烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生

烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生

朱健 01级生物技术（1）班 200113712 王宇 01级生物技术（1）班 200113724 孙亮 01级生物技术（1）班 200113703

摘要： 烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的实验结果表明：光照对于愈伤组

织的诱导没有特别明显的影响，而对组织的分化和植株再生有一定的影响。

将2mm2左右的烟草叶片接种到MS + BA 2.0 mg/ L + NAA2.0mg/

L 的培养基中分光照和黑暗两种条件分别诱导愈伤组织。2周后，将愈伤组织按类型转到MS + BA 2.0 mg/ L + NAA 0.5mg/ L培养基中光照培养，3周后长出烟草幼芽。关键词：愈伤组织 诱导 光照 分化

Regeneration of Tobacco Plant based on Inducement of

Callosity from Leaf

Abstract : the experiment of regeneration of tobacco plant based on inducement of

callosity from leaf show that light have less effect on the inducement of callosity fromleaf ,but have more effect on the differentiation of bud.

2 mm2 tobacco leaf discs were inoculated on MS medium supplemented with BA(2.0 mg/L) and NAA(2.0 mg/L).Then induce the callosity , one group in light and theother group in darkness . After two weeks , culture the callosity on MS mediumsupplemented with BA(2.0 mg/L) and NAA(0.5 mg/L) in light . after three weeks itwill produce the bud.

Key Words : callosity, inducement ; light ;differentiation.

1.前言:细胞工程是应用细胞生物学的方法，有计划地改变细胞遗传物质并使之

增殖，从而生产有用的产物或引向成体化的综合科学技术[1]。在植物细胞、组织和器官培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个细胞、一个组织或一个器官的细胞通过脱分化形成愈伤组

[2]

织，并再分化成植株。为了获得用于细胞大量培养的培养物，要从植物不同的部位诱导生长旺盛的愈伤组织[3]。所谓愈伤组织原是指植物在受伤后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中则指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞[4]。目前组织培养中能重复地形成愈伤组织和再生植株的一般限于从活跃分生组织部分而来的外植体，如不成熟的幼胚、幼叶和幼花序，叶肉组织是一般常用的起始材料[5]。得

到愈伤组织以后，在愈伤组织继代培养时需要通过改进培养基和调整培养温度与光照对培养条件进行优化，以获取最大的生物量和有用成分的产率。

烟草是植物组织培养的四大典型实验植物之一，也是一种重要的经济作物，在国民经济发展中起着重要的作用。目前，通过烟草的花药培养，原生质体培养，以及烟草叶组织培养已经成功获得烟草的体外再生植株。烟草组织培养技术的成熟，为烟草的快速繁殖和新品种的筛选打下了坚实的基础。

本实验通过对烟草叶片愈伤组织的诱导与植株再生，来认识和掌握诱导植物愈伤组织的诱导培养技术和调控条件，了解器官分化和植株再生的过程。

2 材料与方法

2.1培养基

愈伤组织诱导培养基：MS + BA 2.0 mg/ L + NAA2.0mg/ L+Sucrose20g/L+Agar 7g/L；分化培养基：MS + BA 2.0 mg/ L + NAA 0.5mg/ LSucrose 20g/L+Agar 7g/L 。将以上培养基用0.5N NaOH与0.5N HCl调整pH 调至5.8~6.0 ，在高压灭菌锅中121 ºC，1.1kg/cm2条件下恒温灭菌20 min备用。

2.2 烟草无菌试管苗（由老师提供）

将烟草种子用消毒液84#消毒后，以无菌水洗3次，无菌吸水纸吸干水分，然后接种在MS培养基上。种子苗具4~5叶时继代扩繁备用。

2.3 烟草叶片愈伤诱导

消毒后，在超净工作台上夹取上述烟草无菌试管苗幼嫩叶片2mm2

左右并接种到愈伤组织诱导培养基上，每瓶接5片，共接种18瓶，快速封口后顺次将其编为1~18号。将接种后的三角瓶置于24ºC条件下黑暗培养一周，然后在同样温度下把1~9号瓶放在光照条件下培养，10~18号瓶放在黑暗条件下培养，直至愈伤组织形成。

