防御氧的毒性,防御肿瘤和炎症,预防衰老等方面起重要作用。
二、SOD 的开发
SOD 在自然界广泛分布,目前已从细菌、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物体内分离纯化出来。
1、以动物血为原料(家畜、家禽)提取Cu 、Zn-SOD 。
2、以动物组织为原料(肝、肾、心、肺)提取 Cu、Zn-SOD 和Mn-SOD 。
3、以微生物为原料(噬热菌、酵母和E Coil)提取Fe-SOD 和Mn-SOD 。
三、SOD 的临床应用
1、治疗急性炎症 9、治疗皮肤病(对皮肤色素沉着有强烈抑制作用)
2、治疗缺血性脑病 10、治疗骨髓损伤
3、治疗缺血性心脏病 11、治疗骨关节炎
4、延缓老年性白内障 12、与放疗联合治疗癌症
5、治疗自身免疫病 13、消除肌肉疲劳
6、防治氧中毒 14、消除乙醇中毒
7、治疗休克 15、治疗口腔疾病等
8、手术方面的应用(器官移植、整形、 血管吻合术)
SOD 的剂型:
1、食品添加剂 2、口服剂 3、气雾剂 4、注射剂
5、保养液 6、牙膏或其它膏剂 7、化妆品
四、SOD 与衰老
SOD 在某些器官中有明显的增龄变化。故认为SOD 的活性与动物种属的寿限有关。许多中药也对SOD 有影
响。
五、SOD 分析方法
1、邻笨三酚自氧化测定法 4、血清Mn 、Cu 、Zn-SOD 活力的测定
2、肾上腺素自氧化测定法 5、极谱氧电极法
3、四氮唑蓝比色法
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px ,含Se ) 是细胞内抗氧化防御体系的主要成员之一。
作用如下: GSH-Px
2GSH+H2O 2 —————— GSSG + 2H2O
GSH-Px
2GSH+LOOH ——————————GSSG +LOH+ 2H2O
GSH-Px 清除H 2O 2和LOOH 等。机体各组织分布不同,肝、红细胞含量高,亚细胞器分布:胞液和线粒体基质中。 过氧化氢酶(Cat )又称触酶 是一类以铁卟啉为辅基的结合酶。肝、肾活性高。
Cat
2H2O 2 ———— 2H2+O2
Cat
ROOH+AH2 ———————— H2O +ROH+A
单胺氧化酶(MAO )是含Fe2+、Cu2+和磷脂的结合酶。
亚铁氧化酶是含铜的糖蛋白,纯品呈蓝色又称铜蓝蛋白。
第五章 大豆磷脂的制备与应用
磷脂能维持机体细胞的健康生长,抗衰老等作用,已引起科学工作者的兴趣。磷脂的开发涉及多学科领域。
芝麻、大豆及蛋黄中磷脂含量高,因大豆磷脂的生成是利用豆油制备的副产品,故大豆是目前提取磷脂的主要原料。
磷脂的应用:
一、医药
1、作为脂质体的载体
2、制成粉、膏剂和营养液用于临床,治疗神经衰弱、动脉硬化、高脂血症、冠心病等。还作为细胞免疫功能
增强剂,防治脂肪肝、肝硬化、调节血糖、延缓老年型痴呆的发生等。
二、食品
作为食品添加剂,除提高食品的营养外,同时还有乳化、湿润、防淀粉老化及粉末制品飞散等作用。在制作糖果、巧克力、冰淇淋、人造奶油、方便食品、脱水食品、意大利面条、果酱等都起一定作用。
三、其它工业
1、饲料(乳化、润湿、分散及表面活性剂作用)
2、肥皂(改善香皂结构,提高储藏稳定性)
3、化妆品(乳化、降低表面张力保护皮
肤、加强皮肤活化,调整皮肤pH 、防干燥)
4、农药、纺织品等。
第五章、蛋白质的定量测定
常用方法:
1. 微量凯氏定氮法 5. 胶体金法
2.Folin-酚试剂法 (Lowry) 6.BCA(bicinchnimic acid)
3. 考马氏亮蓝G-250染色法 7. 紫外分光光度法
4. 双缩脲法
按蛋白质的性质不同建立的测定方法:
物理性质: 紫外分光光度法
化学性质: 凯氏定氮法 、双缩脲法、 Lowry法、BCA 法 、胶体金法。
染色性质: 考马氏亮蓝染色法、银染法
其它性质:荧光法
常用的测定蛋白质含量方法的比较
方法 测定范围(ul/ml) 蛋白的差异 最大吸收波长(nm)
凯氏定氮法 小
紫外分光光度法 100-1000 大 280
双缩脲法 1000-10000 小 540
Folin-酚试剂法 20-500 大 750
考马氏亮蓝G-250 50-500 大 595
BCA 50-500 大 562
胶体金法 1-10 大 595
方 法 特 点
凯氏定氮法: 标准方法, 准确, 操作麻烦, 费时, 灵敏度低, 适用于标准的测定. 紫外分光光度法 : 灵敏, 快速, 不消耗样品, 核酸类物质有影响.
缩脲法 : 重复性, 线性关系好, 灵敏度低, 测定范围窄, 样品需要量大.
Folin-酚试剂法 :灵敏, 费时较长, 干扰物质多.
考马氏亮蓝G-250 :灵敏度高, 简单, 误差较大, 颜色会转移 .
BCA :灵敏度高, 稳定, 干扰因素少, 费时较长 .
胶体金法 : 灵敏度极高, 稳定, 操作简单, 干扰物影响较大.
各种方法分析:
1. 凯氏定氮法结果最精确, 但操作复杂。不适合大量样品的测定。原理:用封闭的凯氏定氮器测定蛋白质中
的含氮量,从而得出蛋白质的含量。
2. 紫外分光光度法:柱色谱分析中要求随时快速检测蛋白质分离情况,但不要求精确多用此法。
原理:待测蛋白质溶液适当稀释K 倍,分别在280nm 和260nm 波长光下测吸光度值A280和A260。
3. 双缩脲法测定范围窄,样品需要量大,科研上受到限制。
4. 酚试剂法干扰因素多。
5. 考马氏亮蓝法、胶体金法和BCA 法用的多。
胶体金法多用于微量蛋白的测定。
胶体金比色法 :胶体金是一种带负电荷的疏水性胶体,加入蛋白质后,红色的胶体金溶液转变为蓝色,其颜色的改变与加入的蛋白质量有定量关系。在595nm 处测定样品的吸收值。
BCA是对一价铜离子敏感、稳定和高特异活性的试剂。在碱性条件下,蛋白质将二价铜还原为一价,后者与BCA 形成紫色化合物,在562nm 处具有最大光吸收,其吸收值与蛋白质浓度成正比。灵敏度高,检测浓度下限达到25微克/毫升,最小检测蛋白量达到0.5微克,待测样品体积为1-20微升。 在50-2000微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。可以兼容样品中高达5%的SDS ,5%的Triton X-100,5%的Tween 20, 60, 80。
各种物质的染色方法
经醋酸纤维、琼脂糖、聚丙烯酰胺电泳分离的各种生物分子需用染色法使其在支持物相应位置上显出色谱带,从而检测其纯度、含量及生物活性。蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸及酶等均有不同的染色方法。
一、蛋白质的染色
染色液的种类繁多,各种染色液染色原理不同,灵敏度各异。使用时可根据需要加以选择。常有的染色液
有:
1. 氨基黑10B 分子式为:C 22H 13N 6S 3Na 3 MW=715 , λmax=620-630nm,是酸性染料。染不同的蛋白质时,着色度不同。
2、考马斯亮蓝R250(CBBR250)分子式为: C14H 44O 7H 3Na MW=824 , λmax=560-590nm,染色灵敏度比氨基黑高5倍。该染料是通过范德华键与蛋白质结合,尤其使用于SDS 电泳微量蛋白质的染色,但蛋白质的浓度超过一定范围时,蛋白质浓度与光密度不成正比。
3、考马斯亮蓝G250(CBBG250)比CBBR250多二个甲基。 MW=854 , λmax=590— 610nm,染色灵敏度比氨基黑高35倍。其优点是在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择性地使蛋白质染色,而几乎无本底色,常用于重复性好和稳定的染色,适用于定量分析 。
4、固绿(FCF ) 分子式为: C37H 31N 2O 10S 3Na 2 MW=808,λmax=625nm,酸性染料,染色灵敏度不如CBB 。近似于氨基黑,但可克服CBB 在脱色时易溶解出来的缺点。
5 、荧光染料
(1)丹磺酰氯(DNS-CI )在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质的末端氨基发生反应,使它们获得荧光性质,可在波长320nm 或280nm 的紫外灯下,观察染色后的各区带或斑点。蛋白质和肽经丹磺酰氯化后并不影响电泳迁移率,而且少量丹磺酰氯化的样品还可用做无色蛋白质分离的标记物。而且磺酰氯化不阻止蛋白质水解,分离后的凝胶上洗脱下来的磺酰氯化的蛋白质仍可进行肽的分析,不受蛋白酶的干扰。在SDS 存在下,也可用本法染色,将蛋白质溶解在含10% SDS的0.1mol/LTris-HCI-乙酸盐缓冲液(8.2)中,加入丙酮溶液的10%丹磺酰氯溶液,并用石蜡密封试管,500C 水浴保温15分钟,再加入巯基乙醇(-ME ),使过量的丹磺酰氯溶解,这种混合物不经纯化就可电泳。
(2)荧光胺(fluram )其作用与丹磺酰氯相似。由于自身及分解产物均不显示荧光,因此染色后也没有荧光背景。但由于引进了负电荷,因而引起电泳迁移率的改变,但在SDS 存在下这种电荷效应可忽略。近年荧光胺也用于双向电泳的蛋白染色。
6 、银染色法
此法是Switzer R C和Merril CR首先提出的,它较CBBR250灵敏100倍。但染色机制尚不清楚,可能与摄影过程Ag+的 还原相似。其灵敏度很高,牛血清为4*10-5ul/ml,清蛋白为8*10-5ul/mm2,CytC 为1。7*10-4ul/mm2,因此也常用于凝胶电泳蛋白质染色。
二、脂蛋白染色
1 、 油红O 染色
将凝胶先置于平皿中,用5%乙酸固定20min ,用H2O 漂洗吹干后,再用油红O 应用液染色18小时,在乙醇:水=5:3中浸泡5min ,最后用蒸馏水洗去底色。必要时可用氨基黑复染。以证明是脂蛋白区带。 2 、 苏丹黑B
将2g 苏丹黑B 加60ml 吡啶和40ml 醋酸酐、混合,放置过夜。加3000ml 蒸馏水,乙酰苏丹黑即析出。抽滤后再溶于丙酮中,将丙酮蒸发,剩下粉、状物即乙酰苏丹黑,将乙酰苏丹黑溶于无水乙醇中,使呈饱和溶液。用前过滤。按样品总体积1/10量加入乙酰苏丹黑饱和溶液将脂蛋白预染色后进行电泳. 此染色适用于琼脂糖电泳及PAGE 脂蛋白的染色.
