各种溶液的配制基础公式
最终摩尔浓度 = 最初摩尔浓度/ 稀释倍数 稀释倍数 = 稀释后液体总量 / 需稀释液体量。
最初摩尔浓度 ³ 需稀释液体量 最终摩尔浓度 稀释后液体总量
例如，需稀释液体量 0.1ml, 浓度为1mmol/L, 最终稀释总量 4 ml , 最终的浓度0.025mmol/L 以配1000ml 液体为例, g = 分子量 * 摩尔浓度(M)(或mmol/1000)
配50ml 0.1mmol/L CaCl2为例 g = 147 * 0.5/1000 / 20(1000/50) 0.003675g 0.3mol/L 甘露醇 g = 182.2 * 0.3 /20(1000/50) 2.733g 或
X = 分子量 ³ 摩尔浓度（mol/L ）/ （ 1000/ 需要量） X = 分子量 ³ 摩尔浓度（mmol/L ）/1000 /（ 1000/ 需要量）
各种浓缩液的配制
1.FSH 浓缩液
FSH（中科院）规格10mg/瓶，用10ml水稀释，即1mg/ml。分装规格：250μl/管（即浓缩液），配50ml OM液时，加入浓缩液1管，即5μg/ml。
2．LH浓缩液
LH（宁波）规格200IU/管， 用2ml 水稀释，分装成8管。分装规格：25IU/管（即浓缩液）。配50ml OM液时，加入浓缩液2管，即0.5IU/ml。 3．17β-E2浓缩液
E2 2.5mg 溶于100μl 乙醇, 然后用25ml水稀释，分装成25管，分装规格：100μg/ml/管（浓缩液）。临用前，再分装成500μl/管，配50ml OM液时，加入浓缩液1管。 4．HMG浓缩液
HMG（ ），含有FSH / LH 75IU。用10ml无离子水稀释。7.5IU/ml/管(即浓缩液)。如配100ml OM时加入1管（1ml），即终浓度0.075IU/ml 。
5．Ca、Mg离子浓缩液
PBS（200ml）用Ca、Mg离子浓缩液100ml：称取CaCI2.2H2O 2.64g(100³)、MgCI2.6H2O 2g（100³），溶于100ml水中，0.0264g + 0.02g/ml CaCI2.2H2O/MgCI2.6H2O(浓缩液)。分装规格: 1ml/管。
PBS（200ml）用Ca、Mg离子浓缩液25ml：称取CaCI2.2H2O 0.66g(100³)、MgCI2.6H2O 0.5g（100³），溶于25ml水中，0.0264g + 0.02g/ml CaCI2.2H2O/MgCI2.6H2O(浓缩液)。分装规格: 1ml/管。配200ml PBS时，加入浓缩液1管。
SoF（50ml）用Ca、Mg离子浓缩液100ml：称取CaCI2.2H2O 1.26g(100³)、MgCI2.6H2O 0.5g（100³），溶于100ml水中，0.0126g + 0.005g/ml CaCI2.2H2O/MgCI2.6H2O(浓缩液)。分装规格: 1ml/管。
SoF（50ml）用Ca、Mg离子浓缩液25ml：称取CaCI2.2H2O 0.315g(100³)、MgCI2.6H2O 0.125g（100³），溶于25ml水中，0.0126g + 0.005g/ml CaCI2.2H2O/MgCI2.6H2O(浓缩液)。分装规格: 1ml/管。配50ml SoF 液时，加入浓缩液1管。配100ml SoF 液时，加入浓缩液2管
6．200 mM Glutamine （100³）浓缩液 Glutamine 2.922g 溶于100ml 水中。
7．0.05%胰蛋白酶 – 0.53mmol/L EDTA•4Na混合消化液 0.05%胰蛋白酶 0.5g EDTA•4Na 0.2g
PBS（无Ca2+，Mg2+ ）加 1L (1000ml),过滤除菌,分装小瓶,2-5ml/瓶,-20℃保存。 8．0.25%胰蛋白酶 — 0.004% EDTA混合消化液
称取胰蛋白酶粉末0.5g（1：250）和EDTA 0.08g ，先用少量PBS（无Ca2+，Mg2+ ）中，常温搅拌，彻底溶解，然后在补足PBS（无Ca2+，Mg2+ ）加至200ml，用0.22um滤膜过滤分装,-20℃保存(一次用完不宜反复冻溶)
9．0.25％胰蛋白酶 一0.02％EDTA混合消化液
胰蛋白酶(Trypsin)粉 （1：250） 0.25g EDTA粉 0.02g
0.01mol／L PBS 100ml
先用少量PBS（无Ca，Mg ）溶解胰蛋白酶，然后将EDTA粉末和剩下的液体加入混合，置37℃水浴中1小时左右(待彻底溶解，液体呈透明为止)，用G5抽滤，分装置4℃冰箱中保存。
10．A23187（IA）
A．1mmol/L浓缩液： 取1mg IA 用1.9ml DMSO 或DMSO/乙醇混合液溶解为1mmol/L浓缩液。应用时，用纯净水或培养液（无BSA）稀释后使用。
B．TCM-199 + 15mmol/L Hepes + 0.168mg/ml NaHCO3 + 5umol/L A23187 信息 IA 激活用无Ca11．6-DMAP（2mM）
取0.0326g 6-D 溶于500ｕl DMSO 中，即为浓缩液，浓缩液再分装成50ｕl 冻存。需要时50ｕl 6-D 浓缩液中加入10ml SoF 液 ，再分装成400ｕl，即工作液。
12．Ion(5μM)
用DMSO溶解（2mg/ml），18.7μl Ionomycin , 加入到10ml SoF液，再分装成400ｕl，即工作液。
13. 0.1%透明质酸酶
用PBS（无Ca Mg）配制。30ml PBS ，加入0.03g Hy。 13．CCB
50ｕl CB ,加入20ml PBS , 即操作液。 14．1M MgSO4 Stock
24.074 g MgSO4，distilled water to 200 ml，store at room temperature.
2+
2+
2+
2+
2+
培养液，获得更多的卵母细胞激活。
15. 1 M HEPES, pH = 7.0 Stock
119.15 g HEPES (free acid)，distilled water to 400 ml ，add solid NaOH a few pellets at a time while mixing until the pH is ~6.8 ，add concentrated NaOH dropwise to achieve pH = 7.0 ，distilled water to 500 ml，sterile filter and store at 4oC.
16. 0.5 M EDTA Stock
16.81 g EDTA (Sodium Salt) ，distilled water to 90 ml，Adjust pH to 7.0 ，Distilled water 100 ml Store at room temperature.
17. 10 M NaOH Stock
40 g NaOH , distilled water to 100 ml , store at room temperature.
18. 0.05 M CaCl2
(per 200 ml), CaCl2·2 H2O 1.5 g ,Add 198 ml water. Autoclave. 0.5 M CaCl2
(per 200 ml) , CaCl2·2 H2O 0.1 M MgSO4
15.0 g ,Add 188 ml water. Autoclave.
(per 200 ml) , MgSO4 (anhydrous) 2.4 g, Add 200 ml water. Autoclave. 21. 40% Glucose
(per 200 ml) , Glucose(dextrose)80.0 g, Add water to 200 ml(~145-150 ml).Autoclave. 22. 2% Gelatin (per 500 ml) Gelatin 23. 10 mM EDTA
For example, for 10 mM EDTA, multiply 292.24 X 0.010 to obtain 2.92 grams of EDTA per liter
24. Ca
/Mg
free Phos phate buffered saline - 10X (10X PBSA)
10 g , Add 500 ml water. Autoclave.
Dissolve 80 grams of NaCl, 2.0 grams of KCl, 15.0 grams of Dibasic sodium phosphate and 2.0 grams of Monobasic potassium phosphate (KHPO MW 136.09) in 1 liter of distilled water. This makes a 10X solution of Ca/Mg use. Store in a refrige rator.
