低温胁迫对水稻幼苗耐冷性的鉴定
张
岩1，马士学1，刘宪虎2，牛艳凯3，王青菊1, 张
（1建三江大兴农场，黑龙江
佳木斯龙井佳木斯
卓3
156303；156321）
2延边大学农学院，吉林3建三江创业农场，黑龙江
摘
133400；
要：以14个耐冷性不同的水稻品种为材料，经对照（20℃）和低温（10℃）处理后，测定分析幼苗叶片的耐冷指数以
及对过氧化物酶同工酶凝胶电泳的分析。结果表明，经低温处理后，各品种差异较明显。低温与对照相比，大部分水稻品种多出1～2酶带。
关键词：水稻；耐冷指数；过氧化物酶中图分类号：S162.5
文献标志码：A
文章编号：1673－6737（2008）06－0036－03
Appraisal of Chilling-Tolerance of Rice Seedling under Low Temperature Stress
ZHANG Yan 1, MA Shi-xue 1，LIU Xian-hu 2，NIU Yan-kai 3, WANG Qing-ju 1, ZHANG Zuo 3
(1Jiansanjiang Daxing Farm, Jiamusi Heilongjiang 156303, China; 2College of Agronomy, Yanbian University, Longjing Jilin 133400，China; 3Jiansanjiang Chuangye Farm, Jiamusi Heilongjiang 156321, China)
Abstract:Fourteen rice varieties with different chilling -tolerances were treated under 20℃
(control)and 10℃to
evaluate the chilling resistance index and peroxidase isoenzyme. The results showed that the differences among varieties under low temperature were significant. Most of rice varieties produced one to two new peroxidase isoenzyme bands at low temperature.
Key words:Rice ；Chilling resistance index ；Peroxidase
低温是限制植物分布和作物产量的重要环境因素，按照低温程度和受害情况，可分为冷害（chilling injury ，零上低温对植物的伤害）和冻害（freezing injury ，零下低温对植物的伤害）两大类．低温冷害严重地制约着稻作的发展，而稻种苗期对低温的抗性是稻株速发早发的重要性状，利用早期的耐冷性个体选择来提高水稻耐冷育种的效率。固此，正确评价现有水稻品种苗期的耐冷性，对于有效地选育耐冷性水稻品种及在耕作上提早育秧，避开后期冷害具有现实意义。
众所周知，酶是植物生命过程中的重要调节者。刘鸿先等研究指出, 同工酶与植物抗冷性有关。田廷亮发现SOD 同工酶与油菜抗寒性有关。有研究发现，巴西橡胶树不同抗寒性品种在低温期间细胞色素氧化酶同工酶谱带发生变化，小粒
收稿日期：2008-05-05
作者简介：张岩（1978-），男，硕士研究生。
种咖啡未经低温处理，不显示细胞色素氧化酶同工酶，经一段时间的低温处理后，则出现两条新的弱谱带。但过氧化物酶同工酶与水稻耐冷的有关报道较少。本文以耐冷性不同的水稻品种为材料，研究苗期在对照温度与低温状态下的耐冷指数和过氧化物酶同工酶酶谱的变化与水稻各品种耐冷性之间的关系，以期为水稻耐冷性育种及早期幼苗耐冷性选择提供理论依据。
1
1．1
内容与方法
试验材料