三 、核酸的染色
核酸染色法一般将凝胶先用三氯乙酸、甲酸-乙酸混合液、氯化高汞、乙酸、乙酸镧等固定, 或者将有关染料与上述溶液配在一起, 再固定与染色. 有的染色液同时染DNA 及RNA, 也有DNA 和RNA 各自的特殊染色法. 1 、 RNA染色法
(1)焦宁Y : 对RNA 染色效果好,灵敏度高。RNA 在2.5%PAA (聚丙烯酰胺) ,直径为0.5cm 的凝胶柱中检出的灵敏度为0.3-.5ug ;若选择更合适的PAA 浓度,检出灵敏度可提高0。01ug ;脱色后凝胶本底颜色浅而RNA 色带稳定,抗光且不褪色。此染料最适温度为0。5%。低于0。5%则RNA 色带较浅;高于0.5%也不能增加对RNA 染色效果。此外,焦宁G 也可用于RNA 染色。
(2)甲苯胺蓝O : 其最适浓度为0.7%,染色效果较焦宁Y 稍差些,因凝胶本底脱色不完全,较浅的RNA 色带不易检出。
(3)次甲基蓝:染色效果不如焦宁Y 和甲基胺蓝O ,检出灵敏度较差,一般在5ug 以上,染色后RNA 带宽,且不稳定,时间长,易褪色。但次甲基蓝易得,溶解性好,所以较常用。
(4)淀橙:染色效果不太理想, 底颜色深, 不易脱掉:与焦宁Y 相比,RNA 色带较浅, 但却常用, 因为它能区别单链或双链核酸, 对双链核酸显绿色荧光(530nm),对单链核酸显红色荧光(640nm).
(5)荧光染料溴乙锭(EB)
用于观察琼脂糖电泳中的RNA DNA带。EB 能插入核酸分子中碱基对之间, 导致EB 与核酸结合. 超螺旋DNA 与EB 的结合能力小于双链开环DNA, 后者与EB 的结合能力又小于线性DNA, 可在紫外(253nm)分析等下观察荧光,如将已染色的凝胶浸泡在1mmol/LMgSO4溶液中1小时, 可降低未结合的EB 引起的背景荧光, 对检测极少量的DNA 有利。
EB 染料具有下列优点:
操作简单, 凝胶可用1-0.5ul/ml的染色, 染色时间取决于凝胶浓度, 低于1%琼脂糖的凝胶, 染15分钟即可。多余的EB 不干扰在紫外灯下检测荧光; 染色后不会使核酸断裂, 而其他染料做不到这点, 因此可以将染料直接加到核酸样品上, 以便随时用紫外等追踪检查; 灵敏度高, 对1ngRNA DNA均可显色。EB 染料是一种强烈的诱变剂, 操作时应注意防护, 应带聚乙烯手套。
DNA 染色法
除用EB 外, 还有以下几种方法:
甲基绿:一般将0.25%甲基绿溶于0.2mol/L Ph4.1的乙酸液中, 用氯仿抽提至无紫色, 将含DNA 的凝胶浸入, 室温下染色1小时, 即可显色. 此法适用于检测天然的DNA 。
二苯胺:DNA 中的脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂染色1h, 再在沸水浴中加热10min 即可显示兰色区带. 此法可区别DNA 和RNA 。
Feulgen 染色:用此法染色前, 应将凝胶用1mol/LHCI固定, 然后用Schiff 试剂在室温下染色, 这是组织化学中鉴定DNA 的方法。
还可用甲烯蓝、哌咯宁B 等一些其他染料, 或用2%焦宁Y,1%乙酸镧,15%乙酸的混合溶液浸泡含DNA 的凝胶, 染色过夜。
第一章 磷脂代谢
磷脂是生物膜的重要组分,作为膜的结构和功能单位,膜磷脂以其规律的结构保证细胞的正常形态和功能,如生长、繁殖、细胞识别与消除、细胞间信息传递、细胞防御、能量转换等功能,影响血液粘滞性、血液凝固和红细胞形态,参与脂蛋白的组成。磷脂是膜上的各种脂类依赖性酶类起催化作用不可缺少的物质。
衰老及多种疾病的发生与膜磷脂构成改变有关。补充磷脂在抗衰老、防止动脉硬化、调节血糖、防治肝硬化、皮肤病、血液病、神经功能调节及智力开发等领域均有作用。
第一节 磷脂的分类、分布和性质
鞘脂(sphingolipids) 含鞘氨醇(sphingosine)或二氢鞘氨醇的脂类
由甘油构成的磷脂称为甘油磷脂(phosphoglyceride);
由鞘氨醇构成的磷脂,称为鞘磷脂(sphingolipid)。
磷脂结构特点是:具有由磷酸相连的取代基团(含氮碱或醇类) 构成的亲水头(hydrophilic head)和由脂肪酸链构成的疏水尾(hydrophobic tail)。
在生物膜中磷脂的亲水头部位于膜表面,而疏水尾位于膜内侧。因甘油磷脂有极性头(-0H 与P 形成脂键)、非极性尾(CH 长链),故这类化合物是两性脂类。
甘油磷脂类包括:
1. 磷脂酰胆碱(PC ) :又名为卵磷脂
2.磷脂酰乙醇胺(PE ):又名为脑磷脂
3.磷脂酰丝氨酸(PS )
4. 磷脂酰肌醇(PI ):
5. 磷脂酰甘油(PG )
6. 二磷脂酰甘油(DPG ):心磷脂(CL )
7. 溶血磷脂
8. 缩醛磷脂
9. 血小板活化因子
(一)磷脂酰胆碱(PC )
PC 是白色蜡状物质,极易吸水,其不饱和脂肪酸能很快被氧化。人体组织、脏器中都含有相当多的PC ,在脑、肾上腺、红细胞和精液中含量尤其丰富。卵黄中高达8~10%。PC 中的胆碱是季胺,碱性极强,可与氢氧化钠相比。在生物界分布广泛, 在肝脏中,胆碱能通过合成PC 来调节脂肪代谢;在神经组织中,胆碱参与合成的乙酰胆碱是一种神经递质,与神经兴奋的传导有关;在甲基转换中胆碱可提供甲基。
(二)磷脂酰乙醇胺(PE )
是动植物中含量最为丰富的磷脂,与血液凝固有关,可能是凝血酶激活酶的辅基。 PE中X= CH2—CH2—NH3
(三)磷脂酰丝氨酸(PS )
又称丝氨酸磷脂。其基本结构与PC 、PE 相似,只是磷酸基团与丝氨酸的羟基以酯键相连。
(四)磷脂酰肌醇(PI )
肌醇:六碳环状糖醇。PI 常与PE 等混合在一起,心肌及肝中多是磷脂酰肌醇一磷酸,而脑中多为磷脂酰肌醇二、三磷酸。
(五)磷脂酰甘油(PG )
其中极性基团是一个甘油分子。结构式中X=CH2—CHOH —CH2OH ,细菌的细胞膜中常含有PG 的氨基酸衍生物(特别是L-赖氨酸)。赖氨酸与甘油的第三个羟基以酯键相连,这种含氨基酸的脂称为脂氨酸。
(六)二磷脂酰甘油(DPG )
又称心磷脂(cardiolipin) (CL),是由甘油的C1和C3与两分子磷脂酸结合而成。心磷脂是线粒体内膜和细菌膜的重要成分,而且是唯一具有抗原性的磷脂分子。CL 共有3个分子甘油,2个P 基团,4个脂肪酸基团。
(七)溶血磷脂
是甘油磷脂失去一个脂肪酸后的产物。 它是一个表面活性物质,能够使红细胞溶解;对进入肠道食物中
的脂质,它又是一个乳化剂。
溶血磷脂分为:溶血磷脂酰胆碱(LPC ) 溶血磷脂酰乙醇胺(LPE )
溶血磷脂酰丝氨酸(LPS ) 溶血磷脂酰肌醇(LPI )等
(八)缩醛磷脂
又称浆磷脂,与一般甘油磷脂的差别是: 甘油1位碳上是一个脂烯醚,脂烯醚的水解产物是脂肪醛,脂肪醛与甘油缩合称缩醛反应,其产物失水成脂烯醚,含有脂烯醚的磷脂称为缩醛磷脂。
缩醛磷脂在心脏和红细胞膜中含量较多,从红细胞膜中可分离出19种缩醛磷脂。在组织化学中,由于缩醛磷脂能游离出脂肪醛,因而可用无色品红显色。
(九)血小板活化因子
血小板活化因子与缩醛磷脂的不同在于甘油1位碳是饱和长链醇,第2位的脂酰基为最简单的乙酰基。
(十)甘油磷脂的性质