25. Sodium bicarbonate (NaHCO MW 84.0)
0.1 M Dissolve 0.84 grams of NaHCO to a final volume of 100 ml with water or buffer
free phosphate buffered saline. Dilute 1:10 prior to
26. 1mol/LMgCl2:
溶解20.3g MgCl2²6H2O于足量的水中，定容到100ml。 27.100mmol/L PMSF
溶解174mg的PMSF（苯甲基磺酰氟）于足量的异丙醇中，定容到10ml。分成小份并用铝箔将装液管包裹或贮存于-20℃。
28. 卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml）
溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 29.氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）
溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
30.链霉素（streptomycin）（50mg/ml）
溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 31．5.6％NaHCO3溶液
称NaHCO35.6克，溶于100ml蒸馏水中，室温保存即可(如需要也可10磅15分钟高压灭菌，4℃冰箱保存)
32． VE浓缩液（100³）
1ml VE用50ul 0.05%酒精溶解。取液1ml，再加OM液99ml，其终浓度为100umol/L。 33．Hanks液 1．原液甲
NaCl 160g KCl 8g MgSO4²7H2O 2g MgCI2²6H2O 2g 溶于800ml馏水中。
CaCl2(无水) 2.8g 溶于100ml蒸馏水中。
将两种液体混合后，加水至1000ml用滤纸滤过，再加2ml氯仿防腐，置4℃冰箱备用。 原液乙
Na2HPO4²12H2O 3.04g KH2PO4 1.2g 葡萄糖 20.0g
溶于800ml蒸馏水中，用滤纸过滤，然后加0.5％酚红80ml，再加水至1000ml，最后加入2ml氯仿防腐，置4℃冰箱备用。 2．使用液
甲乙两液各1份，双蒸水18份，混匀分装包扎好瓶口，经10磅15分钟高压灭菌后置4℃冰箱中保存。使用时用5.6％NaHCO3调pH值到所需要求。
34．1640培养液(含lO％小牛血清)
RPMI-1640粉 10.39g
双蒸水 加至1000ml
通入适量的C02气体，边通入CO2边慢慢搅拌，使其(呈透明)完全溶解。用NaHCO31.5克调pH值到7.2。
双抗1万u/ml 10ml 灭活小牛血清 110ml 混匀上述液体，立即用G6抽滤除菌分装，置4℃冰箱备用。 35．青、链霉素溶液
青霉素钠盐(40万u／瓶) 5瓶
链霉素(100万u／瓶) 2瓶
将两者溶于200ml 0.9％的无菌生理盐水，分装小瓶，-30℃保存。双抗在培养基中的终浓度为各lOOu为宜。
36．1M NaOH Stock
6.645g NaOH distilled water to 50 ml , store at room temperature.
37．上皮细胞培养
体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。 以表皮细胞为例，用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）
1、取材：取皮肤小块，切成0.5－1平方厘米小块。 2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。 3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。
4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。
5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。 6、反复吹打，制成悬液。
7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。
8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。
38．颗粒细胞单层的制备
IVM26h 卵母细胞 经透明质酸酶消化处理后将卵母细胞移出将酶液及颗粒细胞用 IVC 液离心 (1500rpm , 5min) 漂洗 3 次 用移卵针吸取少量颗粒细胞置于培养液滴中 5%CO2 38.6 饱和湿度培养 48h,以颗粒细胞贴壁生长过半者为宜 半换液备用
39．输卵管上皮细胞单层的制备
选有红体或新鲜黄体的卵巢 无菌条件下轻轻刮取输卵管内表面少量黏膜 IVC 培养液离心 1500rpm 5min, 洗涤 3 次 用移卵针吸取少量输卵管上皮置于培养液滴中 5%CO2 38.6 饱和湿度培养 48h,可见有输卵管上皮贴壁生长 并且有大量输卵管上皮细胞在液滴中悬浮生长 600ⅹ 倒置显微镜下观察 可见上皮表面大量纤毛鲜活地摆动 半换液备用
40．mSOF+SLG共培养
孤雌激活卵母细胞的体外培养 用 IVC 液将激活的卵母细胞洗涤三次 移入IVC 培养盘 15~20 个/滴 5%CO2 38.6, 饱和湿度进行培养 每 48h 半换液一次 48h 观察卵裂情况 并计算卵裂率 7~10 天观察囊胚,计算囊胚率。
将提前 48h 制备的输卵管上皮细胞单层用 mSOF 培养液半换液，并将需要共培养。二细胞以上的胚胎 用培养液漂洗三次后移入单层培养液滴进行培养 每 48h 半换液一次 并观察发育情况 41．TCM199+KL + mSOF+SLG 共培养
将卵裂的胚胎先置于 TCM199+KL共培养系统中发育至 8 细胞时，将其移入 mSOF+SLG 共培养系统中， 每 48h 半换液一次 并观察发育情况 。
42．细胞原代培养 原理
将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂
仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：胎鼠或新生鼠
试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒 操作步骤 胰酶消化法
1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。 4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 9、加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5³105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。 组织块直接培养法
自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。 注意事项
1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。 2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。 3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。 无菌操作的几个注意事项
1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。 4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。 6、吸溶液的吸管等不能混用。
41．1M NaOH溶液
配25ml 1M NaOH溶液的配制：称取NaOH 1g，溶于25ml 三蒸水中，即为1M NaOH，用于调节溶液的PH值。
42．1M HCI溶液
配25ml 1M HCI溶液的配制：
X = 分子量 ³ 摩尔浓度（mol/L ）³ 需要量 / 1000 X = 37.5 ³ 1M/L ³ 25ml / 1000ml
2
X = 0.9375 43.1.5mol Hepes
Hepes 36.0g, NaOH 3.3g , 加水至100ml。 44．2μg/ml EGF母液（曹鸿国）
100μg EGF 加入50ml （可根据需要量）纯净水，先向EGF管中加入0.5ml 水，吸出加入50 ml水中，再从50ml水中吸0.5ml水，如此反复多次，然后分装，即为2μg/ml 母液。 1ml（1管）EGF加入100ml 溶液中，其浓度为20ηg/ml 。 1ml（1管）EGF加入50ml 溶液中，其浓度为40ηg/ml。 5μg/ml EGF母液（李向臣）
称取BSA 0.0195g 充分溶于20ml超纯水中,然后再加入0.142g醋酸(10mmol)溶解后, 向100μg EGF管中加入0.5ml 水，吸出加入20 ml水中，再从20ml水中吸0.5ml水，如此反复多次，然后分装，即为5μg/ml 母液。
200μl（1管）EGF加入100ml 溶液中，其浓度为10ηg/ml 。 400μl（1管）EGF加入100ml 溶液中，其浓度为20ηg/ml。 45．0．25%胰蛋白酶
胰蛋白酶粉末（1：250） 0.25g PBS（无Ca2+，Mg2+ ） 100ml
先用少量PBS（无Ca，Mg ）中，常温搅拌，彻底溶解，液体呈透明为止，然后在补足PBS（无Ca2+，Mg2+ ）加至100ml，用0.22um滤膜过滤分装,-20℃保存(一次用完不宜反复冻溶)（一次用不完可在置4℃冰箱中保存）。
46．体外活体染色观察和活体染料
碱性活性染料（带正电荷） 噻嗪类（次甲基蓝 、甲苯胎蓝） 丫嗪类（中性红、 詹纳斯绿） 恶嗪类（亮焦油蓝、亮焦油柴）
三酚苯甲烷类（甲基柴、维克多利亚蓝） 工作液： 用PBS、生理盐水配制，配0.1%-0.03%的浓度。
47．孕酮（10μmol/L） 4℃冰箱中保存 第一储存液
孕酮 3.145mg
无水乙醇 10ml
第二储存液
第一储存液 0.05ml Hanks BSS 4.95ml
48.冻存液
DMEM 6ml DMSO 1.5ml
,
2+
2+
血清 2.5ml
49. TE液(100ml)
0.15%: T 150mg(0.15g) 0.02%: EDTA 20mg(0.02g)
加水至100ml。
50.蛋白酶K 浓缩液 蛋白酶K 5mg/250ml 20mg/ml
分装小管, 0.4ml 消化缓冲液中加250μl蛋白酶。蛋白酶K 1mg/ml浓度消化细胞，预计消化5小时。
51．消化缓冲液（10ml） PH：8.0
NaCI 100mmol/L 0.059g
Tirs 10mmol/L 10ml/Tirs.H EDTA 25mmol/L 0.0867g 0.1mg/ml 蛋白酶K 1mg/10ml SDS 0.05g
52.DMBA
0.2mg DMBA加入20ml 培养液,浓度为10μg/ml。
53．各试剂溶解性质
成分名称 溶剂 贮存液的浓度 ℃ 工作浓度 胰岛素 0.01mol/LHCL 2.5mg/mL 4 0.1-10ug/mL
-7
三碘甲腺原AA（Ts） 0.02mol/LNaoH 5*10mol/L -20 1-100pmol/L 氢化可的松 95%酒精 1*10-5mol/L 4 1*10-7 mol/L 雌激素 无水乙醇 100umol/L 4 1-10nmol/L EGF H2O 2 ug/mL -20℃ 1-100ng/ml IGF H2O 2 ug/mL -20℃ 1-100ng/ml
VC H2O 1mg/mL 4 10ug/mL
VE 丙酮 1mg/mL 4 10ug/mL VA 无水乙醇 5ug/mL -20℃避光 50 ng/ml 丁二胺 Hank，s 50mmol/L 4 10umol/L 亚油酸 无水乙醇 10-3mol/L -20℃ 10-5mol/L 去脂牛血清白蛋白 DMEM/F12 10-3mol/L -20℃ 10-5mol/L
54 D-PBS 配方-1
成份： g/100ml
NaCI 0.8000
KCI 0.0203
Na2HPO4 0.1152
KH2PO4 0.0203
Na-Py 0.0036
Glucose 0.1
BSA 0.2
CaCI2.2H2O 0.0134
MgCI2.2H2O 0.01
S/N 0.005
Phenolred 少许 PH:
配法：
注意: CacL2.2H2O和MgCI2²2H2O单独溶解后缓慢倒入。
55 PBS 配方-1 成份： g/100ml
NaCI 0.80
KCI 0.020
Na2HPO4 0.115
KH2PO4 0.020
Na-Py 0.0036
Glucose 0.1
Heperin 0.001
CaCI2.2H2O 0.0132
MgCI2.6H2O 0.01
S/N 0.005
Phenolred little
NCS 2% PH:
配法：
注意: 1. CacL2.2H2O和MgCI2²6H2O单独溶解后缓慢倒入。
2．定量(如100ml)后弃2.0ml 无离子水。
评价:
56 PBS（无Ca Mg2+2+ ） 配方-1 成份： g/100ml
NaCI 0.8000
KCI 0.020
Na2HPO4(无水) 0.115
KH2PO4 0.020
PH:
配法：
注意:
1.Na2HPO4²7H2O 0.216g
2.加不加下列成份?