注意在夹取外植体时动作要快，也要注意在对镊子高温消毒后要适当冷却，否则会造成外植体失水或者烫伤而影响生长。并且要严格进行无菌操作。

2.4 烟草植株的再生

将上述愈伤组织按类型顺次转到分化培养基上，接种18瓶，20~22

件下连续光照培养3~4周，直到长出芽。

条

3 结果与分析

3.1 愈伤组织诱导

诱导出的愈伤组织呈不规则细胞团，大小不一。光照条件下培养的愈伤组织呈绿色或黄绿色，体积较大；暗条件下培养的愈伤组织呈乳白色或浅黄色，体积较小。在光照和黑暗条件下诱导的愈伤组织均无感染发生，诱导率都在80-100%。见下表。

表1 烟草叶片愈伤组织诱导情况

3.2器官分化与植株再生

分化培养基上培养3周后，每一样品几乎都出现了分化，但分化程

度不一。光照处理的愈伤组织体积明显变大并长出了芽和芽点，其中一部分已经分化出叶片；经过黑暗处理的愈伤组织体积也变大但是不如光照的明显，而且颜色也由乳白色或淡黄色变为浅绿色，有芽及绿色的芽点分化，但相对较少。从光培养和暗培养里各选出三瓶分化最多的，统计其数据，填入下表。