1、溶解度:甘油磷脂溶于含有少量水的多数非极性溶剂中。用氯仿/甲醇很容易将组织和细胞中的甘油磷脂萃取出来。甘油磷脂不溶于丙酮,根据这个特点可用丙酮把磷脂中的其它脂类溶解除掉。磷脂能与氯化镉结合,生成不溶于乙醇的复盐,PE 的氯化镉复盐不溶于乙醚,而PC 与SM 的氯化镉复盐能溶于乙醚。根据复盐溶解度 的差别,可以进一步纯化磷脂,也是鉴定磷脂的定性方法。脂溶性的磷脂在水中扩散成胶体,具有乳化性质
磷脂的溶解性质
磷脂种类 乙醚 乙醇 丙酮
磷脂酰胆碱 溶 溶 不溶
磷脂酰乙醇胺 溶 不溶 不溶
神经磷脂 不溶 溶于热乙醇 不溶
2、电荷和极性
甘油磷脂在pH=7时,磷酸基团带的是负电荷,而PC 、PE 的极性头部带正电荷,因此这两种化合物本身是既带正电荷又带负电荷的兼性离子。
3、氧化性质:
纯的甘油磷脂是白色蜡状固体,与空气接触迅速变成黄色,久成褐色。甘油中脂肪酸有棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚麻酸和花生四烯酸。分子中50%是不饱和脂肪酸,一般在甘油1位碳上为饱和脂肪酸,2位上为不饱和脂肪酸。PC 与空气接触后颜色的变化,是由于不饱和脂肪酸被氧化,形成过氧化物,进一步形成褐色过氧化物的聚合物所致。
二、神经磷脂类(SM )
神经磷脂又称鞘磷脂,是神经组织各种膜的主要结构脂类之一。神经磷脂的基本结构是以神经氨基醇(鞘氨醇)为核心取代甘油磷脂类的甘油核心。神经氨基醇是一系列碳链长度不同的不饱和氨基醇,最常见的神经氨基醇含有18个碳原子,在磷脂中常以酰胺即神经酰胺形式存在。神经磷脂的极性头是磷酰乙醇胺或磷酰胆碱。
三、磷脂的分布
脑组织磷脂含量最多,其中70%为 PC、PE ,肝含量为脑中的一半,脾含磷脂为8%。骨髓中几乎没有。患贫血病时,磷脂和游离脂肪酸及固醇量增加。动物骨髓中磷脂随增龄而减少。性腺内磷脂含量与分泌机能有关。卵巢黄体中含磷脂较多,睾丸的磷脂分布在间质细胞和生精细胞中。
皮肤粘膜的磷脂含量以表皮基层最多,向浅层逐渐减少,表皮磷脂含量为1.9%。肌肉磷脂含量以心肌最高,骨骼肌磷脂含量与其机能有关。
第二节 磷脂的合成
合成全过程可分为三个阶段,即原料来源、活化和甘油磷脂生成。甘油磷脂的合成在细胞质滑面内质网上进行,通过高尔基体加工,最后可被组织生物膜利用或成为脂蛋白分泌出细胞。机体各种组织 ( 除成熟红细胞外) 即可以进行磷脂合成。
甘油磷脂的合成
1. 合成部位
全身各组织细胞内质网,肝、肾、肠等组织最活跃。
2. 合成原料及辅因子
脂酸、甘油、磷酸盐、胆碱、丝氨酸、肌醇、ATP 、CTP
3. 原料来源
原料为磷脂酸与取代基团。磷脂酸可由糖和脂转变生成的甘油和脂肪酸生成(详见甘油三酯合成代谢) ,但其甘油C2位上的脂肪酸多为必需脂肪酸,需食物供给。取代基团中胆碱和乙醇胺可由丝氨酸在体内转变生成或食物供给。
丝氨酸 乙醇胺 胆碱
4. 活化
磷脂酸和取代基团(胆碱、胆胺等)在反应之前,两者首先被CTP 活化(被CDP 携带);胆碱与乙醇胺可生成CDP-胆碱和CDP-乙醇胺,磷脂酸可生成CDP-甘油二酯。
5. 甘油磷脂生成
(1)磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺
这两种磷脂生成是由活化的CDP-胆碱与CDP-乙醇胺和甘油二酯生成。此外PE 在肝脏还可与硫腺苷蛋氨酸(SAM 提供甲基)结合转变为PC 。
(2)磷脂酰丝氨酸
体内PS 合成是通过Ca++激活的酰基交换反应生成,由PE 与丝氨酸反应生成磷脂酰丝氨酸和乙醇胺。
磷脂酰乙醇胺+丝氨酸 磷脂酰丝氨酸+乙醇胺
(3)磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和心磷脂
上述三者生成是由活化的CDP-甘油二酯与相应取代基团反应生成。
甘油磷脂合成还有其他方式,如
磷脂酰胆碱由磷脂酰乙醇胺从S-腺苷甲硫氨酸获得甲基生成。
磷脂酰丝氨酸由磷脂酰乙醇胺羧化或其乙醇胺与丝氨酸交换生成。
6、缩醛磷脂与血小板活化因子的合成
合成过程与磷脂合成过程类似。
不同之处在于由磷酸二羟丙酮转变生成脂酰磷酸二羟丙酮后,由一分子长链脂肪醇取代其第一位脂酰基,再经还原(由NADPH 供H) 、转酰基等步骤 合成磷脂酸的衍生物(而不是磷脂酸)。此产物替代磷脂酸为起始物,沿甘油三酯途径合成
胆碱或乙醇胺缩醛磷脂。
血小板活化因子与缩醛磷脂的不同在于长链脂肪醇是饱和长链醇,第2位的脂酰基为最简单的乙酰基。
二、神经磷脂的合成
神经磷脂大量存在于脑与神经组织,是神经髓鞘的主要成分。神经磷脂是构成生物膜的重要磷脂,常与PC 并存细胞膜的外侧。神经髓鞘含脂类甚多,占干重的97%,其中PC 占11%,SM 占5%;人红细胞膜磷脂中约20%~30%为SM 。
以脂酰CoA 和丝氨酸为原料,消耗NADPH 生成二氢鞘氨醇,进而经脂肪酰转移酶作用生成神经酰胺。 鞘磷脂的合成
1. 鞘氨醇的合成
部位:全身各细胞内质网,脑组织最活跃
原料:软脂酰CoA 、丝氨酸、磷酸吡哆醛NADPH+H+及FADH2
2. 鞘脂的合成
第三节 磷脂的分解
生物体内存在能使磷脂水解的多种磷脂酶。如磷脂酶A1、A2、B1、B2、C 、D 及溶血磷脂酶、神经磷脂酶等。各磷脂酶的作用部位如下图:
磷脂酶A1:自然界分布广泛,主要存在于细胞的溶酶体内,此外蛇毒及某些微生物中亦有,可有催化甘油磷脂的第1位酯键断裂,产物为脂肪酸和溶血磷脂2。
磷脂酶A2:普遍存在于动物各组织细胞膜及线粒体膜,能使甘油磷脂分子中第2位酯键水解,产物为溶血磷脂1及脂肪酸。 Ca2+是此酶的激活剂。胰腺组织含有磷脂酶A2原和溶血磷脂酶。
磷脂酶C :存在于细胞膜及某些细胞中,特异水解甘油磷脂分子中第3位磷酸酯键,其结果是释放磷酸胆碱或磷酸乙醇胺,并余下分子中的其他组分。
磷脂酶D :主要存在于植物,动物脑组织中亦有,催化磷脂分子中磷酸与取代基团 (如胆碱) 间的酯键,释放出取代基团。溶血磷脂是一类具有较强表面活性的性质,能使红细胞及其他细胞膜破裂,引起溶血或
细胞坏死。当经磷脂酶B 作用脱去脂肪酸后,转变成甘油磷酸胆碱或甘油磷酸乙醇胺,即失去溶解细胞膜的作用。
鞘磷脂经神经磷脂酶作用,水解产生磷酸胆碱和神经酰胺。脑、肝、脾肾等细胞的溶酶体中含有此酶,如缺乏此酶可引起肝、脾肿大及神经障碍如痴呆等鞘磷脂沉积症。
二、神经鞘磷脂的降解
神经鞘磷脂分解为磷脂胆碱,N-脂酰鞘氨醇
脑、肝、肾、脾等细胞溶酶体中的 神经鞘磷脂酶 (属于PLC 类)
说明:
1、磷脂酶存在部位: 溶于胞浆或整合于膜系统上。
2、膜内的磷脂酶不能使膜内的磷脂水解,而能水解胞内的磷脂。
3、胞浆内的磷脂酶却能分解结合于膜上的磷脂 。
4、食物中的磷脂被消化液中各种磷脂酶水解后吸收。肠粘膜内有催化溶血磷脂分解或再酯化的酶。保护细胞膜。
第四节 磷脂分子的重组与更新
在磷脂酶A1、A2及酰基转移酶的作用下,组织中的甘油磷脂可以不断的进行脱酰基与再酰化,使分子中的酯酰基得以随时变换。使人体各组织迅速调整各种磷脂的含量和比例,以适应环境和生理情况的变化。 膜系上的磷脂还可以整个分子交换的方式进行更新,但不是主要方式。
各种组织的细胞膜磷脂可与血浆或组织间液中的磷脂进行交换,而细胞内的膜系如核膜、线粒体膜及内质网膜的磷脂,也能与血浆或组织间液中的磷脂进行交换。细胞内各种膜的磷脂还可以进行膜间的交换。
通常内质网膜的磷脂交换较快,线粒体膜的磷脂交换较慢;PC 交换快,PE 交换慢。线粒体的DPG 基本上不进行交换。