本试验以14个耐冷性不同的水稻品种为材
料，其随机编号分别为：通35（1号）、吉玉粳（2号）、万宝21（3号）、道黄金（4号）、秋光（5号）、延粳19（6号）、延粳21（7号）、通103（8号）、延304（9号）、月亭1号（10号）、富士光（11号）、通88－7（12号）、藤系138（13号）、长白9号（14号）。（以
1．2
凝胶电泳方法。分离胶浓度7%，pH8．8，浓缩胶浓度3%，pH6．8，电极缓冲液为0．6mol ／LTris－HCL，
上品种由延边大学农学院和延边农科院提供）。
试验方法
1．2．1人工模拟气候条件下耐冷指数计算①在
常温下生长到3～4叶龄时，每个品种连土取十株幼苗放置在营养钵中，并放在医用磁盘内，放入
pH8．3，点样25ml ，用溴酚蓝作指示剂。电泳开始
时，电压控制在100V ，半小时后稳压在200V ，电流控制在40mA 内，在4℃冰箱冷水浴中电泳
HPG－400H人工气候箱，温度调控在10℃，光照8h ，光照强度为4000Lux ，相对湿度70%～80%，处理7d 后，在自然条件下放置5d 使其恢
复，调查幼苗的叶赤枯度并计算耐冷指数。对照处理，取大棚旱播的幼苗，温度调控在20℃，光照
2．5～3．0h ，取出胶片用联苯胺—醋酸法染色。
2
2．1
结果与分析
人工模拟气候条件下水稻幼苗的耐冷指数水稻在幼苗（3～4叶）时对低温相对比较敏
12h ，光照强度5000Lux ，相对湿度70%～80%，
处理7d ，调查幼苗的叶赤枯度并计算耐冷指数。各处理重复3次，取平均值。叶赤枯度分级标准参照韩龙植等方法。②叶赤枯度分1～9级评价，1级：所有叶青绿或接近青绿；3级：叶子有一点脱色或黄色；5级：叶子大部分黄化；7级：50％叶子干枯，有些苗死亡；9级：大部分或全部苗死亡。③计算耐冷指数：（冷害指数的倒数，用TI 表示，TI 值越大，水稻耐冷性越强）
与抗冷性的关系
感，不同品种冷害程度表现不一。人工模拟气候条件下的鉴定结果表明：水稻品种2号耐冷性最强，
3号、13号、10号、12号、14号耐冷性较强，其中水稻品种2号，仅部分发生3级冷害；水稻品种6号、4号、7号、5号、1号、8号耐冷性次之，大多数为3
级和5级冷害；水稻品种9号和11号耐冷性最差，冷害程度较重，大多数为7级和9级冷害。从耐冷指数来看，水稻各品种间有一定的差异（表1）。据此可将水稻品种大致划分为三种不同的类型：即为水稻品种2号、3号、13号、10号、12号、14号为耐冷型；水稻品种6号、4号、7号、5号、1号、8号为中间型；9号和11号为冷敏感型。该方法简单易操作，因此，在寻找简单、快速的耐冷性鉴定指标时，可以用人工模拟气候条件下耐冷指数作为水稻的耐冷性鉴定指标。
TI ＝〔（g i1／g i2）×〔（100／Ld 1）〕／〔（C 1／C 2）〕×（100／Ld 2）〕
G i1处理前苗数，g i2处理后苗数。Ld 1测试叶片失绿等级，Ld 2耐冷对照叶片失绿等级。C 1为处理前耐冷对照苗数，C 2为耐冷对照存活苗数。1．2．2
过氧化物酶同工酶凝胶电泳的分析
①
样品液制备：采集经对照20℃和冷处理10℃的幼苗叶片0．1～0．3g ，将其洗净并吸干，加液氮研磨成细末后，放入小样品管中，加入1～2倍体积（v ／w ）的样品缓冲液（内含0．065mol ／L Tris－柠檬酸p h8．2），提取过氧化物同工酶。因在做蛋白质和一些分子量大小差异悬殊的同工酶时，需将样品混匀，因此，必需把提取液经10000～15000
2．2
分析
水稻幼苗叶片过氧化物酶凝胶电泳的酶谱在对照温度（20℃）处理条件下，不同水稻品
种幼苗叶片的过氧化物酶的酶带数量和位置差异不大，但酶带活力均有一定的差异（图1）。其中水稻品种1号、8号、9号、11号和14号酶带活力较强。经低温（10℃）处理后，过氧化物酶系统明显受到环境低温的影响，并且某些水稻品种的过氧化物酶系统产生正面响应。低温处理后，其中个别