Na-Py 0.0036
Glucose 0.1
S/N 0.005
Phenolred 少许
NCS 2%
评价:
57 M199基础液 配方-1 成份： g/100ml
TCM199 0.95
NaHCO3 0.22
Hepes 0.2384
Na-Py 0.022
Pencillin 0.0075
Strepotomycin 0.005 PH:
58 OM(绵羊用) 配方-1 成份： g/100ml
TCM199 0.95
NaHCO3 0.22
Hepes 0.2384
Na-Py 0.022
Glutamine 0.003
FSH（5μg/ml） 2管 LH（0.5IU/ml） 4管
17β-E2 （1μg/ml） 1ml（分装）
S/N 0.005
Phenolred 少许
FBS 10ml PH: 配法：
注意: 1.此配方是目前使用的OM液配方。
2.李雪锋的OM液配方中Na-Py 的浓度0.0042g/100ml。
评价:
59 OM(绵羊用) 配方-2 成份： g/100ml
TCM199 0.95
NaHCO3 0.22
Hepes 0.2384
Na-Py 0.022
Glutamine 0.003
HMG（0.075IU/ml） 1ml(分装)
17β-E2（1μg/ml） 1ml（分装）
S/N 0.005
Phenolred 少许
FBS 10ml PH: 配法：
注意:
评价:
60 SoFaa 配方-1 成份： g/100ml g/50ml
NaCI 0.6294 0.3147
KCI 0.0534 0.0267
KH2PO4 0.0162 0.0081
NaHCO3 0.2106 0.1053
Na-Py 0.0033 0.0017
L-Glutamine 0.0146 0.0073
BSA 0.8 0.4
CaCI2.2H2O 0.0251 0.0126
MgCI2²6H2O 0.01 0.005
BME amino acids 2ml 1ml
MEM amino acids 1ml 500μl
Sodium lactate 0.037(28.24ul) 0.018(14.12μl)
Pencillin 0.0075 0.00375
Strep 0.0050 0.0025
Phenolred 少许 少许 PH: 配法:
注意: 1. CacL2.2H2O和MgCI2²6H2O单独溶解后缓慢倒入。
2．定量后弃3.0285ml 无离子水。
61 融合液 配方-1 成份 mol/L g/50ml
甘露醇 0.3mol/L 2.733
CaCl2 0.5mmol/L 0.003675
MgSO4 0.1mmol/L 0.0006
HEPES 0.5mmol 0.0059
BSA 0.025
融合液 配方-2 成份 mol/L g/50ml
CaCl2 0.1mmol/L
MgSO4 0.1mmol/L
组氨酸 10mmol/L
肌醇 0.28mol/L
融合液 配方-3 成份 mol/L g/50ml
甘露醇 0.28mol/L
CaCl2 0.1mmol/L
MgSO4 0.1mmol/L
组氨酸 10mmol/L
配法：
注意:
评价:
62 DMEM (高糖) 配方-1 成份： g/200ml
DMEM 2.700
NaHCO3 0.740
S/N 0.01
FBS 20%
water 200ml PH:
DMEM 配方-2
成份： g/200ml
DMEM 2.0
NaHCO3 0.74
Hepes 0.24
S/N 0.01
FBS 20%
water 200ml PH: 配法：
评价:
注意: DMEM (高糖)中没有Hepes？
63 D/F12 配方-1 成份： g/100ml
D/F12 1. 5600
NaHCO3 0.1200
S/N 0.005
FBS 15%
water 100ml PH: 配法：
注意:
评价:
64 各试剂的分子量 成份：
NaCI 58.48 KCI 74.56 Na2HPO4•12H2O 358.14
KH2PO4 136.10
Na-Py 110.00 NaHCO3 84.02 CaCI2.2H2O 147.20
MgCI2.6H2O 203.30
MgSO4•7H2O 246.50
60%乳酸钠 112.10 乳酸钙.H2O 303.30 Hepes 238.30 Glucose 198.17 EDTA.Na2 372.20 牛碘酸 125.10 果糖 180.16 Glutamine 146.15 PMSF 174.2 Leupiptin 4
65 CR1 配方-1
成份： g/100ml g/50ml NaCI 0.67 0.3352 KCI 0.0231 0.0116 NaHCO3 0.2201 0.1101
半Ca 0.055 0.0278 L-Glutamine 0.015 0.0073
Na-Py 0.0022 0.0011 BSA 0.3 0.15 BME amino acids 2ml 1ml MEM amino acids 1ml 500μl S/N 0.005 0.0025 Phenolred 少许 少许
PH: 配法: 注意: 评价:
成份 NaCL KCL NaH2PO4 MgSO4 NaHCO3
Ca 1/2 Lactate
Na-Py D-葡萄糖 L-Glutamine (pen/strep)
Hepes V-BSA EAA(50) NEAA(100) Phenol-red FBS
CR1-BSA 0.64 0.038 0.012 0.0096 0.21 0.0546 0.0044 0.027 0.015 0.0015pg/ml
0.238 6mg/ml 2ml 1ml 少量
CR1-FBS 0.64 0.038 0.012 0.0096 0.21 0.0546 0.0044 0.1 0.015 0.005 3mg/ml 2ml 1ml 少量 5%-10%
PH: 配法: 注意: 评价:
成份 NaCl KCl NaHCO3 Ca 1/2 Lactate
Na-Py L-Glutamine
BSA EAA(50) NEAA(100)
(S/N) Phenol-red
(100ml) (40ml) (50ml)
0.67 0.0231 0.22 0.0545 0.0044 0.0146 0.3 2ml 1ml
0.005/0.005
little
0.268 0.00924 0.088 0.0218 0.00144 0.00584 0.12 0.8ml 0.4ml 0.002/0.002 little
0.335 0.0116 0.11 0.0273 0.0018 0.0073 0.15 1ml 0.5ml 0.0025/0.0025
little
PH: 7.2-7.6
配法: 注意:
1.下列试剂能添加? Hepes FBS D-葡萄糖 评价:
0.238 10% 0.027
成份 NaCl KCl NaHCO3 Ca 1/2 Lactate
Na-Py L-Glutamine MgCI2²6H2O K2HPO4 D-葡萄糖 BSA EAA(50) NEAA(100) (P/S) Phenol-red
(100ml) (20ml) (50ml)
0.64 0.0231 0.2201 0.0545 0.0022 0.0146 0.0163 0.0207 0.0297 0.6 2ml 1ml little little
0.128 0.0046 0.044 0.0109 0.0004 0.0029 0.0033 0.0041 0.0059 0.12 0.4ml 0.2ml
0.32 0.0116 0.1101 0.0273 0.0011 0.0073 0.0081 0.0104 0.0149 0.3 1ml 0.5ml
PH: 配法:
注意: FBS添加量分别为5ml,1ml,2.5ml 评价:
69 TALP基础液 配方-1
成份： g/100ml NaCI 0.675 KCI 0.03 NaHCO3 0.260 Na-Py 0.011 NaH2PO4(无水) 0.0048 Hepes 0.2400 CaCI2.2H2O 0.0295 MgCI2.6H2O 0.0150 L-glutamine 0.0375 S/N 0.0075/0.005 EDTA-Na 0.0180 Phenolred 少量
PH: 配法：
注意: 1. CacL2.2H2O和MgCI2²6H2O单独溶解后缓慢倒入。
2．NaH2PO4（无水） 0.0048/100ml 评价:
获能和受精液 配方-2
成份： 50ml 1．获能液
TALP基础液 50.0ml 咖啡因 0.022g Glucose 0.050
2.BO受精液
TALP基础液 50.0ml Heparin 0.005g BSA 0.25g