乙炔雌二醇能加速人红细胞中脂肪酸的更新,主要是能激活红细胞中PE 酰基转移酶的活性。在非红细胞系统中,雌激素能够调节PC 的活性。
在红细胞中存在内源性磷脂酶,该酶催化内源性磷脂释放出游离脂肪酸和溶血磷脂。游离脂肪酸返回到血浆中,而溶血磷脂可在原位立即被再酰化,或被磷脂酶B 水解。
人红细胞中约60~70%的PC 和不到30%的神经磷脂,及少量的PE 与血浆的同系物自由交换,但PS 不能交换。 总之,成熟红细胞膜中磷脂的更新主要靠两条途径:磷脂的整分子交换和脂肪酸往磷脂的掺入。前者主要更新红细胞膜外单层的磷脂,尤其是多不饱和酰磷脂;后者主要更新红细胞膜内单层的磷脂,尤其是二饱和酰磷脂。
第二章 磷脂的生物学作用
第一节 生物膜脂质组成与结构
细胞膜又称质膜。质膜、细胞器膜和核膜统称为生物膜。膜厚约75~100Å,生物膜不仅是细胞的外被,还是生命三要素(生物能量交换、生物物质交换、生物信息的形成)不可缺少的结构。
一、膜脂质双层结构
1925年提出膜是由磷脂分子组成的双分子层,极性头排在外,疏水尾在内。 细胞膜质成分:磷脂、糖脂、胆固醇。外层主要是PC 和SM 。内层多为PE 和PS ,这表现膜质分布的不对称性。PE 、PS 有促血凝作用,一旦翻转于外部则可促凝血。与细胞识别有关的糖脂全部分布于外层,有利于提高细胞对外敏感性。磷脂在脂双层两侧分布的不对称性与其生理功能有关。如膜的流动性、通透性对酶活性的支持等,甚至细胞膜的柔韧性都是由磷脂双层的组分不同来决定的。
二、膜脂质的流动性
膜的流动性是指膜内部脂类和蛋白质两类分子的运动性。在生理状态下,细胞膜既不是固态也不是液态而是液晶态。它们即有液态分子的流动性,又有固态分子的有序排列。当温度降到某一点时,膜可由液晶转为晶态;当温度升高时晶态再熔为液晶态,这种变化叫相变。引起相变的这个温度叫相变温度
影响脂质流动性的因素:
磷脂所含脂肪酸不同,膜流动性不同。含不饱和脂肪酸多相变温度低;脂肪酸链越短相变温度越低。相变温度高膜流动性小。当有钙离子、镁离子存在时,相变温度升高。胆固醇可降低饱和磷脂的相变温度,而增高不饱和磷脂的相变温度, 故认为胆固醇在膜内有双向调节膜流动性的作用。
生物膜的流动性使膜中蛋白质的适应功能发生变化,从而改变其分布与构型,这成为维持细胞功能的重要条件。
细胞吞噬与胞饮作用,神经突触释放递质以及细胞分裂与融合等都与膜流动性有关。细胞膜的Na+-K+-ATP酶需膜磷脂处于流动相时,才表现出充分的活性,可见膜的流动性与膜酶的活性密切相关。生物膜的流动性是膜生物学功能所必须的
三、脂质双层中磷脂的运动
膜脂分子的运动在相变温度以上的情况下(在液态时),膜脂的运动可归纳为:
1、横向扩散运动:沿膜平面横向移动交换位置。
2、旋转运动:膜脂分子围绕与膜平面垂直的轴进行快速旋转。
3、摆动运动:膜脂分子围绕与膜平面垂直的轴进行左右摆动。
4、伸缩振荡运动:膜脂的脂肪酸链沿与膜平面垂直的长轴伸缩振荡。
5、脂肪酸链的旋转异构运动:膜脂分子中脂肪酸的C-H 链做旋转运动。
6、翻转运动:膜脂分子从脂双层的一层翻转到另一层的运动,速度慢,极少发生。
第二节 磷脂与膜酶的相互作用
膜上整合酶的活性与磷脂关系密切。若用有机溶剂除去磷脂(用特异磷脂酶破坏磷脂)可使此类酶活性下降或完全丧失。
膜磷脂与膜酶的相互作用有以下一些特点:
1、大多数能被磷脂激活的酶在天然状态下是膜酶,但并不是所有膜酶都需要磷脂来激活。
2、一个酶去磷脂后用不同的磷脂来重激活,激活程度不同,激活所需的磷脂最适浓度也不同,酶对磷脂表现出高度的专一性。如:β -羟丁酸脱氢酶对PC 高度专一,而NADH 脱氢酶主要与DPG 结合。
3、同一生物膜上不同的酶对磷脂有不同的专一性,如牛心线粒体膜上的细胞色素氧化酶由DPG 来激活,而琥珀酸脱氢酶由磷脂激活。
4、膜中的脂质与 膜酶蛋白的相互作用 是非共价相互作用(可逆) 。
5、磷脂激活酶的活化能一般为20~40千卡/克分子,比一般水溶性酶(10~20千卡/克分子)大。
6、磷脂对激活酶的作用在于:
⑴调节酶与底物、抑制剂、辅助因子的结合。
⑵调节膜蛋白质的变构。
⑶改变膜酶的活化能
⑷增加膜蛋白质的稳定性。
⑸调节膜蛋白之间的相互作用。
⑹磷脂在蛋白质(酶)的远距离相互作用中起作用(媒介作用)。
第三节 心磷脂与线粒体
每一种生物膜都有其特殊的磷脂成分谱。除了以酶作为一种生物膜的标志外,某些磷脂也可作为特定生物膜的表线粒体内膜呼吸链上的NADH 脱氢酶和琥珀酸脱氢酶的活性与磷脂和CoQ10均有密切关系。用磷脂酶处理上述酶则酶失活,添加磷脂与CoQ10
内 外
厚 50~70 Å 50~70 Å
形状 皱褶 伸展
表面 光滑 偶有突起
用丙酮提出磷脂 双层结构存在 双层结构破坏
通透性 分子量150以下通过 分子量1万以下通过
磷脂/蛋白 0.27 0.82
心磷脂 高 低
PC 低 高
胆固醇 低 高
CoQ10 有 无
二、CL 与其分布
CL 主要分布在线粒体,是构成线粒体的主要磷脂,占总磷脂的20%,此外其它膜中含少量CL 。线粒体内膜CL 占25%,外膜3%,CL 是线粒体内膜的特征性磷脂。线粒体膜的CL 中约90%是不饱和脂肪酸,其中亚油酸占59%。
三、CL 与线粒体内膜的流动性
磷脂中不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的比值越高,膜的流动性越大。CL 能使线粒体内膜的流动性增大。
四、CL 与线粒体内膜蛋白的相互作用
在线粒体内膜上细胞色素氧化酶的周围的单层“界面脂”是由CL 、PC 和PE 等组成的。去磷脂后细胞色素氧化酶的活性消失,补充PC 仅恢复5~10%活性,再加入CL 则活性全部恢复。
第四节、肌醇脂质信使系统
肌醇脂质在细胞跨膜信号传递中起重要作用,这是受体学说的新突破。这一系统是环核苷酸以外的新的信使系统。多种激动剂包括激素、神经递质、生长因子等是通过肌醇脂质信使系统发挥作用的。
一、肌醇磷脂与肌醇磷脂酸
肌醇脂质包括:肌醇磷脂与肌醇磷酸脂。
肌醇磷酸酯是肌醇和磷酸形成的酯类。
细胞中主要有:肌醇-1-磷酸(IP )
肌醇-1, 4二磷酸(IP2)
肌醇-1,4,5三磷酸(IP3)
肌醇-1,3,4三磷酸(IP3)
1、 PI主要存在于细胞质膜的内侧, 约占总磷脂的5~10%,部分存在于内质网。在肝和心肌中多含PI ,而脑中神经元和胶质细胞膜上为多磷酸肌醇磷脂。
2、肌醇磷酸酯主要存在于细胞质中,且含量极少。肌醇磷酸酯溶于水,具有旋光性和红外吸收性,常用阴离子交换树脂柱层析法,高压电泳法或高效液相色谱法等分离。
二、肌醇磷脂循环
包括肌醇磷脂的合成、分解及第二信使的产生和降解。
磷脂酰肌醇合成后磷酸化生成磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2),后者在磷脂酶C 作用下水解为甘油二酯(DG )和肌醇三磷酸(IP3),DG 和IP3经一系列反应再合成PI ,以上形成的循环称为肌醇磷脂循环。
DG 的降解途径
DG 是细胞内的第二信使,在胞质中磷脂酶A2作用下,第二C 位上的花生四烯酸释放,用于前列腺素、白三烯、血栓素的合成。
DG和IP3是第二信使,它们的产生依赖于肌醇磷脂循环,故此循环在肌醇脂质信使系统的信号传递中起重要作用。
有人发现Li+抑制肌醇磷脂的循环,从而解释Li+(碳酸锂)的抗精神病作用机理。