表2 烟草叶片愈伤组织再生植株情况

Tabel2 Regeneration of tobacco plantlet

编号

愈伤组织

分化率

来源（光、

（%）

暗）光光

100100

分化芽数4630

平均每个愈伤组织分化芽数

9.27.5

分化芽状态已分化出小苗，且绿色芽点较多

已分化出小芽，深绿色芽点，1块褐化

已分化出小芽，深绿色芽点，1棵小苗

浅绿色愈伤，小芽较少，深绿色芽点，无小苗

浅绿色愈伤，深绿色芽点

浅绿色愈伤，分化出小芽，深绿色芽点，1棵小苗

污染率（%）

14

00

光

9

暗

121517

暗暗

80328

80184.5

000

100100

2720

5.44

3.3 两种类型愈伤组织分化能力差异显著性分析

3.3.1 愈伤组织诱导的差异显著性分析假设H：p=p，H：p≠p

光

光

光

光

暗

1

光

暗

n=44，x=42 ，p=95.45%n=44，x=43 ，p=97.73%

对水平α=0.01作双侧检验，u=2.58

α/2

暗

暗

暗

p

平均

= （x+ x）/（n+n）=0.9659，q

光

暗

光暗光暗平均

=0.0341

σ=0.386

Uc= (p-p)/ p平均=-0.6686

| Uc |=0.6686＜u=2.58，故接纳H，拒绝H，即光照培养和黑暗条件下培养的愈伤组织的诱导率无明显差异

α/2

1

3.3.2平均每个愈伤组织分化芽数的差异显著性分析假设：H0是没有显著差异的

因此，在α=0.01的显著水平下拒绝原假设，故认为光照培养和黑暗处理的愈伤组织在芽的诱导上有极显著的差异。

4 讨论

诱导愈伤组织形成和调控愈伤组织分化的因素是多方面的，而光照是诱导

愈伤组织形成和调控愈伤组织分化的重要因素。在不同的光照条件下，愈伤的诱导和分化情况有很大差别。

4.1 光照在愈伤诱导与植株再生过程中的作用

在光照条件下诱导的愈伤组织体积大而疏松，在黑暗条件下诱导的愈伤组织体积小而致密。而且在光照条件下诱导的愈伤组织的颜色较深，为绿色和黄绿色，而在黑暗条件下诱导的愈伤组织则颜色较浅，为浅黄和乳白色。接受光照的愈伤组织分化的比在黑暗条件的愈伤组织快，而对于愈伤组织的诱导并没有太明显的差别。这可能是因为在培养条件下，光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物。这一点在接下来的植株再生情况中可以得到证明：在相同条件下，1~3号瓶（光照条件下）中的愈伤组织出芽率明显高于4~6号瓶（黑暗条件下）中的愈伤组织，而两种条件下愈伤组织诱导率并没有太明显的差距。而4~6号瓶中的愈伤组织在转到光下培养以后，由乳白色变为浅绿色，说明产生了叶绿体，这是细胞分化的一个标志。

光照可以促进组织的分化和植物的正常形态的建成[6]。颜季琼等（1982）发现烟草叶肉原生质体壁的再生率在光下最高，达到60-76%[7]。光照对植物的叶绿体的形成有重要的作用，在个体发育中，叶绿体是由前质体分化而来。前质体的进一步发育主要与光照条件有关。在光照条件下，形成基质类囊体和光合色素，前质体即发育成叶绿体。在黑暗条件下，前质体形成前片层体。具有这种结构的质体称为白色体或黄化质体，一般颜色为白色或黄色，当白色体重新受到光照后，前片层体弥散，发育而形成具有正常机构和功能的叶绿体[8]。

愈伤组织在分化形成芽和整个小苗的过程中对光照有一定的需求，除了对叶绿体等细胞器的形成有重要作用外，还与其他的因素有关，比

如与激素之间的相互影响和作用。光照对器官发生的调节可能与调节培养物的内源激素平衡有关。潘战生等研究了光效应与激素作用之间的关系后认为：光效应与激素作用的效应不是简单相加，而是相互影响的。这具体体现在激素浓度低时，蓝光外其他波长的光对愈伤组织生长均有明显的促进作用；而在激素浓度高时，蓝光外其他波段的光对组织的作用甚微，这可能是被激素的效应所掩盖。在不改变光照条件时，激素的作用与两类激素的浓度比例有关。而用不同波段的光照时，则显示出光的作用的光谱特征还与激素浓度绝对值有关[9]。光照还可能影响生长素的信号转导系统，调整生长素的极性运输，从而引起器官分化。

组织培养中光照是重要的条件之一，主要表现在光强、光质和光照时间方面。光照时间对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，对外植体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而强度较弱的幼苗容易徒长。光质对愈伤组织诱导、培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响[2]，。Seibert等在烟草叶组织培养中发现蓝光和近紫外光有促进芽的发生和愈伤组织增重的作用[10]。光质对器官分化的影响可能与光受体精确调节系统有关。

4.2 烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的其它问题

在本实验中我们发现在黑暗条件的有的瓶中的个别的小苗长得较其他的芽或苗长得多。在营养比较丰富的情况下，分化的比较快和早的芽或苗成长得非常快，也非常大（相对于其他的芽和苗），植株在早期生长非常快，很短的时间差异都可能造成一定的差距，因此可能造成这个结果。然而在光照条件下的苗之间的差距并没有这么明显，这可能是因为在黑暗中生长的幼苗表现出典型的黄化现象。茎细长而柔弱，节间很长，机械组织不发达，叶小不开展，缺乏叶绿素，全株黄白色，根系发育不良。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而强度较弱的幼苗容易徒长[2]。

在本实验中，有一块光照条件下培养下的愈伤组织发生了褐化。褐化是植物组培过程中常见的问题，它是由于组织受伤后，酚类物质被氧化形成多酚氧化物所致，高浓度的细胞分裂素会加深褐化的程度[11]。而愈伤组织诱导的培养基中一般都含有细胞分裂素。影响褐化的因素有很多，光照、温度、培养基、外植体、激素浓度和比例以及及附加成份等都对褐化的发生有一定影响[12]。可以通过减少光照，降低培养温度，调整蔗糖和激素浓度，添加活性碳和抗氧化剂等方法防止或减低褐化现象的发生[13]。这些方一般结合使用效果比较明显。