PH: 配法：
注意: 1. CacL2.2H2O和MgCI2²6H2O单独溶解后缓慢倒入。
70 Hank’s液 配方-1
成份： g/100ml NaCI 0.80 KCI 0.04 NaHCO3 0.035 KH2PO4 0.006g Glucose 0.1 MgCI2•6H2O 0.01 或CaCI2 0.014 MgSO4•7H2O 0.01
Phenolred 0.002
PH: 配法：
注意：Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。
D-Hank’s液 配方-2
成份： g/500ml NaCI 4.0 KCI 0.2 NaHCO3 0.175 KH2PO4 0.03g
Na2HPO4(无水) 0.04275 或Na2HPO4•7H2O 0.045
Phenolred little
PH:
注意：
1.Na2HPO4•7H2O 0.045
2.配TE用
71 几种胚胎培养液和缓冲液的成分含量
g/L
成份： Whitfen M16 M2 NaCI 5.14 5.533 5.533 KCI 0.36 0.356 0.356 KH2PO4 0.16 0.162 0.162 NaHCO3 1.9 2.101 0.349 MgSO4²7H2O 0.29 0.293 0.293 CaCI2 0.190 0.190 Hepes 4.969 乳酸钙²5H2O 0.53
Na-Py 0.035 0.036 0.036 乳酸钠(60%) 3.70ml 3.11ml 3.11ml Glucose 1.0 1.0 1.0 BSA 3.0 4.0 4.0 Pencillin 0.08 0.06 0.06
Strep 0.05 0.05 0.05
Phenolred 少许 少许
PH: 配法:
注意: 1. CacL2.2H2O和MgCI2²6H2O单独溶解后缓慢倒入。 2．定量后弃3.0285ml 无离子水。
72．Insulin 浓缩液
称取BSA 0.0242g 充分溶于20ml超纯水中,然后再加入300μl醋酸（液体醋酸), 向500mg Insulin管中加入0.5ml 水，吸出加入25 ml水中，再从25ml水中吸0.5ml水，如此反复多次，然后分装，即为20mg/ml 母液。
100μl（1小管）Insulin加入100ml 溶液中，其浓度为20μg/ml 。 400μl（1大管）Insulin加入100ml 溶液中，其浓度为80μg/ml。
细胞冷冻
我们用90％的血清＋5％DMSO＋5％培养基，细胞复苏很容易，绝大部分细胞存活。
细胞融合
细胞融合时操作要快，尽量少的刺激细胞。融合时的离心转数一定要控制在800转每分以下。我们融合的时候使用的PEG1000，50%，再加少量的DMSO。我们融合时sp2/0跟要融合的细胞数之比为10 的8次方比上10 的7次方。用的是PEG1500，离心速度1000转每分，对融合有影响吗。 线粒体的分离方法：
匀浆细胞或加lysii buffer（配方从网上找），吹打，然后480g 离心5分钟，取上清，再10000g离心10分钟得到沉淀即线粒体。 我们的方法是：
刮下细胞后离心沉淀细胞，用BUFFER重悬细胞，放冰上30min，匀浆100次，1000G离心10min，取上清，在10000G离心10min,沉淀即为线粒体。 细胞核提取
1．取制备血管细胞悬液放于试管中，加五倍体积缓冲液（10mmol/l Tris HCL,pH7.4含10mol/L NaCl,1.5mmol/L Mgcl2），加1%SDS10 μl用匀浆器轻轻匀浆。
2． 加蔗糖液（0.34mol/L,蔗糖10mol/L MgCl2）2份再匀浆1次，下面铺一层0.88mol/L蔗糖，800g离心5min，收集沉淀部分。
3．在0.88mol/L蔗糖液中再纯化1次，然后将细胞悬于10ml蔗糖液(0.34mol/L0.05mmol.LMgCl2)液中，用超声波处理10S。
4．将两倍体积的0.88mol/L蔗糖加于上述处理液中，800g离心30min收集沉淀部分。 5．将沉淀加入0.88mol/L蔗糖，5kg离心1h，沉淀部分为细胞核，将其保存于0.25mol/L蔗糖，0.55mmol/LMgCl中备用。 细胞膜的提取
1．取一定量酶处理的细胞，用匀浆器破碎，操作要温和，使细胞膜保持完整。由于水与膜的疏水部分之间有反应，因此要精确掌握分离介质中的离心强度和渗透压，以每克细胞湿重加40ml介质。 2．用Potter-Elvehiem匀浆器，杆与壁间间隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下匀浆4～6次，每次5S。
3．过滤匀浆液，150g离心10min，保留上清，沉淀部分加入50μl介质，用匀浆器1kr/min匀浆3次，150g离心10min，沉淀部分再加入上次匀浆的上清液。
4．合并3次上清液，2kg离心10min，弃上清，沉淀部分溶于100μl介质，离心10min，弃上清，留沉淀。
5．将沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分别置于三个离心管中，上面依次叠加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。
6．700kg离心90min，分离介质在1.16～1.18之间形成介面。
7．收集d为1.16～1.18g/ml之间的细胞膜，加30倍的介质以2.5kg离心10min，洗涤2次。 8．保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5缓冲液中，用于细胞膜的研究分析。 溶酶体的分离
1．在梯度混合器的两个小杯中分别加入2.1mol/L和1.1mol/L蔗糖（比例9：1）。 2．收集血管壁细胞，用特制匀浆器1kr/min匀浆10次。
3．以150g离心10min，上清液以同样条件离心1次，弃沉淀，上清液以9kg离心3min弃上清液，
4．沉淀分三种不同颜色，褐色为半纯化的溶酶体，中间黄褐色为线粒体部分，上层白色为膜成分混合物。首先小心吸取上层，然后加入0.3mol/L蔗糖数毫升，慢慢摇匀使界面层悬浮，再用0.3mol/L蔗糖洗1次。
5．将悬浮的半纯化溶酶体铺在梯度平面上，用玻棒搅匀最上层梯度液，使溶酶体和梯度液之间的介面破坏，然后以10kg离心15min，离心后可出现三条明显的区带及少许沉淀，最下面黄褐色为纯化的溶酶体，中间黄色的为线粒体。 线粒体的分离
1．浆分离的血管浸入缓冲液（250mmol/L甘露醇、0.5mmol/l EDTA、 5mmol/L Hepes、0.1%BSA、pH7.4）匀浆破碎细胞，600g离心5min，除去细胞核及碎片。 2．上清液在100kg离心10min，留取沉淀部分。
3．将沉淀部分悬浮于5ml操作1.的缓冲液中，加入5倍体积30%Percon、225mmol/L甘露醇、1mmol/L，EDTA、25mmol/L Hepes 0.1%BSA,5000g离心30min。
4．将上述沉淀溶于适量10mmol/L KH2PO4，pH7.4中，轻轻振荡15min。
5．加入10ml蔗糖液缓冲液（32%蔗糖、30%甘油、10mmol/l MgCl2、10mmol/L KH2PO4，pH7.4）振荡15min。
6．用BransonB-12超声波碎仪60～70W处理2次，每次15min，12kg离心10min。
7．将沉淀部分溶于10倍体积缓冲液中并铺于试管底层，试管中层铺成不连续蔗糖梯度（25.3%、37.9%和51.3%）蔗糖各4mm厚，上层铺上清液。
8．2kg离心3h，在25.3%/37.9%界面处为线粒体外膜，在51.3%蔗糖层分别回收内膜和基质。 细胞增殖的测定
细胞增殖的测定是采用常见的3H掺入法。简要地说，分别将EC和SMC用胰蛋白酶消化后，接种在96孔板中(10/孔)，加入含10%新生牛血清的DMEM培养液(100μl/孔)。细胞培养过夜后，类似于收集条件培养基一样，用无血清DMEM培养液连续冲洗4次。冲洗完成后，ECCM加入到SMC培养系统中。同理，SMCCM加入到EC培养系统中，细胞培养于微孔中，37℃条件下培养3天。所选择的培养时间是按Leszczynski等报导的
4
〔2〕
4
。在培养第3天之前的最后6个小时内，将〔H〕
3
-TdR(3.7kBq/10个细胞)分别加入到EC和SMC培养系统中。当培养期终止时，冲洗微孔中的细胞，在β计数器中收集并记数。 1.5 记数与统计分析
所有实验重复3次，其结果表示为±S，统计分析采用单因素方差分析，差异性显著(P＜0.05)。
各种溶液的配制基础公式
最终摩尔浓度 = 最初摩尔浓度/ 稀释倍数 稀释倍数 = 稀释后液体总量 / 需稀释液体量。