三、肌醇脂质信使系统
多种激素作用于靶细胞膜上特异的受体后,通过特定的G 蛋白激活对磷脂酰肌醇特异的磷脂酶C ,后者作用于PIP2,使之产生IP3和DG 。IP3可使细胞内钙离子浓度升高;DG 在细胞膜上激活蛋白激酶C (PKC ),使靶蛋白磷酸化而产生效应。如腺体分泌,肌肉的收缩血小板聚集,中性粒细胞活化及细胞生长、代谢、分化和肿瘤的生长等效应。IP3也能促进细胞内钙池释放Ca2+,也有重要的生理意义。
1、IP3的第二信使作用
IP3与钙通道上的受体结合,将钙离子储存库中的钙离子释放到细胞质。IP2进一步代谢为IP4(肌醇-1,3,4,5-四磷酸) ,它作用于细胞膜,引起细胞外的钙离子流入细胞内,使得钙库中的钙离子浓度维持高水平。
2、DG 和蛋白激酶C 的激活
1979年发现PIP2分解产物之一的DG 可以激活依赖钙离子的蛋白质磷酸化酶(C激酶,PKC) 。C 激酶在微量的钙离子介导下,与细胞膜的磷脂酰丝氨酸(PS)结合,形成钙离子-PS -酶复合物。DG 结合在这个复合物上就明显地增加了PKC 的活性。所以DG 和钙离子作为第二信使起作用。最近又提出一个在细胞应答时必需维持一定量DG 的机制。
作为第二信使的DG 主要功能是激活PKC ,可使对PI 专一的磷脂酶C 和磷脂酶A2活化,并降低细胞膜的流动性等。
PKC至少有12种,被PKC 磷酸化的底物有细胞膜受体、细胞骨架蛋白、酶和核蛋白质等。PKC 对机体的代谢、基因表达和细胞分化增殖等起调节作用。PKC 通过对靶蛋白的磷酸化而改变功能蛋白的活性和性质,启动一系列生理生化反应。
四、肌醇磷脂与血小板活化
血小板内含大量的磷脂酶C ,当凝血酶激活时,可活化磷脂酶C ,使血小板中的PI P2水解为DG 和IP3,IP3使PKC 活化,使血小板内膜的蛋白质磷酸化,,而激活血小板释放5-HT ,使血小板收缩聚集。
五、肌醇磷脂与中性粒细胞的氧化爆发
中性粒细胞寿命短,活跃,它有许多功能:趋向性、粘附、聚集、吞噬,脱颗粒和氧化爆发等。肌醇磷脂参与这些功能的完成。
六、肌醇磷脂与细胞增殖及癌变
一些癌基因可能通过编码一些促进肌醇磷脂代谢的蛋白质,从而干扰肌醇脂质信使系统而发挥致癌作用。许多有丝分裂的信号如:神经介质、激素、受精及各种生长因子等触发细胞增殖。细胞外的信号如何把信息从细胞表面有条不紊地传递到细胞核,研究表明与肌醇信使系统密切相关。
第三章 磷脂与疾病
第一节 红细胞磷脂含量及其测定方法
一、脂质的萃取方法:
1.样品的处理:红细胞、血浆、软骨和组织脏器等的处理。
2.样品中全脂质的萃取:氯仿:甲醇=1:1。
3.萃洗、浓缩。
二、总脂质的比色测定法:微量和半微量法。
三.总磷脂的测定方法:
每个磷脂分子中都含有一个磷酸根,可以根据磷的测定来代表磷脂含量。
1.硫氰亚铁铵比色法:原理 红色硫氰亚铁铵化合物不溶于氯仿,但与磷脂形成的复合物可溶于氯仿,按磷脂与硫氰亚铁铵(氯化铁和硫氰酸桉)形成的复合物颜色深浅进行比色。
2.消化法:原理 磷脂经过氯酸消化,使磷从磷脂中分离出来,加入钼酸桉试剂使磷结合成磷钼酸,再与抗坏血酸还原为钼蓝,以测定磷含量,由测得的磷换算成磷脂的含量。
3.酶法:原理 磷脂酶中磷脂酶D 水解作用的特异性不高,它能水解磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱与神经磷脂,但此三者占血清总磷脂得95%左右,故可用磷脂酶D 水解,测定释放出的胆碱,后者的测定如下:
胆碱氧化酶
胆碱 + 2O2 + H2O ———————— 甜菜碱 + 2H2O
过氧化物酶
2H 2O 2 + 4-氨基安替比林 + 酚 —————— 红色醌亚胺染料
四、磷脂组成薄层色谱分析
1.制作硅胶板 2.点样 3.展开
4.显色 5.磷脂的定量:
(1)薄层色谱扫描
(2)洗脱定量
第二节 冠心病(冠状动脉粥样硬化性心脏病)
一、冠心病人细胞膜的改变
RBC膜是细胞膜的窗口,红细胞膜总磷脂下降是冠心病临床生化的重要指标。此患者细胞膜胆固醇/磷脂升高,SM /PC 升高。
二、磷脂防治动脉粥样硬化的作用
磷脂作为膜结构的成分,补充磷脂可嵌入细胞膜,从而使生物膜的流动性增强,促进粥样硬化斑的消散。用PC0.125g /kg 治冠心病人, 可使血脂降低。
三、控制磷脂代谢对心肌细胞膜的影响
用低磷脂和高磷脂喂豚鼠,3个月后心肌胆固醇/磷脂及SM/PC均降低,而心肌细胞色素氧化酶活性升高。高磷脂组上述变化明显,故预防和治疗动脉粥样硬化,应给老年人多补充磷脂。
第三节 肺泡表面活性物质缺乏病
1929年发现肺内表面活性物质来源于肺泡上皮的分泌型细胞。 二软脂酰胆碱由Ⅱ型肺泡上皮细胞合成,可降低肺泡表面张力。
一、肺表面活性物质缺乏病
1、新生儿呼吸窘迫综合症(NRDS )
病理上 称肺透明膜病(HMD ),以肺泡及细支气管壁上附嗜伊红透明膜为特征。
Ⅱ型肺泡细胞分泌肺表面活性物质,此物降低肺泡表面张力,主要成分是磷脂(约86%),磷脂中的 77.8%是PC (二软脂酰PC ), 又称饱和磷脂。
肺泡合成PC 有两条途径:由磷酸胆碱移换酶和甲基移换酶催化。第一途径合成的活性强,但在胎龄32W 后才合成,第二途径在胎龄22-24W 即可检出。只是活性不强。故早产儿易患NRDS 。可产前诊断:测羊水中饱和PC 含量。
2、成人呼吸窘迫综合症
在某些疾病过程中(烧伤、创伤、感染) 出现,是以进行性缺氧和呼吸困难为特征的急性呼吸衰竭综合症。肺泡表面活性物质降低与病因有关。
3、神经原性肺水肿
起因交感神经改变了全身及肺循环的 血流状态。如脑外伤后出现的肺水肿,是因交感神经兴奋使大量无活性的肺表面活性物质分泌出来所致。
4、矽肺 实验性矽肺的大鼠肺组织中,PC 、PG 及表面活性物质中饱和PC 含量显著增高。
二、影响肺表面活性物质分泌的因素
(一)植物性神经系统对表面活性物质分泌的影响
1、交感神经和α受体激动剂的作用
交感神经兴奋和α受体激动剂可使肺表面活性物质分泌降低。
2、β受体激动剂及其拮抗剂的作用
β受体激动剂可增加肺泡表面活性物质的分泌。其拮抗剂如Ad 、异丙肾上腺素、心得安可对抗作用。
3、副交感神经和M 受体激动剂的作用
电刺激兔颈迷走神经2h ,肺灌洗液中磷脂含量增加31%。
(一)环核苷酸和前列腺素(PG )对肺表面活性物质分泌的影响
1、cAMP 可增加肺表面活性物质的释放
2、PGE2增加新生兔灌洗液中PC 的释放。而消炎痛则抑制释放。
(二)某些化学物质对表面活性物质的释放
KCI 促饱和PC 释放,阿托品和心得安拮抗。
微丝破坏剂细胞松弛素B 和微管破坏剂秋水仙素、长春花碱可减少表面活性物质释放。
三、肺表面活性物质替代疗法
1964年外源性二软脂酰PC 制成气雾剂,疗效不定。1980年用牛肺中提出的表面活性物质加磷脂制成气雾剂,治疗NRDS 获成功。
目前国际临床用替代疗法有三种:
1、人工合成的肺表面活性物质。
2、天然表面活性物质(牛、猪或人羊水提取)
3、人工合成加天然肺表面活性物质。发现天然制剂优于人工合成,可能是天然制剂中存在非血原性小分子蛋白,对磷脂的摄取、分泌、吸收能力等有促进作用。
第四节 磷脂酶A 与急性胰腺炎
一、磷脂酶A 性质
磷脂酶A (PLA )包括A1和A2。
A1性质不稳定,主要在动物脑组织中。