外植体对诱导愈伤组织形成和调控愈伤组织分化也有重要影响。外植体来自不同植物、同一植物的不同种类或者同种植物不同品种（基因型）都对培养效果有重大影响。外植体对诱导反应及其再生能力的影响还体现在生理状态上。来源于生长活跃或生长潜力大的组织、器官的细胞更有利于培养。外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，而且有时甚至影响分化的程度和器官类型。因此在取外植体时必须小心谨慎，要注意所取的外植体的部位和大小，是否有损伤等异常情况。

致谢：

诚挚感谢柳俊教授和谢从华教授的悉心教导和谆谆教诲！感谢朱青老师的悉心指导！感谢叶荣建同学和龙湍同学提供有关资料！

参考文献：

[1] 罗立新,潘力,郑穗平. 细胞工程. 华南理工出版社,2003.1, 4-6

[2] 朱建华,彭士勇. 植物组织培养实用技术. 中国计量出版社,2002.1,62-66:18-19

[3] 朱至清 , 植物细胞工程 , 化学工业出版社 , 2003.5 , 173-175

[4] 李浚明 , 植物组织培养教程 ,中国农业大学出版社 ,1992.5 ,1-4

[5] 夏镇澳 , 植物原生质体培养和细胞杂交研究的进展 , 植物生理生化进展 ,

1987,5：36-53

[6] 周云龙 , 植物生物学 ,高等教育出版社 ,1999.9 , 288-290

[7] 许智宏 , 植物原生质体培养研究的进展 , 植物生理生化进展 ,1986 ,4：15-3 [8] 翟中和 , 王喜忠 , 丁明孝 ,细胞生物学 , 高等教育出版社,2000,240-244

[9] 潘战生,陈暨耀,蔡怀新,张丕方,宋庆梅,烟草叶组织培养中光与激素对形态发

生的调节作用,实验生物学报,1989,22（3）：279~285

[10] Seibert , M..P. J. Wetherbee and D. D. Job , 1975 , The effects of light intensity

and spectral quality on growth and initiation in tobacco callus. Plant physiol .56 : 103~139

[11] 王荔,杨艳琼,杨德,李本逊,不同激素浓度及培养基对烟草愈伤组织分化的影

响,云南农业大学学报,1999, 14（4）：371~375[12] 徐振彪等 , 植物组织步养过程中的褐化现象 ,国外农学 ,1997 ,（1）,55~56

[13] 汪秀峰 , 植物组织培养“抗褐”之初探 ,安徽农业科学 ,1999 ,27(4)：

325~326

烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生

朱健 01级生物技术（1）班 200113712 王宇 01级生物技术（1）班 200113724 孙亮 01级生物技术（1）班 200113703

摘要： 烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的实验结果表明：光照对于愈伤组

织的诱导没有特别明显的影响，而对组织的分化和植株再生有一定的影响。

将2mm2左右的烟草叶片接种到MS + BA 2.0 mg/ L + NAA2.0mg/

L 的培养基中分光照和黑暗两种条件分别诱导愈伤组织。2周后，将愈伤组织按类型转到MS + BA 2.0 mg/ L + NAA 0.5mg/ L培养基中光照培养，3周后长出烟草幼芽。关键词：愈伤组织 诱导 光照 分化

Regeneration of Tobacco Plant based on Inducement of

Callosity from Leaf

Abstract : the experiment of regeneration of tobacco plant based on inducement of

callosity from leaf show that light have less effect on the inducement of callosity fromleaf ,but have more effect on the differentiation of bud.

2 mm2 tobacco leaf discs were inoculated on MS medium supplemented with BA(2.0 mg/L) and NAA(2.0 mg/L).Then induce the callosity , one group in light and theother group in darkness . After two weeks , culture the callosity on MS mediumsupplemented with BA(2.0 mg/L) and NAA(0.5 mg/L) in light . after three weeks itwill produce the bud.