最初摩尔浓度 ³ 需稀释液体量 最终摩尔浓度 稀释后液体总量
例如，需稀释液体量 0.1ml, 浓度为1mmol/L, 最终稀释总量 4 ml , 最终的浓度0.025mmol/L 以配1000ml 液体为例, g = 分子量 * 摩尔浓度(M)(或mmol/1000)
配50ml 0.1mmol/L CaCl2为例 g = 147 * 0.5/1000 / 20(1000/50) 0.003675g 0.3mol/L 甘露醇 g = 182.2 * 0.3 /20(1000/50) 2.733g 或
X = 分子量 ³ 摩尔浓度（mol/L ）/ （ 1000/ 需要量） X = 分子量 ³ 摩尔浓度（mmol/L ）/1000 /（ 1000/ 需要量）
各种浓缩液的配制
1.FSH 浓缩液
FSH（中科院）规格10mg/瓶，用10ml水稀释，即1mg/ml。分装规格：250μl/管（即浓缩液），配50ml OM液时，加入浓缩液1管，即5μg/ml。
2．LH浓缩液
LH（宁波）规格200IU/管， 用2ml 水稀释，分装成8管。分装规格：25IU/管（即浓缩液）。配50ml OM液时，加入浓缩液2管，即0.5IU/ml。 3．17β-E2浓缩液
E2 2.5mg 溶于100μl 乙醇, 然后用25ml水稀释，分装成25管，分装规格：100μg/ml/管（浓缩液）。临用前，再分装成500μl/管，配50ml OM液时，加入浓缩液1管。 4．HMG浓缩液
HMG（ ），含有FSH / LH 75IU。用10ml无离子水稀释。7.5IU/ml/管(即浓缩液)。如配100ml OM时加入1管（1ml），即终浓度0.075IU/ml 。
5．Ca、Mg离子浓缩液
PBS（200ml）用Ca、Mg离子浓缩液100ml：称取CaCI2.2H2O 2.64g(100³)、MgCI2.6H2O 2g（100³），溶于100ml水中，0.0264g + 0.02g/ml CaCI2.2H2O/MgCI2.6H2O(浓缩液)。分装规格: 1ml/管。
PBS（200ml）用Ca、Mg离子浓缩液25ml：称取CaCI2.2H2O 0.66g(100³)、MgCI2.6H2O 0.5g（100³），溶于25ml水中，0.0264g + 0.02g/ml CaCI2.2H2O/MgCI2.6H2O(浓缩液)。分装规格: 1ml/管。配200ml PBS时，加入浓缩液1管。
SoF（50ml）用Ca、Mg离子浓缩液100ml：称取CaCI2.2H2O 1.26g(100³)、MgCI2.6H2O 0.5g（100³），溶于100ml水中，0.0126g + 0.005g/ml CaCI2.2H2O/MgCI2.6H2O(浓缩液)。分装规格: 1ml/管。
SoF（50ml）用Ca、Mg离子浓缩液25ml：称取CaCI2.2H2O 0.315g(100³)、MgCI2.6H2O 0.125g（100³），溶于25ml水中，0.0126g + 0.005g/ml CaCI2.2H2O/MgCI2.6H2O(浓缩液)。分装规格: 1ml/管。配50ml SoF 液时，加入浓缩液1管。配100ml SoF 液时，加入浓缩液2管
6．200 mM Glutamine （100³）浓缩液 Glutamine 2.922g 溶于100ml 水中。
7．0.05%胰蛋白酶 – 0.53mmol/L EDTA•4Na混合消化液 0.05%胰蛋白酶 0.5g EDTA•4Na 0.2g
PBS（无Ca2+，Mg2+ ）加 1L (1000ml),过滤除菌,分装小瓶,2-5ml/瓶,-20℃保存。 8．0.25%胰蛋白酶 — 0.004% EDTA混合消化液
称取胰蛋白酶粉末0.5g（1：250）和EDTA 0.08g ，先用少量PBS（无Ca2+，Mg2+ ）中，常温搅拌，彻底溶解，然后在补足PBS（无Ca2+，Mg2+ ）加至200ml，用0.22um滤膜过滤分装,-20℃保存(一次用完不宜反复冻溶)
9．0.25％胰蛋白酶 一0.02％EDTA混合消化液
胰蛋白酶(Trypsin)粉 （1：250） 0.25g EDTA粉 0.02g
0.01mol／L PBS 100ml
先用少量PBS（无Ca，Mg ）溶解胰蛋白酶，然后将EDTA粉末和剩下的液体加入混合，置37℃水浴中1小时左右(待彻底溶解，液体呈透明为止)，用G5抽滤，分装置4℃冰箱中保存。
10．A23187（IA）
A．1mmol/L浓缩液： 取1mg IA 用1.9ml DMSO 或DMSO/乙醇混合液溶解为1mmol/L浓缩液。应用时，用纯净水或培养液（无BSA）稀释后使用。
B．TCM-199 + 15mmol/L Hepes + 0.168mg/ml NaHCO3 + 5umol/L A23187 信息 IA 激活用无Ca11．6-DMAP（2mM）
取0.0326g 6-D 溶于500ｕl DMSO 中，即为浓缩液，浓缩液再分装成50ｕl 冻存。需要时50ｕl 6-D 浓缩液中加入10ml SoF 液 ，再分装成400ｕl，即工作液。
12．Ion(5μM)
用DMSO溶解（2mg/ml），18.7μl Ionomycin , 加入到10ml SoF液，再分装成400ｕl，即工作液。
13. 0.1%透明质酸酶
用PBS（无Ca Mg）配制。30ml PBS ，加入0.03g Hy。 13．CCB
50ｕl CB ,加入20ml PBS , 即操作液。 14．1M MgSO4 Stock
24.074 g MgSO4，distilled water to 200 ml，store at room temperature.
2+
2+
2+
2+
2+
培养液，获得更多的卵母细胞激活。
15. 1 M HEPES, pH = 7.0 Stock
119.15 g HEPES (free acid)，distilled water to 400 ml ，add solid NaOH a few pellets at a time while mixing until the pH is ~6.8 ，add concentrated NaOH dropwise to achieve pH = 7.0 ，distilled water to 500 ml，sterile filter and store at 4oC.
16. 0.5 M EDTA Stock
16.81 g EDTA (Sodium Salt) ，distilled water to 90 ml，Adjust pH to 7.0 ，Distilled water 100 ml Store at room temperature.
17. 10 M NaOH Stock
40 g NaOH , distilled water to 100 ml , store at room temperature.
18. 0.05 M CaCl2
(per 200 ml), CaCl2·2 H2O 1.5 g ,Add 198 ml water. Autoclave. 0.5 M CaCl2
(per 200 ml) , CaCl2·2 H2O 0.1 M MgSO4
15.0 g ,Add 188 ml water. Autoclave.
(per 200 ml) , MgSO4 (anhydrous) 2.4 g, Add 200 ml water. Autoclave. 21. 40% Glucose
(per 200 ml) , Glucose(dextrose)80.0 g, Add water to 200 ml(~145-150 ml).Autoclave. 22. 2% Gelatin (per 500 ml) Gelatin 23. 10 mM EDTA
For example, for 10 mM EDTA, multiply 292.24 X 0.010 to obtain 2.92 grams of EDTA per liter
24. Ca
/Mg
free Phos phate buffered saline - 10X (10X PBSA)
10 g , Add 500 ml water. Autoclave.
Dissolve 80 grams of NaCl, 2.0 grams of KCl, 15.0 grams of Dibasic sodium phosphate and 2.0 grams of Monobasic potassium phosphate (KHPO MW 136.09) in 1 liter of distilled water. This makes a 10X solution of Ca/Mg use. Store in a refrige rator.