A2主要在胰腺和蛇毒中。A2在胰腺中以酶原的形式存在。PLA2水解细胞膜上的PC 产生溶血PC ,破坏组织细胞致坏死。毒蛇咬伤后的中毒症状,如肺出血、心室纤颤、强直收缩及呼吸抑制等都与PLA2作用有关。
二、 PLA2与胰腺炎的关系
1882年确立胰腺炎发病机制的自身消化学说,1960年发现急性胰腺炎组织的坏死是由PLA2引起。动物实验证实PLA2注射后短时引起严重的出血坏死性胰腺炎。急性胰腺炎病人胰腺组织中PC 降低,溶血PC 升高,血及门静脉血液中PLA2升高。
三、PLA2与胰腺炎时多发脏器衰竭的关系
急性胰腺炎时胰腺PLA2溢出到肝、肾、肺、脑、心,引发多脏器衰竭。
四、 PLA2抑制剂
已发现30多种抑制PLA2活性的物质,如CaNa-EDTA ,尚未发现内源性PLA2活性抑制剂。
五、 PLA2测定方法
1、荧光法 2、溶血法 3、PC 法 4、蛋黄法
第五节 大骨节病
大骨节病原因不明主要侵犯运动系统的地方性骨关节病,病人的代谢改变:
1、低硒所致血液谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px )活性降低;
2、血液及红细胞一些酶活性改变(CK 、γ-GT 、LDH 、GOT );
3、RBC 膜结构功能改变,患儿RBC 膜磷脂减少,以PC 减少为主,SM 升高,膜流动性降低,红细胞出现靶状、棘状、口状;
4、软骨病变的分子生物学特征:患儿骨骺及关节软骨DNA 量低于正常儿,且软骨中PC 降低。
第六节 克山病
以心肌坏死,心肌线粒体损害为主要特征的地方性心肌病。
1、克山病磷脂代谢障碍:病人红细胞膜及心肌总磷脂量减少,以PC 降低为主;
2、心磷脂与克山病的发病机制:患者膜结构和功能障碍主要是膜磷脂代谢障碍,尤其心肌线粒体脂质组成异常,心磷脂缺乏,细胞色素氧化酶活性显著降低。
现已确定克山病发病的三个基本环节:
1)、作为心肌线粒体膜本身必要的组分磷脂,尤其心磷脂的减少是发病的“结构性因素”。
2)、引发组织氧化损伤的氧自由基所谓“伤害性因素”的增加。
3)、在体内发挥抗氧化作用的硒、VE 、VC 等“保护性因素”的缺乏。
第七节 血栓形成
一 、血小板在血栓形成中的作用
磷脂占血小板全部脂质的76%,当血小板受ADP 、胶原等刺激后,其浆膜内侧面磷脂中含的血小板第3因子可翻转到膜外侧,为凝血提供相互结合的表面,促进凝血因子Ⅹ的活化,促进血液凝固。
二、RBC 膜与血栓形成的关系
当RBC 膜内层的PS 暴露在外时,RBC 有较强的促凝血作用;RBC 膜老化时,RBC 变形能力降低,易发血液淤滞与堵塞。
第八节 磷脂与皮肤病
一、伤口愈合中磷脂的作用
伤口涂磷脂的细胞间隙中组织液增多,细胞发育旺盛,愈合时间可缩短。
二、磷脂对毛发生长的作用
兔子涂磷脂能促毛生长;PI 有治疗脱发的作用。
三、磷脂对几种皮肤病的作用
1、脚癣:霉菌引起,涂磷脂3周后,脱皮痊愈。
2、牛皮癣:口服磷脂40g/日,同时低脂肪饮食,60%有效,停药复发。
3、脱发症、皮肤癌:PI 治脱发,PC 治褥疮及皮肤干裂,用10%的PC 肌注治棘细胞上皮癌。
四、磷脂抗衰老
口服磷脂可从细胞本身达到抗衰老;磷脂制成化妆品外敷有抗皮肤衰老的功能。
第九节 胆结石
胆汁中PC 占固体成分的25-30%。胆固醇在胆汁中保持溶解状态(分散)是由于它和胆盐、PC 形成微胶粒存在。PC 可使胆盐溶解胆固醇的能力增强。如PC 降低,胆固醇易析出沉淀形成结石,胆固醇结石的预防:适量限制饱和脂肪酸的摄入,避免不饱和脂肪酸的缺乏。口服PC 可防治胆固醇结石。
第十节 肝脏病
一、肝脏疾病磷脂的构成改变
脂肪肝病人肝中PC 升高,PE 降低。RBC 膜流动性降低。;急性肝炎病人血清HDL 中的磷脂降低。
二、磷脂对肝硬化的防治
第十一节 糖尿病
一、糖尿病人RBC 膜组分的改变,RBC 变形能力降低,膜流动性降低,膜Ch/磷脂升高。
二、磷脂在糖尿病中的应用
实验证明:磷脂能加强和延长胰岛素降低血糖的效应。
第十二节 神经系统疾病
一、磷脂对神经组织的作用
动物补充磷脂后神经细胞体积增大,纤维和轴突横经加粗,小剂量磷脂提高闹的兴奋性。
二、磷脂对老年性痴呆的作用
老年痴呆患者大脑皮层广泛分布老年斑和全脑萎缩。此病与脑磷脂的过氧化有关。口服磷脂症状改善。
三、 磷脂对其它神经系统疾病的作用
磷脂还可治疗神经衰弱的病人。
第十三节 血液疾病
小剂量磷脂刺激造血,再障、地中海贫血、遗传性球状RBC 病摄入一定量的磷脂协助改善症状。
第十四节 碘缺乏病
动物实验发现:T3、T4不足可造成大脑磷脂分子组成紊乱。说明,T3、T4不足可能通过脑磷脂组成改变影响脑细胞膜结构、功能、受体、酶活性及细胞心系信息传递,导致不同程度的CNS 损伤和发育落后。
第四章 磷脂的过氧化及抗氧化体系
第一节 脂质过氧化作用(LPO )
一、 脂质过氧化的产生
LPO是指多不饱和脂肪酸(PUFA )中发生的一系列自由基反应,形成脂质过氧化物(LOOD ), 后者的分解产物能引起细胞成分的损伤,导致细胞功能和结构的改变。
胞膜和亚细胞器膜是脂质过氧化损伤的主要部位。后者对过氧化更敏感。
二、自由基的概念、种类、产生与清除
自由基学说是1956年由Harman 提出的。
自由基是指含有未配对电子的原子、分子和原子团或离子。
体内常见的自由基有:
超氧阴离子自由基 氢自由基 有机过氧自由基 过氧化脂质自由基 羟自由基 有机自由基 脂质自由基 单线态氧 过氧化羟自由基 烷氧基自由基 氧化脂质自由基
自由基产生部位:线粒体、内质网、胞浆、浆膜等。
自由基性质:极不稳定,非常活泼,一旦产生就立即和其它物质进行反应。半衰期极短,平均10-3秒,浓度低。
自由基的形成:
是由于某些原因使分子中的共价键断裂后,共享的电子对分属于两个原子或原子团: A-B→A ·+B·,从而产生含奇数电子的离子。
自由基产生因素:
单电子氧化还原反应、高能辐射及光分解(主要是紫外线)等原因引起。空气中的氧化性污染物,例如:O3、NO2和NO 等也能在体内引起自由基反应。
体内一些酶促反应:
例如黄嘌呤氧化酶、二氢乳清酸脱氢酶等某些需氧脱氢酶所催化的反应中能产生自由基的中间产物。 自由基有两个特性:
1、非常活泼又称瞬时中间体。
2、连锁反应,分为三个阶段:引发阶段,蔓延阶段,终止阶段。
引发阶段:连锁反应第一阶段,产生最初的自由基。
蔓延阶段:自由基一旦产生立即和周围物质进行反应,本身消失产生新的自由基。
终止阶段:两个自由基进行反应生成稳定的化合物,分为偶联终止和歧化终止反应两类。前者在体内占重要地位。
人体依靠某些酶和抗氧化物质来清除自由基。它们有自身组织含有的, 有从食物摄入体内的。 抗自由基的物质有:
超氧化物岐化酶(SOD )、胆红素、过氧化氢酶、辅酶Q10、半胱氨酸、谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶、组氨酸、巯基基团、牛磺酸等;饮食中的抗氧化物质有:花红素、维生素C 、β-胡萝卜素、生物黄酮类、姜黄色素、甘露醇、蛋氨酸、植物酚酸、多酚类、维生素E 、硒、锌及合成的抗氧化物质如二叔丁对甲酚(bht )、叔丁对甲氧酚(bha )等等。
三、脂质过氧化对细胞的损伤
脂质过氧化对细胞膜的结构和功能产生严重损伤,影响膜的功能:
1、自由基与膜上的酶和/或受体共价结合,改变膜组分的活性。