Key Words : callosity, inducement ; light ;differentiation.

1.前言:细胞工程是应用细胞生物学的方法，有计划地改变细胞遗传物质并使之

增殖，从而生产有用的产物或引向成体化的综合科学技术[1]。在植物细胞、组织和器官培养中，主要目标是诱导愈伤组织形成和形态发生，使一个细胞、一个组织或一个器官的细胞通过脱分化形成愈伤组

[2]

织，并再分化成植株。为了获得用于细胞大量培养的培养物，要从植物不同的部位诱导生长旺盛的愈伤组织[3]。所谓愈伤组织原是指植物在受伤后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中则指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞[4]。目前组织培养中能重复地形成愈伤组织和再生植株的一般限于从活跃分生组织部分而来的外植体，如不成熟的幼胚、幼叶和幼花序，叶肉组织是一般常用的起始材料[5]。得

到愈伤组织以后，在愈伤组织继代培养时需要通过改进培养基和调整培养温度与光照对培养条件进行优化，以获取最大的生物量和有用成分的产率。

烟草是植物组织培养的四大典型实验植物之一，也是一种重要的经济作物，在国民经济发展中起着重要的作用。目前，通过烟草的花药培养，原生质体培养，以及烟草叶组织培养已经成功获得烟草的体外再生植株。烟草组织培养技术的成熟，为烟草的快速繁殖和新品种的筛选打下了坚实的基础。

本实验通过对烟草叶片愈伤组织的诱导与植株再生，来认识和掌握诱导植物愈伤组织的诱导培养技术和调控条件，了解器官分化和植株再生的过程。

2 材料与方法

2.1培养基

愈伤组织诱导培养基：MS + BA 2.0 mg/ L + NAA2.0mg/ L+Sucrose20g/L+Agar 7g/L；分化培养基：MS + BA 2.0 mg/ L + NAA 0.5mg/ LSucrose 20g/L+Agar 7g/L 。将以上培养基用0.5N NaOH与0.5N HCl调整pH 调至5.8~6.0 ，在高压灭菌锅中121 ºC，1.1kg/cm2条件下恒温灭菌20 min备用。

2.2 烟草无菌试管苗（由老师提供）

将烟草种子用消毒液84#消毒后，以无菌水洗3次，无菌吸水纸吸干水分，然后接种在MS培养基上。种子苗具4~5叶时继代扩繁备用。

2.3 烟草叶片愈伤诱导

消毒后，在超净工作台上夹取上述烟草无菌试管苗幼嫩叶片2mm2

左右并接种到愈伤组织诱导培养基上，每瓶接5片，共接种18瓶，快速封口后顺次将其编为1~18号。将接种后的三角瓶置于24ºC条件下黑暗培养一周，然后在同样温度下把1~9号瓶放在光照条件下培养，10~18号瓶放在黑暗条件下培养，直至愈伤组织形成。

注意在夹取外植体时动作要快，也要注意在对镊子高温消毒后要适当冷却，否则会造成外植体失水或者烫伤而影响生长。并且要严格进行无菌操作。

2.4 烟草植株的再生

将上述愈伤组织按类型顺次转到分化培养基上，接种18瓶，20~22

件下连续光照培养3~4周，直到长出芽。

条

3 结果与分析

3.1 愈伤组织诱导

诱导出的愈伤组织呈不规则细胞团，大小不一。光照条件下培养的愈伤组织呈绿色或黄绿色，体积较大；暗条件下培养的愈伤组织呈乳白色或浅黄色，体积较小。在光照和黑暗条件下诱导的愈伤组织均无感染发生，诱导率都在80-100%。见下表。