r ／min 离心5min ，然后取上清夜加入四分之一倍（v ／v ）的50％甘油，制成样品，放在0～4℃冰箱中
保存备用。②电泳方法：采用垂直板聚丙烯酰胺
表1
编号耐冷指数
低温下水稻各品种耐冷指数均值的比较
5gh E
6f E
70．0668fgh E
80．0538h E
90．0152i F
100．1948cd BC
110．0129i F
120．1906d C
130．2183bc BC
140．1411e D
10．0576gh E
20．2946a A
30．2217b B
40．0821fg E
0．05780．0921
注：1．邓肯氏新复极差测验，不同小写字母为差异达显著水平（α＝0．05），不同大写字母为差异达极显著水平（α＝0．01）；2．品种编号：1／通
35，2／吉玉粳，3／万宝21，4／道黄金，5／秋光，6／延粳19，7／延粳21，8／通系103，9／延304，10／月亭1号，11／富士光，12／通88－7，13／藤系138，14／长白9号。
a-对照温度（20℃）；b-低温处理（10℃）
图1水稻幼苗期过氧化物酶冷处理前后同工酶谱带
品种出现新的1～2条同工酶区段，且活力增强。另外有的水稻品种，颜色加深，过氧化物酶活力增强。还有一些水稻品种，过氧化物酶活力基本不变或降低。具体表现如下：电泳图谱各水稻品种尾部区段，2号和3号增加2条酶带；1号、5号和8号均增加一条酶带；水稻品种10号、12号和13号较为特殊，常温下酶带较弱，低温处理后酶带明显增强并且增加1条酶带；7号在低温处理后，酶带数目没有发生变化，但是酶的活力明显增强。
等（1981）在研究了零上低温对不同抗冷力的亚热带植物过氧化物酶与酯酶同功酶的影响时发现，过氧化物酶同工酶谱的变化在各植物和品种之间存在着明显的差异，在低温诱导下，抗冷力强的品种比抗冷力弱的品种一般多出1～6条酶带；但低温对酯酶的影响却相对比较稳定，证明植物经受寒冷对不同酶系统的影响是不同的；对低温的适应性反应是植物为适应温度条件而诱导体内过氧化物酶系统代谢改组的结果。本试验各水稻品种在低温胁迫后大部分品种增加1～2条酶带，进一步验证了低温能诱导过氧化物酶同工酶的产生，这是水稻适应冷胁迫的一种保护性反应。
综上所述，在相同低温胁迫条件下，可将耐冷指数、可溶性糖含量的变化量以及过氧化物酶系统的改组作为水稻的耐冷性的鉴定指标，特别是苗期幼苗的耐冷性选择。参考文献：
［1］任永波，段拥军．作物抗寒性鉴定指标的分类及其应
用［J ］．西昌农业高等专科学校学报，2002，16（2）：43－
9号和11号酶带数目未变，且过氧化物酶活力减弱，11号还有一酶带几乎缺失。这与苗期耐冷指
数测定出的结果也基本一致。由此证明，水稻的耐冷性与过氧化物酶同工酶的数量和质量是有一定的相关性。
3结论与讨论
耐冷指数是植物受到冷害时的直接表现，能
客观、真实的反映出植物的耐冷性，因而被广大研究者所利用。同功酶在不同组织、不同个体以及不同种里以不同形式存在。同工酶就其催化同一种化学反应来说可以叫做同工，但编码同一种酶的不同基因位点往往只在不同的亚细胞分室、不同器官、不同发育阶段或不同生理状态下才表达。这种不同分子形式执行同一种功能是对不同环境条件的一种适应性反应，它强调了外部环境因素的作用。在逆境胁迫下，不是所有的同工酶都可诱导产生的，不同的逆境会产生不同的同工酶。刘鸿先
46．
［2］宋良图，郭书普．酯酶同工酶和过氧化物酶同工酶与
油菜抗寒性的关系［J ］．安徽农业科学，1995，23（4）：
333－335．
［3］韩龙植，张三元．水稻耐冷性鉴定评价方法［J ］．植物遗
传资源学报，2004，5（1）：75－80．
［4］夏明，刘亚学，阿拉木期，等．苜蓿叶片过氧化物酶同
功酶与抗冷性的关系［J ］．中国草地，2003，25（4）：41－
45.