25. Sodium bicarbonate (NaHCO MW 84.0)
0.1 M Dissolve 0.84 grams of NaHCO to a final volume of 100 ml with water or buffer
free phosphate buffered saline. Dilute 1:10 prior to
26. 1mol/LMgCl2:
溶解20.3g MgCl2²6H2O于足量的水中，定容到100ml。 27.100mmol/L PMSF
溶解174mg的PMSF（苯甲基磺酰氟）于足量的异丙醇中，定容到10ml。分成小份并用铝箔将装液管包裹或贮存于-20℃。
28. 卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml）
溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 29.氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）
溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
30.链霉素（streptomycin）（50mg/ml）
溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 31．5.6％NaHCO3溶液
称NaHCO35.6克，溶于100ml蒸馏水中，室温保存即可(如需要也可10磅15分钟高压灭菌，4℃冰箱保存)
32． VE浓缩液（100³）
1ml VE用50ul 0.05%酒精溶解。取液1ml，再加OM液99ml，其终浓度为100umol/L。 33．Hanks液 1．原液甲
NaCl 160g KCl 8g MgSO4²7H2O 2g MgCI2²6H2O 2g 溶于800ml馏水中。
CaCl2(无水) 2.8g 溶于100ml蒸馏水中。
将两种液体混合后，加水至1000ml用滤纸滤过，再加2ml氯仿防腐，置4℃冰箱备用。 原液乙
Na2HPO4²12H2O 3.04g KH2PO4 1.2g 葡萄糖 20.0g
溶于800ml蒸馏水中，用滤纸过滤，然后加0.5％酚红80ml，再加水至1000ml，最后加入2ml氯仿防腐，置4℃冰箱备用。 2．使用液
甲乙两液各1份，双蒸水18份，混匀分装包扎好瓶口，经10磅15分钟高压灭菌后置4℃冰箱中保存。使用时用5.6％NaHCO3调pH值到所需要求。
34．1640培养液(含lO％小牛血清)
RPMI-1640粉 10.39g
双蒸水 加至1000ml
通入适量的C02气体，边通入CO2边慢慢搅拌，使其(呈透明)完全溶解。用NaHCO31.5克调pH值到7.2。
双抗1万u/ml 10ml 灭活小牛血清 110ml 混匀上述液体，立即用G6抽滤除菌分装，置4℃冰箱备用。 35．青、链霉素溶液
青霉素钠盐(40万u／瓶) 5瓶
链霉素(100万u／瓶) 2瓶
将两者溶于200ml 0.9％的无菌生理盐水，分装小瓶，-30℃保存。双抗在培养基中的终浓度为各lOOu为宜。
36．1M NaOH Stock
6.645g NaOH distilled water to 50 ml , store at room temperature.
37．上皮细胞培养
体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮细胞生长。 以表皮细胞为例，用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）
1、取材：取皮肤小块，切成0.5－1平方厘米小块。 2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。 3、换入0.25%胰蛋白酶中，4℃过夜。
4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。
5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分钟。 6、反复吹打，制成悬液。
7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。
8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。
38．颗粒细胞单层的制备
IVM26h 卵母细胞 经透明质酸酶消化处理后将卵母细胞移出将酶液及颗粒细胞用 IVC 液离心 (1500rpm , 5min) 漂洗 3 次 用移卵针吸取少量颗粒细胞置于培养液滴中 5%CO2 38.6 饱和湿度培养 48h,以颗粒细胞贴壁生长过半者为宜 半换液备用
39．输卵管上皮细胞单层的制备
选有红体或新鲜黄体的卵巢 无菌条件下轻轻刮取输卵管内表面少量黏膜 IVC 培养液离心 1500rpm 5min, 洗涤 3 次 用移卵针吸取少量输卵管上皮置于培养液滴中 5%CO2 38.6 饱和湿度培养 48h,可见有输卵管上皮贴壁生长 并且有大量输卵管上皮细胞在液滴中悬浮生长 600ⅹ 倒置显微镜下观察 可见上皮表面大量纤毛鲜活地摆动 半换液备用
40．mSOF+SLG共培养
孤雌激活卵母细胞的体外培养 用 IVC 液将激活的卵母细胞洗涤三次 移入IVC 培养盘 15~20 个/滴 5%CO2 38.6, 饱和湿度进行培养 每 48h 半换液一次 48h 观察卵裂情况 并计算卵裂率 7~10 天观察囊胚,计算囊胚率。
将提前 48h 制备的输卵管上皮细胞单层用 mSOF 培养液半换液，并将需要共培养。二细胞以上的胚胎 用培养液漂洗三次后移入单层培养液滴进行培养 每 48h 半换液一次 并观察发育情况 41．TCM199+KL + mSOF+SLG 共培养
将卵裂的胚胎先置于 TCM199+KL共培养系统中发育至 8 细胞时，将其移入 mSOF+SLG 共培养系统中， 每 48h 半换液一次 并观察发育情况 。
42．细胞原代培养 原理
将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂
仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：胎鼠或新生鼠
试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒 操作步骤 胰酶消化法
1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。 4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 9、加入培养液l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5³105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。 组织块直接培养法
自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。 注意事项
1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。 2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。 3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。 无菌操作的几个注意事项
1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。试剂等瓶口也要擦试。 2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。 4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。 6、吸溶液的吸管等不能混用。
41．1M NaOH溶液
配25ml 1M NaOH溶液的配制：称取NaOH 1g，溶于25ml 三蒸水中，即为1M NaOH，用于调节溶液的PH值。
42．1M HCI溶液
配25ml 1M HCI溶液的配制：
X = 分子量 ³ 摩尔浓度（mol/L ）³ 需要量 / 1000 X = 37.5 ³ 1M/L ³ 25ml / 1000ml
2
X = 0.9375 43.1.5mol Hepes
Hepes 36.0g, NaOH 3.3g , 加水至100ml。 44．2μg/ml EGF母液（曹鸿国）
100μg EGF 加入50ml （可根据需要量）纯净水，先向EGF管中加入0.5ml 水，吸出加入50 ml水中，再从50ml水中吸0.5ml水，如此反复多次，然后分装，即为2μg/ml 母液。 1ml（1管）EGF加入100ml 溶液中，其浓度为20ηg/ml 。 1ml（1管）EGF加入50ml 溶液中，其浓度为40ηg/ml。 5μg/ml EGF母液（李向臣）
称取BSA 0.0195g 充分溶于20ml超纯水中,然后再加入0.142g醋酸(10mmol)溶解后, 向100μg EGF管中加入0.5ml 水，吸出加入20 ml水中，再从20ml水中吸0.5ml水，如此反复多次，然后分装，即为5μg/ml 母液。
200μl（1管）EGF加入100ml 溶液中，其浓度为10ηg/ml 。 400μl（1管）EGF加入100ml 溶液中，其浓度为20ηg/ml。 45．0．25%胰蛋白酶
胰蛋白酶粉末（1：250） 0.25g PBS（无Ca2+，Mg2+ ） 100ml
先用少量PBS（无Ca，Mg ）中，常温搅拌，彻底溶解，液体呈透明为止，然后在补足PBS（无Ca2+，Mg2+ ）加至100ml，用0.22um滤膜过滤分装,-20℃保存(一次用完不宜反复冻溶)（一次用不完可在置4℃冰箱中保存）。
46．体外活体染色观察和活体染料
碱性活性染料（带正电荷） 噻嗪类（次甲基蓝 、甲苯胎蓝） 丫嗪类（中性红、 詹纳斯绿） 恶嗪类（亮焦油蓝、亮焦油柴）
三酚苯甲烷类（甲基柴、维克多利亚蓝） 工作液： 用PBS、生理盐水配制，配0.1%-0.03%的浓度。
47．孕酮（10μmol/L） 4℃冰箱中保存 第一储存液
孕酮 3.145mg
无水乙醇 10ml
第二储存液
第一储存液 0.05ml Hanks BSS 4.95ml
48.冻存液
DMEM 6ml DMSO 1.5ml
,
2+
2+
血清 2.5ml
49. TE液(100ml)
0.15%: T 150mg(0.15g) 0.02%: EDTA 20mg(0.02g)
加水至100ml。
50.蛋白酶K 浓缩液 蛋白酶K 5mg/250ml 20mg/ml
分装小管, 0.4ml 消化缓冲液中加250μl蛋白酶。蛋白酶K 1mg/ml浓度消化细胞，预计消化5小时。
51．消化缓冲液（10ml） PH：8.0
NaCI 100mmol/L 0.059g
Tirs 10mmol/L 10ml/Tirs.H EDTA 25mmol/L 0.0867g 0.1mg/ml 蛋白酶K 1mg/10ml SDS 0.05g
52.DMBA
0.2mg DMBA加入20ml 培养液,浓度为10μg/ml。
53．各试剂溶解性质
成分名称 溶剂 贮存液的浓度 ℃ 工作浓度 胰岛素 0.01mol/LHCL 2.5mg/mL 4 0.1-10ug/mL
-7
三碘甲腺原AA（Ts） 0.02mol/LNaoH 5*10mol/L -20 1-100pmol/L 氢化可的松 95%酒精 1*10-5mol/L 4 1*10-7 mol/L 雌激素 无水乙醇 100umol/L 4 1-10nmol/L EGF H2O 2 ug/mL -20℃ 1-100ng/ml IGF H2O 2 ug/mL -20℃ 1-100ng/ml
VC H2O 1mg/mL 4 10ug/mL
VE 丙酮 1mg/mL 4 10ug/mL VA 无水乙醇 5ug/mL -20℃避光 50 ng/ml 丁二胺 Hank，s 50mmol/L 4 10umol/L 亚油酸 无水乙醇 10-3mol/L -20℃ 10-5mol/L 去脂牛血清白蛋白 DMEM/F12 10-3mol/L -20℃ 10-5mol/L
54 D-PBS 配方-1
成份： g/100ml
NaCI 0.8000
KCI 0.0203
Na2HPO4 0.1152
KH2PO4 0.0203
Na-Py 0.0036
Glucose 0.1
BSA 0.2
CaCI2.2H2O 0.0134
MgCI2.2H2O 0.01
S/N 0.005
Phenolred 少许 PH:
配法：
注意: CacL2.2H2O和MgCI2²2H2O单独溶解后缓慢倒入。
55 PBS 配方-1 成份： g/100ml
NaCI 0.80
KCI 0.020
Na2HPO4 0.115
KH2PO4 0.020
Na-Py 0.0036
Glucose 0.1
Heperin 0.001
CaCI2.2H2O 0.0132
MgCI2.6H2O 0.01
S/N 0.005
Phenolred little
NCS 2% PH:
配法：
注意: 1. CacL2.2H2O和MgCI2²6H2O单独溶解后缓慢倒入。
2．定量(如100ml)后弃2.0ml 无离子水。
评价:
56 PBS（无Ca Mg2+2+ ） 配方-1 成份： g/100ml
NaCI 0.8000
KCI 0.020
Na2HPO4(无水) 0.115
KH2PO4 0.020
PH:
配法：
注意:
1.Na2HPO4²7H2O 0.216g
2.加不加下列成份?