表1 烟草叶片愈伤组织诱导情况

3.2器官分化与植株再生

分化培养基上培养3周后，每一样品几乎都出现了分化，但分化程

度不一。光照处理的愈伤组织体积明显变大并长出了芽和芽点，其中一部分已经分化出叶片；经过黑暗处理的愈伤组织体积也变大但是不如光照的明显，而且颜色也由乳白色或淡黄色变为浅绿色，有芽及绿色的芽点分化，但相对较少。从光培养和暗培养里各选出三瓶分化最多的，统计其数据，填入下表。

表2 烟草叶片愈伤组织再生植株情况

Tabel2 Regeneration of tobacco plantlet

编号

愈伤组织

分化率

来源（光、

（%）

暗）光光

100100

分化芽数4630

平均每个愈伤组织分化芽数

9.27.5

分化芽状态已分化出小苗，且绿色芽点较多

已分化出小芽，深绿色芽点，1块褐化

已分化出小芽，深绿色芽点，1棵小苗

浅绿色愈伤，小芽较少，深绿色芽点，无小苗

浅绿色愈伤，深绿色芽点

浅绿色愈伤，分化出小芽，深绿色芽点，1棵小苗

污染率（%）

14

00

光

9

暗

121517

暗暗

80328

80184.5

000

100100

2720

5.44

3.3 两种类型愈伤组织分化能力差异显著性分析

3.3.1 愈伤组织诱导的差异显著性分析假设H：p=p，H：p≠p

光

光

光

光

暗

1

光

暗

n=44，x=42 ，p=95.45%n=44，x=43 ，p=97.73%

对水平α=0.01作双侧检验，u=2.58

α/2

暗

暗

暗

p

平均

= （x+ x）/（n+n）=0.9659，q

光

暗

光暗光暗平均

=0.0341

σ=0.386

Uc= (p-p)/ p平均=-0.6686

| Uc |=0.6686＜u=2.58，故接纳H，拒绝H，即光照培养和黑暗条件下培养的愈伤组织的诱导率无明显差异

α/2

1

3.3.2平均每个愈伤组织分化芽数的差异显著性分析假设：H0是没有显著差异的

因此，在α=0.01的显著水平下拒绝原假设，故认为光照培养和黑暗处理的愈伤组织在芽的诱导上有极显著的差异。

4 讨论

诱导愈伤组织形成和调控愈伤组织分化的因素是多方面的，而光照是诱导

愈伤组织形成和调控愈伤组织分化的重要因素。在不同的光照条件下，愈伤的诱导和分化情况有很大差别。

4.1 光照在愈伤诱导与植株再生过程中的作用

在光照条件下诱导的愈伤组织体积大而疏松，在黑暗条件下诱导的愈伤组织体积小而致密。而且在光照条件下诱导的愈伤组织的颜色较深，为绿色和黄绿色，而在黑暗条件下诱导的愈伤组织则颜色较浅，为浅黄和乳白色。接受光照的愈伤组织分化的比在黑暗条件的愈伤组织快，而对于愈伤组织的诱导并没有太明显的差别。这可能是因为在培养条件下，光照的作用更大程度上是调节细胞的分化状态，而不是合成光合产物。这一点在接下来的植株再生情况中可以得到证明：在相同条件下，1~3号瓶（光照条件下）中的愈伤组织出芽率明显高于4~6号瓶（黑暗条件下）中的愈伤组织，而两种条件下愈伤组织诱导率并没有太明显的差距。而4~6号瓶中的愈伤组织在转到光下培养以后，由乳白色变为浅绿色，说明产生了叶绿体，这是细胞分化的一个标志。

光照可以促进组织的分化和植物的正常形态的建成[6]。颜季琼等（1982）发现烟草叶肉原生质体壁的再生率在光下最高，达到60-76%[7]。光照对植物的叶绿体的形成有重要的作用，在个体发育中，叶绿体是由前质体分化而来。前质体的进一步发育主要与光照条件有关。在光照条件下，形成基质类囊体和光合色素，前质体即发育成叶绿体。在黑暗条件下，前质体形成前片层体。具有这种结构的质体称为白色体或黄化质体，一般颜色为白色或黄色，当白色体重新受到光照后，前片层体弥散，发育而形成具有正常机构和功能的叶绿体[8]。