低温胁迫对水稻幼苗耐冷性的鉴定
张
岩1，马士学1，刘宪虎2，牛艳凯3，王青菊1, 张
（1建三江大兴农场，黑龙江
佳木斯龙井佳木斯
卓3
156303；156321）
2延边大学农学院，吉林3建三江创业农场，黑龙江
摘
133400；
要：以14个耐冷性不同的水稻品种为材料，经对照（20℃）和低温（10℃）处理后，测定分析幼苗叶片的耐冷指数以
及对过氧化物酶同工酶凝胶电泳的分析。结果表明，经低温处理后，各品种差异较明显。低温与对照相比，大部分水稻品种多出1～2酶带。
关键词：水稻；耐冷指数；过氧化物酶中图分类号：S162.5
文献标志码：A
文章编号：1673－6737（2008）06－0036－03
Appraisal of Chilling-Tolerance of Rice Seedling under Low Temperature Stress
ZHANG Yan 1, MA Shi-xue 1，LIU Xian-hu 2，NIU Yan-kai 3, WANG Qing-ju 1, ZHANG Zuo 3
(1Jiansanjiang Daxing Farm, Jiamusi Heilongjiang 156303, China; 2College of Agronomy, Yanbian University, Longjing Jilin 133400，China; 3Jiansanjiang Chuangye Farm, Jiamusi Heilongjiang 156321, China)
Abstract:Fourteen rice varieties with different chilling -tolerances were treated under 20℃
(control)and 10℃to
evaluate the chilling resistance index and peroxidase isoenzyme. The results showed that the differences among varieties under low temperature were significant. Most of rice varieties produced one to two new peroxidase isoenzyme bands at low temperature.
Key words:Rice ；Chilling resistance index ；Peroxidase
低温是限制植物分布和作物产量的重要环境因素，按照低温程度和受害情况，可分为冷害（chilling injury ，零上低温对植物的伤害）和冻害（freezing injury ，零下低温对植物的伤害）两大类．低温冷害严重地制约着稻作的发展，而稻种苗期对低温的抗性是稻株速发早发的重要性状，利用早期的耐冷性个体选择来提高水稻耐冷育种的效率。固此，正确评价现有水稻品种苗期的耐冷性，对于有效地选育耐冷性水稻品种及在耕作上提早育秧，避开后期冷害具有现实意义。
众所周知，酶是植物生命过程中的重要调节者。刘鸿先等研究指出, 同工酶与植物抗冷性有关。田廷亮发现SOD 同工酶与油菜抗寒性有关。有研究发现，巴西橡胶树不同抗寒性品种在低温期间细胞色素氧化酶同工酶谱带发生变化，小粒
收稿日期：2008-05-05
作者简介：张岩（1978-），男，硕士研究生。