Na-Py 0.0036
Glucose 0.1
S/N 0.005
Phenolred 少许
NCS 2%
评价:
57 M199基础液 配方-1 成份： g/100ml
TCM199 0.95
NaHCO3 0.22
Hepes 0.2384
Na-Py 0.022
Pencillin 0.0075
Strepotomycin 0.005 PH:
58 OM(绵羊用) 配方-1 成份： g/100ml
TCM199 0.95
NaHCO3 0.22
Hepes 0.2384
Na-Py 0.022
Glutamine 0.003
FSH（5μg/ml） 2管 LH（0.5IU/ml） 4管
17β-E2 （1μg/ml） 1ml（分装）
S/N 0.005
Phenolred 少许
FBS 10ml PH: 配法：
注意: 1.此配方是目前使用的OM液配方。
2.李雪锋的OM液配方中Na-Py 的浓度0.0042g/100ml。
评价:
59 OM(绵羊用) 配方-2 成份： g/100ml
TCM199 0.95
NaHCO3 0.22
Hepes 0.2384
Na-Py 0.022
Glutamine 0.003
HMG（0.075IU/ml） 1ml(分装)
17β-E2（1μg/ml） 1ml（分装）
S/N 0.005
Phenolred 少许
FBS 10ml PH: 配法：
注意:
评价:
60 SoFaa 配方-1 成份： g/100ml g/50ml
NaCI 0.6294 0.3147
KCI 0.0534 0.0267
KH2PO4 0.0162 0.0081
NaHCO3 0.2106 0.1053
Na-Py 0.0033 0.0017
L-Glutamine 0.0146 0.0073
BSA 0.8 0.4
CaCI2.2H2O 0.0251 0.0126
MgCI2²6H2O 0.01 0.005
BME amino acids 2ml 1ml
MEM amino acids 1ml 500μl
Sodium lactate 0.037(28.24ul) 0.018(14.12μl)
Pencillin 0.0075 0.00375
Strep 0.0050 0.0025
Phenolred 少许 少许 PH: 配法:
注意: 1. CacL2.2H2O和MgCI2²6H2O单独溶解后缓慢倒入。
2．定量后弃3.0285ml 无离子水。
61 融合液 配方-1 成份 mol/L g/50ml
甘露醇 0.3mol/L 2.733
CaCl2 0.5mmol/L 0.003675
MgSO4 0.1mmol/L 0.0006
HEPES 0.5mmol 0.0059
BSA 0.025
融合液 配方-2 成份 mol/L g/50ml
CaCl2 0.1mmol/L
MgSO4 0.1mmol/L
组氨酸 10mmol/L
肌醇 0.28mol/L
融合液 配方-3 成份 mol/L g/50ml
甘露醇 0.28mol/L
CaCl2 0.1mmol/L
MgSO4 0.1mmol/L
组氨酸 10mmol/L
配法：
注意:
评价:
62 DMEM (高糖) 配方-1 成份： g/200ml
DMEM 2.700
NaHCO3 0.740
S/N 0.01
FBS 20%
water 200ml PH:
DMEM 配方-2
成份： g/200ml
DMEM 2.0
NaHCO3 0.74
Hepes 0.24
S/N 0.01
FBS 20%
water 200ml PH: 配法：
评价:
注意: DMEM (高糖)中没有Hepes？
63 D/F12 配方-1 成份： g/100ml
D/F12 1. 5600
NaHCO3 0.1200
S/N 0.005
FBS 15%
water 100ml PH: 配法：
注意:
评价:
64 各试剂的分子量 成份：
NaCI 58.48 KCI 74.56 Na2HPO4•12H2O 358.14
KH2PO4 136.10
Na-Py 110.00 NaHCO3 84.02 CaCI2.2H2O 147.20
MgCI2.6H2O 203.30
MgSO4•7H2O 246.50
60%乳酸钠 112.10 乳酸钙.H2O 303.30 Hepes 238.30 Glucose 198.17 EDTA.Na2 372.20 牛碘酸 125.10 果糖 180.16 Glutamine 146.15 PMSF 174.2 Leupiptin 4
65 CR1 配方-1
成份： g/100ml g/50ml NaCI 0.67 0.3352 KCI 0.0231 0.0116 NaHCO3 0.2201 0.1101
半Ca 0.055 0.0278 L-Glutamine 0.015 0.0073
Na-Py 0.0022 0.0011 BSA 0.3 0.15 BME amino acids 2ml 1ml MEM amino acids 1ml 500μl S/N 0.005 0.0025 Phenolred 少许 少许
PH: 配法: 注意: 评价:
成份 NaCL KCL NaH2PO4 MgSO4 NaHCO3
Ca 1/2 Lactate
Na-Py D-葡萄糖 L-Glutamine (pen/strep)
Hepes V-BSA EAA(50) NEAA(100) Phenol-red FBS
CR1-BSA 0.64 0.038 0.012 0.0096 0.21 0.0546 0.0044 0.027 0.015 0.0015pg/ml
0.238 6mg/ml 2ml 1ml 少量
CR1-FBS 0.64 0.038 0.012 0.0096 0.21 0.0546 0.0044 0.1 0.015 0.005 3mg/ml 2ml 1ml 少量 5%-10%
PH: 配法: 注意: 评价:
成份 NaCl KCl NaHCO3 Ca 1/2 Lactate
Na-Py L-Glutamine
BSA EAA(50) NEAA(100)
(S/N) Phenol-red
(100ml) (40ml) (50ml)
0.67 0.0231 0.22 0.0545 0.0044 0.0146 0.3 2ml 1ml
0.005/0.005
little
0.268 0.00924 0.088 0.0218 0.00144 0.00584 0.12 0.8ml 0.4ml 0.002/0.002 little
0.335 0.0116 0.11 0.0273 0.0018 0.0073 0.15 1ml 0.5ml 0.0025/0.0025
little
PH: 7.2-7.6
配法: 注意:
1.下列试剂能添加? Hepes FBS D-葡萄糖 评价:
0.238 10% 0.027
成份 NaCl KCl NaHCO3 Ca 1/2 Lactate
Na-Py L-Glutamine MgCI2²6H2O K2HPO4 D-葡萄糖 BSA EAA(50) NEAA(100) (P/S) Phenol-red
(100ml) (20ml) (50ml)
0.64 0.0231 0.2201 0.0545 0.0022 0.0146 0.0163 0.0207 0.0297 0.6 2ml 1ml little little
0.128 0.0046 0.044 0.0109 0.0004 0.0029 0.0033 0.0041 0.0059 0.12 0.4ml 0.2ml
0.32 0.0116 0.1101 0.0273 0.0011 0.0073 0.0081 0.0104 0.0149 0.3 1ml 0.5ml
PH: 配法:
注意: FBS添加量分别为5ml,1ml,2.5ml 评价:
69 TALP基础液 配方-1
成份： g/100ml NaCI 0.675 KCI 0.03 NaHCO3 0.260 Na-Py 0.011 NaH2PO4(无水) 0.0048 Hepes 0.2400 CaCI2.2H2O 0.0295 MgCI2.6H2O 0.0150 L-glutamine 0.0375 S/N 0.0075/0.005 EDTA-Na 0.0180 Phenolred 少量
PH: 配法：
注意: 1. CacL2.2H2O和MgCI2²6H2O单独溶解后缓慢倒入。
2．NaH2PO4（无水） 0.0048/100ml 评价:
获能和受精液 配方-2
成份： 50ml 1．获能液
TALP基础液 50.0ml 咖啡因 0.022g Glucose 0.050
2.BO受精液