愈伤组织在分化形成芽和整个小苗的过程中对光照有一定的需求，除了对叶绿体等细胞器的形成有重要作用外，还与其他的因素有关，比

如与激素之间的相互影响和作用。光照对器官发生的调节可能与调节培养物的内源激素平衡有关。潘战生等研究了光效应与激素作用之间的关系后认为：光效应与激素作用的效应不是简单相加，而是相互影响的。这具体体现在激素浓度低时，蓝光外其他波长的光对愈伤组织生长均有明显的促进作用；而在激素浓度高时，蓝光外其他波段的光对组织的作用甚微，这可能是被激素的效应所掩盖。在不改变光照条件时，激素的作用与两类激素的浓度比例有关。而用不同波段的光照时，则显示出光的作用的光谱特征还与激素浓度绝对值有关[9]。光照还可能影响生长素的信号转导系统，调整生长素的极性运输，从而引起器官分化。

组织培养中光照是重要的条件之一，主要表现在光强、光质和光照时间方面。光照时间对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，对外植体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而强度较弱的幼苗容易徒长。光质对愈伤组织诱导、培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响[2]，。Seibert等在烟草叶组织培养中发现蓝光和近紫外光有促进芽的发生和愈伤组织增重的作用[10]。光质对器官分化的影响可能与光受体精确调节系统有关。

4.2 烟草叶片愈伤组织诱导与植株再生的其它问题

在本实验中我们发现在黑暗条件的有的瓶中的个别的小苗长得较其他的芽或苗长得多。在营养比较丰富的情况下，分化的比较快和早的芽或苗成长得非常快，也非常大（相对于其他的芽和苗），植株在早期生长非常快，很短的时间差异都可能造成一定的差距，因此可能造成这个结果。然而在光照条件下的苗之间的差距并没有这么明显，这可能是因为在黑暗中生长的幼苗表现出典型的黄化现象。茎细长而柔弱，节间很长，机械组织不发达，叶小不开展，缺乏叶绿素，全株黄白色，根系发育不良。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而强度较弱的幼苗容易徒长[2]。

在本实验中，有一块光照条件下培养下的愈伤组织发生了褐化。褐化是植物组培过程中常见的问题，它是由于组织受伤后，酚类物质被氧化形成多酚氧化物所致，高浓度的细胞分裂素会加深褐化的程度[11]。而愈伤组织诱导的培养基中一般都含有细胞分裂素。影响褐化的因素有很多，光照、温度、培养基、外植体、激素浓度和比例以及及附加成份等都对褐化的发生有一定影响[12]。可以通过减少光照，降低培养温度，调整蔗糖和激素浓度，添加活性碳和抗氧化剂等方法防止或减低褐化现象的发生[13]。这些方一般结合使用效果比较明显。

外植体对诱导愈伤组织形成和调控愈伤组织分化也有重要影响。外植体来自不同植物、同一植物的不同种类或者同种植物不同品种（基因型）都对培养效果有重大影响。外植体对诱导反应及其再生能力的影响还体现在生理状态上。来源于生长活跃或生长潜力大的组织、器官的细胞更有利于培养。外植体选取合理与否，不仅影响培养的难易，而且有时甚至影响分化的程度和器官类型。因此在取外植体时必须小心谨慎，要注意所取的外植体的部位和大小，是否有损伤等异常情况。

致谢：

诚挚感谢柳俊教授和谢从华教授的悉心教导和谆谆教诲！感谢朱青老师的悉心指导！感谢叶荣建同学和龙湍同学提供有关资料！

参考文献：

[1] 罗立新,潘力,郑穗平. 细胞工程. 华南理工出版社,2003.1, 4-6

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