种咖啡未经低温处理，不显示细胞色素氧化酶同工酶，经一段时间的低温处理后，则出现两条新的弱谱带。但过氧化物酶同工酶与水稻耐冷的有关报道较少。本文以耐冷性不同的水稻品种为材料，研究苗期在对照温度与低温状态下的耐冷指数和过氧化物酶同工酶酶谱的变化与水稻各品种耐冷性之间的关系，以期为水稻耐冷性育种及早期幼苗耐冷性选择提供理论依据。
1
1．1
内容与方法
试验材料
本试验以14个耐冷性不同的水稻品种为材
料，其随机编号分别为：通35（1号）、吉玉粳（2号）、万宝21（3号）、道黄金（4号）、秋光（5号）、延粳19（6号）、延粳21（7号）、通103（8号）、延304（9号）、月亭1号（10号）、富士光（11号）、通88－7（12号）、藤系138（13号）、长白9号（14号）。（以
1．2
凝胶电泳方法。分离胶浓度7%，pH8．8，浓缩胶浓度3%，pH6．8，电极缓冲液为0．6mol ／LTris－HCL，
上品种由延边大学农学院和延边农科院提供）。
试验方法
1．2．1人工模拟气候条件下耐冷指数计算①在
常温下生长到3～4叶龄时，每个品种连土取十株幼苗放置在营养钵中，并放在医用磁盘内，放入
pH8．3，点样25ml ，用溴酚蓝作指示剂。电泳开始
时，电压控制在100V ，半小时后稳压在200V ，电流控制在40mA 内，在4℃冰箱冷水浴中电泳
HPG－400H人工气候箱，温度调控在10℃，光照8h ，光照强度为4000Lux ，相对湿度70%～80%，处理7d 后，在自然条件下放置5d 使其恢
复，调查幼苗的叶赤枯度并计算耐冷指数。对照处理，取大棚旱播的幼苗，温度调控在20℃，光照
2．5～3．0h ，取出胶片用联苯胺—醋酸法染色。
2
2．1
结果与分析
人工模拟气候条件下水稻幼苗的耐冷指数水稻在幼苗（3～4叶）时对低温相对比较敏
12h ，光照强度5000Lux ，相对湿度70%～80%，
处理7d ，调查幼苗的叶赤枯度并计算耐冷指数。各处理重复3次，取平均值。叶赤枯度分级标准参照韩龙植等方法。②叶赤枯度分1～9级评价，1级：所有叶青绿或接近青绿；3级：叶子有一点脱色或黄色；5级：叶子大部分黄化；7级：50％叶子干枯，有些苗死亡；9级：大部分或全部苗死亡。③计算耐冷指数：（冷害指数的倒数，用TI 表示，TI 值越大，水稻耐冷性越强）
与抗冷性的关系
感，不同品种冷害程度表现不一。人工模拟气候条件下的鉴定结果表明：水稻品种2号耐冷性最强，
3号、13号、10号、12号、14号耐冷性较强，其中水稻品种2号，仅部分发生3级冷害；水稻品种6号、4号、7号、5号、1号、8号耐冷性次之，大多数为3
级和5级冷害；水稻品种9号和11号耐冷性最差，冷害程度较重，大多数为7级和9级冷害。从耐冷指数来看，水稻各品种间有一定的差异（表1）。据此可将水稻品种大致划分为三种不同的类型：即为水稻品种2号、3号、13号、10号、12号、14号为耐冷型；水稻品种6号、4号、7号、5号、1号、8号为中间型；9号和11号为冷敏感型。该方法简单易操作，因此，在寻找简单、快速的耐冷性鉴定指标时，可以用人工模拟气候条件下耐冷指数作为水稻的耐冷性鉴定指标。
TI ＝〔（g i1／g i2）×〔（100／Ld 1）〕／〔（C 1／C 2）〕×（100／Ld 2）〕
G i1处理前苗数，g i2处理后苗数。Ld 1测试叶片失绿等级，Ld 2耐冷对照叶片失绿等级。C 1为处理前耐冷对照苗数，C 2为耐冷对照存活苗数。1．2．2
过氧化物酶同工酶凝胶电泳的分析
①
样品液制备：采集经对照20℃和冷处理10℃的幼苗叶片0．1～0．3g ，将其洗净并吸干，加液氮研磨成细末后，放入小样品管中，加入1～2倍体积（v ／w ）的样品缓冲液（内含0．065mol ／L Tris－柠檬酸p h8．2），提取过氧化物同工酶。因在做蛋白质和一些分子量大小差异悬殊的同工酶时，需将样品混匀，因此，必需把提取液经10000～15000