TALP基础液 50.0ml Heparin 0.005g BSA 0.25g
PH: 配法：
注意: 1. CacL2.2H2O和MgCI2²6H2O单独溶解后缓慢倒入。
70 Hank’s液 配方-1
成份： g/100ml NaCI 0.80 KCI 0.04 NaHCO3 0.035 KH2PO4 0.006g Glucose 0.1 MgCI2•6H2O 0.01 或CaCI2 0.014 MgSO4•7H2O 0.01
Phenolred 0.002
PH: 配法：
注意：Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。
D-Hank’s液 配方-2
成份： g/500ml NaCI 4.0 KCI 0.2 NaHCO3 0.175 KH2PO4 0.03g
Na2HPO4(无水) 0.04275 或Na2HPO4•7H2O 0.045
Phenolred little
PH:
注意：
1.Na2HPO4•7H2O 0.045
2.配TE用
71 几种胚胎培养液和缓冲液的成分含量
g/L
成份： Whitfen M16 M2 NaCI 5.14 5.533 5.533 KCI 0.36 0.356 0.356 KH2PO4 0.16 0.162 0.162 NaHCO3 1.9 2.101 0.349 MgSO4²7H2O 0.29 0.293 0.293 CaCI2 0.190 0.190 Hepes 4.969 乳酸钙²5H2O 0.53
Na-Py 0.035 0.036 0.036 乳酸钠(60%) 3.70ml 3.11ml 3.11ml Glucose 1.0 1.0 1.0 BSA 3.0 4.0 4.0 Pencillin 0.08 0.06 0.06
Strep 0.05 0.05 0.05
Phenolred 少许 少许
PH: 配法:
注意: 1. CacL2.2H2O和MgCI2²6H2O单独溶解后缓慢倒入。 2．定量后弃3.0285ml 无离子水。
72．Insulin 浓缩液
称取BSA 0.0242g 充分溶于20ml超纯水中,然后再加入300μl醋酸（液体醋酸), 向500mg Insulin管中加入0.5ml 水，吸出加入25 ml水中，再从25ml水中吸0.5ml水，如此反复多次，然后分装，即为20mg/ml 母液。
100μl（1小管）Insulin加入100ml 溶液中，其浓度为20μg/ml 。 400μl（1大管）Insulin加入100ml 溶液中，其浓度为80μg/ml。
细胞冷冻
我们用90％的血清＋5％DMSO＋5％培养基，细胞复苏很容易，绝大部分细胞存活。
细胞融合
细胞融合时操作要快，尽量少的刺激细胞。融合时的离心转数一定要控制在800转每分以下。我们融合的时候使用的PEG1000，50%，再加少量的DMSO。我们融合时sp2/0跟要融合的细胞数之比为10 的8次方比上10 的7次方。用的是PEG1500，离心速度1000转每分，对融合有影响吗。 线粒体的分离方法：
匀浆细胞或加lysii buffer（配方从网上找），吹打，然后480g 离心5分钟，取上清，再10000g离心10分钟得到沉淀即线粒体。 我们的方法是：
刮下细胞后离心沉淀细胞，用BUFFER重悬细胞，放冰上30min，匀浆100次，1000G离心10min，取上清，在10000G离心10min,沉淀即为线粒体。 细胞核提取
1．取制备血管细胞悬液放于试管中，加五倍体积缓冲液（10mmol/l Tris HCL,pH7.4含10mol/L NaCl,1.5mmol/L Mgcl2），加1%SDS10 μl用匀浆器轻轻匀浆。
2． 加蔗糖液（0.34mol/L,蔗糖10mol/L MgCl2）2份再匀浆1次，下面铺一层0.88mol/L蔗糖，800g离心5min，收集沉淀部分。
3．在0.88mol/L蔗糖液中再纯化1次，然后将细胞悬于10ml蔗糖液(0.34mol/L0.05mmol.LMgCl2)液中，用超声波处理10S。
4．将两倍体积的0.88mol/L蔗糖加于上述处理液中，800g离心30min收集沉淀部分。 5．将沉淀加入0.88mol/L蔗糖，5kg离心1h，沉淀部分为细胞核，将其保存于0.25mol/L蔗糖，0.55mmol/LMgCl中备用。 细胞膜的提取
1．取一定量酶处理的细胞，用匀浆器破碎，操作要温和，使细胞膜保持完整。由于水与膜的疏水部分之间有反应，因此要精确掌握分离介质中的离心强度和渗透压，以每克细胞湿重加40ml介质。 2．用Potter-Elvehiem匀浆器，杆与壁间间隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下匀浆4～6次，每次5S。
3．过滤匀浆液，150g离心10min，保留上清，沉淀部分加入50μl介质，用匀浆器1kr/min匀浆3次，150g离心10min，沉淀部分再加入上次匀浆的上清液。
4．合并3次上清液，2kg离心10min，弃上清，沉淀部分溶于100μl介质，离心10min，弃上清，留沉淀。
5．将沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分别置于三个离心管中，上面依次叠加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。
6．700kg离心90min，分离介质在1.16～1.18之间形成介面。
7．收集d为1.16～1.18g/ml之间的细胞膜，加30倍的介质以2.5kg离心10min，洗涤2次。 8．保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5缓冲液中，用于细胞膜的研究分析。 溶酶体的分离
1．在梯度混合器的两个小杯中分别加入2.1mol/L和1.1mol/L蔗糖（比例9：1）。 2．收集血管壁细胞，用特制匀浆器1kr/min匀浆10次。
3．以150g离心10min，上清液以同样条件离心1次，弃沉淀，上清液以9kg离心3min弃上清液，
4．沉淀分三种不同颜色，褐色为半纯化的溶酶体，中间黄褐色为线粒体部分，上层白色为膜成分混合物。首先小心吸取上层，然后加入0.3mol/L蔗糖数毫升，慢慢摇匀使界面层悬浮，再用0.3mol/L蔗糖洗1次。
5．将悬浮的半纯化溶酶体铺在梯度平面上，用玻棒搅匀最上层梯度液，使溶酶体和梯度液之间的介面破坏，然后以10kg离心15min，离心后可出现三条明显的区带及少许沉淀，最下面黄褐色为纯化的溶酶体，中间黄色的为线粒体。 线粒体的分离
1．浆分离的血管浸入缓冲液（250mmol/L甘露醇、0.5mmol/l EDTA、 5mmol/L Hepes、0.1%BSA、pH7.4）匀浆破碎细胞，600g离心5min，除去细胞核及碎片。 2．上清液在100kg离心10min，留取沉淀部分。
3．将沉淀部分悬浮于5ml操作1.的缓冲液中，加入5倍体积30%Percon、225mmol/L甘露醇、1mmol/L，EDTA、25mmol/L Hepes 0.1%BSA,5000g离心30min。
4．将上述沉淀溶于适量10mmol/L KH2PO4，pH7.4中，轻轻振荡15min。
5．加入10ml蔗糖液缓冲液（32%蔗糖、30%甘油、10mmol/l MgCl2、10mmol/L KH2PO4，pH7.4）振荡15min。
6．用BransonB-12超声波碎仪60～70W处理2次，每次15min，12kg离心10min。
7．将沉淀部分溶于10倍体积缓冲液中并铺于试管底层，试管中层铺成不连续蔗糖梯度（25.3%、37.9%和51.3%）蔗糖各4mm厚，上层铺上清液。
8．2kg离心3h，在25.3%/37.9%界面处为线粒体外膜，在51.3%蔗糖层分别回收内膜和基质。 细胞增殖的测定
细胞增殖的测定是采用常见的3H掺入法。简要地说，分别将EC和SMC用胰蛋白酶消化后，接种在96孔板中(10/孔)，加入含10%新生牛血清的DMEM培养液(100μl/孔)。细胞培养过夜后，类似于收集条件培养基一样，用无血清DMEM培养液连续冲洗4次。冲洗完成后，ECCM加入到SMC培养系统中。同理，SMCCM加入到EC培养系统中，细胞培养于微孔中，37℃条件下培养3天。所选择的培养时间是按Leszczynski等报导的
4
〔2〕
4
。在培养第3天之前的最后6个小时内，将〔H〕
3
-TdR(3.7kBq/10个细胞)分别加入到EC和SMC培养系统中。当培养期终止时，冲洗微孔中的细胞，在β计数器中收集并记数。 1.5 记数与统计分析
所有实验重复3次，其结果表示为±S，统计分析采用单因素方差分析，差异性显著(P＜0.05)。