2、可共价结合膜组成成分,改变膜结构和/或抗原性。
3、使巯基氧化,不饱和脂肪酸与蛋白质比率改变,造成膜运输过程紊乱。
4、脂质不饱和脂肪酸的过氧化直接影响膜结构,以及有关的过氧化产物影响膜的流动性、交联、结构和功能,使膜脆性增加。
四、脂质过氧化与衰老
近来关于衰老的理论大体上分两类:一类认为衰老是按预定的遗传程序进行的,衰老可为特异的“衰老”基因所表达,或为可用基因的最终耗竭。另一理论认为,衰老是无计划的、随机发生的一系列紊乱所引起。 衰老是细胞器的进行性和积累性毁坏,或是大分子信息的误差,导致产生不正常的大分子的结果。细胞的老化是机体衰老的基础。
衰老过程分为生理和病理变化两类。
二者难以区分,生理衰老现象以疾病的形式表现,而许多疾病又促进生理衰老的进程。LPO 既是细胞膜衰
老的诱因,也是细胞老化的结果。
膜脂质总量的相对增加与类脂成分改变可作为细胞分化和老化的指标。
处于不同发育阶段的膜脂类含量是不同的,随着增龄,膜胆固醇量增加。SM 增多,而PC 、PE 量大大降低。
膜胆固醇/磷脂(CH/PL);SM/PC;饱和脂肪酸/不饱和脂肪酸(SFA/PUFA)在老化时升高。
结果使膜的脆性增加,K+通透性增加,导致细胞内酶活性特别是依赖DNA 的RNA 聚合酶活性受抑制,蛋白
质的合成下降,引起细胞老化。
但自由基不足也引起机体一系列变化:
1、机体吞噬细菌的能力降低。
2、机体解毒作用受损。
3、胶原蛋白的合成受损。
4、前列腺素合成功能受损。
5、凝血功能受阻。
6、过高的SOD 易引起精神错乱。
第二节 机体的抗脂质过氧化系统
机体的抗氧化系统包括:抗氧化酶和抗氧化剂。
1. 抗氧化酶系:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px )、 谷胱甘肽还原酶、谷胱甘肽硫转移酶、过氧化氢酶及单胺氧化酶、亚铁氧化酶等。
2. 抗氧化剂:VitE 、VitC 、Se 、含巯基化合物(GSH 、半胱氨酸)等。
一、SOD 的种类和分布
SOD 是一种金属酶, 迄今发现有三种不同的类型, 各含不同的辅基:
1、含Cu 、Zn-SOD ,呈蓝绿色,主要在真核细胞胞质中。
2、含Mn ,称锰SOD ,呈紫红色,主要在真核细胞线粒体及原核生物。(红细胞无)
3、含Fe ,称Fe-SOD ,呈黄褐色,主要存在于原核生物细胞中。肝脏中活性均较高。
由于SOD 能清除·O2ˉ,所以在防御氧的毒性,防御肿瘤和炎症,预防衰老等方面起重要作用。
二、SOD 的开发
SOD 在自然界广泛分布,目前已从细菌、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物体内分离纯化出来。
1、以动物血为原料(家畜、家禽)提取Cu 、Zn-SOD 。
2、以动物组织为原料(肝、肾、心、肺)提取 Cu、Zn-SOD 和Mn-SOD 。
3、以微生物为原料(噬热菌、酵母和E Coil)提取Fe-SOD 和Mn-SOD 。
三、SOD 的临床应用
1、治疗急性炎症 9、治疗皮肤病(对皮肤色素沉着有强烈抑制作用)
2、治疗缺血性脑病 10、治疗骨髓损伤
3、治疗缺血性心脏病 11、治疗骨关节炎
4、延缓老年性白内障 12、与放疗联合治疗癌症
5、治疗自身免疫病 13、消除肌肉疲劳
6、防治氧中毒 14、消除乙醇中毒
7、治疗休克 15、治疗口腔疾病等
8、手术方面的应用(器官移植、整形、 血管吻合术)
SOD 的剂型:
1、食品添加剂 2、口服剂 3、气雾剂 4、注射剂
5、保养液 6、牙膏或其它膏剂 7、化妆品
四、SOD 与衰老
SOD 在某些器官中有明显的增龄变化。故认为SOD 的活性与动物种属的寿限有关。许多中药也对SOD 有影
响。
五、SOD 分析方法
1、邻笨三酚自氧化测定法 4、血清Mn 、Cu 、Zn-SOD 活力的测定
2、肾上腺素自氧化测定法 5、极谱氧电极法
3、四氮唑蓝比色法
谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px ,含Se ) 是细胞内抗氧化防御体系的主要成员之一。
作用如下: GSH-Px
2GSH+H2O 2 —————— GSSG + 2H2O
GSH-Px
2GSH+LOOH ——————————GSSG +LOH+ 2H2O
GSH-Px 清除H 2O 2和LOOH 等。机体各组织分布不同,肝、红细胞含量高,亚细胞器分布:胞液和线粒体基质中。 过氧化氢酶(Cat )又称触酶 是一类以铁卟啉为辅基的结合酶。肝、肾活性高。
Cat
2H2O 2 ———— 2H2+O2
Cat
ROOH+AH2 ———————— H2O +ROH+A
单胺氧化酶(MAO )是含Fe2+、Cu2+和磷脂的结合酶。
亚铁氧化酶是含铜的糖蛋白,纯品呈蓝色又称铜蓝蛋白。
第五章 大豆磷脂的制备与应用
磷脂能维持机体细胞的健康生长,抗衰老等作用,已引起科学工作者的兴趣。磷脂的开发涉及多学科领域。
芝麻、大豆及蛋黄中磷脂含量高,因大豆磷脂的生成是利用豆油制备的副产品,故大豆是目前提取磷脂的主要原料。
磷脂的应用:
一、医药
1、作为脂质体的载体
2、制成粉、膏剂和营养液用于临床,治疗神经衰弱、动脉硬化、高脂血症、冠心病等。还作为细胞免疫功能
增强剂,防治脂肪肝、肝硬化、调节血糖、延缓老年型痴呆的发生等。
二、食品
作为食品添加剂,除提高食品的营养外,同时还有乳化、湿润、防淀粉老化及粉末制品飞散等作用。在制作糖果、巧克力、冰淇淋、人造奶油、方便食品、脱水食品、意大利面条、果酱等都起一定作用。
三、其它工业
1、饲料(乳化、润湿、分散及表面活性剂作用)
2、肥皂(改善香皂结构,提高储藏稳定性)
3、化妆品(乳化、降低表面张力保护皮
肤、加强皮肤活化,调整皮肤pH 、防干燥)
4、农药、纺织品等。
第五章、蛋白质的定量测定
常用方法:
1. 微量凯氏定氮法 5. 胶体金法
2.Folin-酚试剂法 (Lowry) 6.BCA(bicinchnimic acid)
3. 考马氏亮蓝G-250染色法 7. 紫外分光光度法
4. 双缩脲法
按蛋白质的性质不同建立的测定方法:
物理性质: 紫外分光光度法
化学性质: 凯氏定氮法 、双缩脲法、 Lowry法、BCA 法 、胶体金法。
染色性质: 考马氏亮蓝染色法、银染法
其它性质:荧光法
常用的测定蛋白质含量方法的比较
方法 测定范围(ul/ml) 蛋白的差异 最大吸收波长(nm)
凯氏定氮法 小
紫外分光光度法 100-1000 大 280
双缩脲法 1000-10000 小 540
Folin-酚试剂法 20-500 大 750
考马氏亮蓝G-250 50-500 大 595
BCA 50-500 大 562
胶体金法 1-10 大 595
方 法 特 点
凯氏定氮法: 标准方法, 准确, 操作麻烦, 费时, 灵敏度低, 适用于标准的测定. 紫外分光光度法 : 灵敏, 快速, 不消耗样品, 核酸类物质有影响.
缩脲法 : 重复性, 线性关系好, 灵敏度低, 测定范围窄, 样品需要量大.
Folin-酚试剂法 :灵敏, 费时较长, 干扰物质多.
考马氏亮蓝G-250 :灵敏度高, 简单, 误差较大, 颜色会转移 .
BCA :灵敏度高, 稳定, 干扰因素少, 费时较长 .
胶体金法 : 灵敏度极高, 稳定, 操作简单, 干扰物影响较大.
各种方法分析:
1. 凯氏定氮法结果最精确, 但操作复杂。不适合大量样品的测定。原理:用封闭的凯氏定氮器测定蛋白质中
的含氮量,从而得出蛋白质的含量。
2. 紫外分光光度法:柱色谱分析中要求随时快速检测蛋白质分离情况,但不要求精确多用此法。
原理:待测蛋白质溶液适当稀释K 倍,分别在280nm 和260nm 波长光下测吸光度值A280和A260。
3. 双缩脲法测定范围窄,样品需要量大,科研上受到限制。
4. 酚试剂法干扰因素多。
5. 考马氏亮蓝法、胶体金法和BCA 法用的多。
胶体金法多用于微量蛋白的测定。
胶体金比色法 :胶体金是一种带负电荷的疏水性胶体,加入蛋白质后,红色的胶体金溶液转变为蓝色,其颜色的改变与加入的蛋白质量有定量关系。在595nm 处测定样品的吸收值。
BCA是对一价铜离子敏感、稳定和高特异活性的试剂。在碱性条件下,蛋白质将二价铜还原为一价,后者与BCA 形成紫色化合物,在562nm 处具有最大光吸收,其吸收值与蛋白质浓度成正比。灵敏度高,检测浓度下限达到25微克/毫升,最小检测蛋白量达到0.5微克,待测样品体积为1-20微升。 在50-2000微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。可以兼容样品中高达5%的SDS ,5%的Triton X-100,5%的Tween 20, 60, 80。
各种物质的染色方法
经醋酸纤维、琼脂糖、聚丙烯酰胺电泳分离的各种生物分子需用染色法使其在支持物相应位置上显出色谱带,从而检测其纯度、含量及生物活性。蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核酸及酶等均有不同的染色方法。
一、蛋白质的染色
染色液的种类繁多,各种染色液染色原理不同,灵敏度各异。使用时可根据需要加以选择。常有的染色液
有:
1. 氨基黑10B 分子式为:C 22H 13N 6S 3Na 3 MW=715 , λmax=620-630nm,是酸性染料。染不同的蛋白质时,着色度不同。
2、考马斯亮蓝R250(CBBR250)分子式为: C14H 44O 7H 3Na MW=824 , λmax=560-590nm,染色灵敏度比氨基黑高5倍。该染料是通过范德华键与蛋白质结合,尤其使用于SDS 电泳微量蛋白质的染色,但蛋白质的浓度超过一定范围时,蛋白质浓度与光密度不成正比。
3、考马斯亮蓝G250(CBBG250)比CBBR250多二个甲基。 MW=854 , λmax=590— 610nm,染色灵敏度比氨基黑高35倍。其优点是在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择性地使蛋白质染色,而几乎无本底色,常用于重复性好和稳定的染色,适用于定量分析 。
4、固绿(FCF ) 分子式为: C37H 31N 2O 10S 3Na 2 MW=808,λmax=625nm,酸性染料,染色灵敏度不如CBB 。近似于氨基黑,但可克服CBB 在脱色时易溶解出来的缺点。
5 、荧光染料
(1)丹磺酰氯(DNS-CI )在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质的末端氨基发生反应,使它们获得荧光性质,可在波长320nm 或280nm 的紫外灯下,观察染色后的各区带或斑点。蛋白质和肽经丹磺酰氯化后并不影响电泳迁移率,而且少量丹磺酰氯化的样品还可用做无色蛋白质分离的标记物。而且磺酰氯化不阻止蛋白质水解,分离后的凝胶上洗脱下来的磺酰氯化的蛋白质仍可进行肽的分析,不受蛋白酶的干扰。在SDS 存在下,也可用本法染色,将蛋白质溶解在含10% SDS的0.1mol/LTris-HCI-乙酸盐缓冲液(8.2)中,加入丙酮溶液的10%丹磺酰氯溶液,并用石蜡密封试管,500C 水浴保温15分钟,再加入巯基乙醇(-ME ),使过量的丹磺酰氯溶解,这种混合物不经纯化就可电泳。
(2)荧光胺(fluram )其作用与丹磺酰氯相似。由于自身及分解产物均不显示荧光,因此染色后也没有荧光背景。但由于引进了负电荷,因而引起电泳迁移率的改变,但在SDS 存在下这种电荷效应可忽略。近年荧光胺也用于双向电泳的蛋白染色。
6 、银染色法
此法是Switzer R C和Merril CR首先提出的,它较CBBR250灵敏100倍。但染色机制尚不清楚,可能与摄影过程Ag+的 还原相似。其灵敏度很高,牛血清为4*10-5ul/ml,清蛋白为8*10-5ul/mm2,CytC 为1。7*10-4ul/mm2,因此也常用于凝胶电泳蛋白质染色。
二、脂蛋白染色
1 、 油红O 染色
将凝胶先置于平皿中,用5%乙酸固定20min ,用H2O 漂洗吹干后,再用油红O 应用液染色18小时,在乙醇:水=5:3中浸泡5min ,最后用蒸馏水洗去底色。必要时可用氨基黑复染。以证明是脂蛋白区带。 2 、 苏丹黑B
将2g 苏丹黑B 加60ml 吡啶和40ml 醋酸酐、混合,放置过夜。加3000ml 蒸馏水,乙酰苏丹黑即析出。抽滤后再溶于丙酮中,将丙酮蒸发,剩下粉、状物即乙酰苏丹黑,将乙酰苏丹黑溶于无水乙醇中,使呈饱和溶液。用前过滤。按样品总体积1/10量加入乙酰苏丹黑饱和溶液将脂蛋白预染色后进行电泳. 此染色适用于琼脂糖电泳及PAGE 脂蛋白的染色.
三 、核酸的染色
核酸染色法一般将凝胶先用三氯乙酸、甲酸-乙酸混合液、氯化高汞、乙酸、乙酸镧等固定, 或者将有关染料与上述溶液配在一起, 再固定与染色. 有的染色液同时染DNA 及RNA, 也有DNA 和RNA 各自的特殊染色法. 1 、 RNA染色法
(1)焦宁Y : 对RNA 染色效果好,灵敏度高。RNA 在2.5%PAA (聚丙烯酰胺) ,直径为0.5cm 的凝胶柱中检出的灵敏度为0.3-.5ug ;若选择更合适的PAA 浓度,检出灵敏度可提高0。01ug ;脱色后凝胶本底颜色浅而RNA 色带稳定,抗光且不褪色。此染料最适温度为0。5%。低于0。5%则RNA 色带较浅;高于0.5%也不能增加对RNA 染色效果。此外,焦宁G 也可用于RNA 染色。
(2)甲苯胺蓝O : 其最适浓度为0.7%,染色效果较焦宁Y 稍差些,因凝胶本底脱色不完全,较浅的RNA 色带不易检出。
(3)次甲基蓝:染色效果不如焦宁Y 和甲基胺蓝O ,检出灵敏度较差,一般在5ug 以上,染色后RNA 带宽,且不稳定,时间长,易褪色。但次甲基蓝易得,溶解性好,所以较常用。
(4)淀橙:染色效果不太理想, 底颜色深, 不易脱掉:与焦宁Y 相比,RNA 色带较浅, 但却常用, 因为它能区别单链或双链核酸, 对双链核酸显绿色荧光(530nm),对单链核酸显红色荧光(640nm).
(5)荧光染料溴乙锭(EB)
用于观察琼脂糖电泳中的RNA DNA带。EB 能插入核酸分子中碱基对之间, 导致EB 与核酸结合. 超螺旋DNA 与EB 的结合能力小于双链开环DNA, 后者与EB 的结合能力又小于线性DNA, 可在紫外(253nm)分析等下观察荧光,如将已染色的凝胶浸泡在1mmol/LMgSO4溶液中1小时, 可降低未结合的EB 引起的背景荧光, 对检测极少量的DNA 有利。
EB 染料具有下列优点:
操作简单, 凝胶可用1-0.5ul/ml的染色, 染色时间取决于凝胶浓度, 低于1%琼脂糖的凝胶, 染15分钟即可。多余的EB 不干扰在紫外灯下检测荧光; 染色后不会使核酸断裂, 而其他染料做不到这点, 因此可以将染料直接加到核酸样品上, 以便随时用紫外等追踪检查; 灵敏度高, 对1ngRNA DNA均可显色。EB 染料是一种强烈的诱变剂, 操作时应注意防护, 应带聚乙烯手套。
DNA 染色法
除用EB 外, 还有以下几种方法:
甲基绿:一般将0.25%甲基绿溶于0.2mol/L Ph4.1的乙酸液中, 用氯仿抽提至无紫色, 将含DNA 的凝胶浸入, 室温下染色1小时, 即可显色. 此法适用于检测天然的DNA 。
二苯胺:DNA 中的脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂染色1h, 再在沸水浴中加热10min 即可显示兰色区带. 此法可区别DNA 和RNA 。
Feulgen 染色:用此法染色前, 应将凝胶用1mol/LHCI固定, 然后用Schiff 试剂在室温下染色, 这是组织化学中鉴定DNA 的方法。
还可用甲烯蓝、哌咯宁B 等一些其他染料, 或用2%焦宁Y,1%乙酸镧,15%乙酸的混合溶液浸泡含DNA 的凝胶, 染色过夜。