2．2
分析
水稻幼苗叶片过氧化物酶凝胶电泳的酶谱在对照温度（20℃）处理条件下，不同水稻品
种幼苗叶片的过氧化物酶的酶带数量和位置差异不大，但酶带活力均有一定的差异（图1）。其中水稻品种1号、8号、9号、11号和14号酶带活力较强。经低温（10℃）处理后，过氧化物酶系统明显受到环境低温的影响，并且某些水稻品种的过氧化物酶系统产生正面响应。低温处理后，其中个别
r ／min 离心5min ，然后取上清夜加入四分之一倍（v ／v ）的50％甘油，制成样品，放在0～4℃冰箱中
保存备用。②电泳方法：采用垂直板聚丙烯酰胺
表1
编号耐冷指数
低温下水稻各品种耐冷指数均值的比较
5gh E
6f E
70．0668fgh E
80．0538h E
90．0152i F
100．1948cd BC
110．0129i F
120．1906d C
130．2183bc BC
140．1411e D
10．0576gh E
20．2946a A
30．2217b B
40．0821fg E
0．05780．0921
注：1．邓肯氏新复极差测验，不同小写字母为差异达显著水平（α＝0．05），不同大写字母为差异达极显著水平（α＝0．01）；2．品种编号：1／通
35，2／吉玉粳，3／万宝21，4／道黄金，5／秋光，6／延粳19，7／延粳21，8／通系103，9／延304，10／月亭1号，11／富士光，12／通88－7，13／藤系138，14／长白9号。
a-对照温度（20℃）；b-低温处理（10℃）
图1水稻幼苗期过氧化物酶冷处理前后同工酶谱带
品种出现新的1～2条同工酶区段，且活力增强。另外有的水稻品种，颜色加深，过氧化物酶活力增强。还有一些水稻品种，过氧化物酶活力基本不变或降低。具体表现如下：电泳图谱各水稻品种尾部区段，2号和3号增加2条酶带；1号、5号和8号均增加一条酶带；水稻品种10号、12号和13号较为特殊，常温下酶带较弱，低温处理后酶带明显增强并且增加1条酶带；7号在低温处理后，酶带数目没有发生变化，但是酶的活力明显增强。
等（1981）在研究了零上低温对不同抗冷力的亚热带植物过氧化物酶与酯酶同功酶的影响时发现，过氧化物酶同工酶谱的变化在各植物和品种之间存在着明显的差异，在低温诱导下，抗冷力强的品种比抗冷力弱的品种一般多出1～6条酶带；但低温对酯酶的影响却相对比较稳定，证明植物经受寒冷对不同酶系统的影响是不同的；对低温的适应性反应是植物为适应温度条件而诱导体内过氧化物酶系统代谢改组的结果。本试验各水稻品种在低温胁迫后大部分品种增加1～2条酶带，进一步验证了低温能诱导过氧化物酶同工酶的产生，这是水稻适应冷胁迫的一种保护性反应。
综上所述，在相同低温胁迫条件下，可将耐冷指数、可溶性糖含量的变化量以及过氧化物酶系统的改组作为水稻的耐冷性的鉴定指标，特别是苗期幼苗的耐冷性选择。参考文献：
［1］任永波，段拥军．作物抗寒性鉴定指标的分类及其应
用［J ］．西昌农业高等专科学校学报，2002，16（2）：43－
9号和11号酶带数目未变，且过氧化物酶活力减弱，11号还有一酶带几乎缺失。这与苗期耐冷指
数测定出的结果也基本一致。由此证明，水稻的耐冷性与过氧化物酶同工酶的数量和质量是有一定的相关性。
3结论与讨论
耐冷指数是植物受到冷害时的直接表现，能
客观、真实的反映出植物的耐冷性，因而被广大研究者所利用。同功酶在不同组织、不同个体以及不同种里以不同形式存在。同工酶就其催化同一种化学反应来说可以叫做同工，但编码同一种酶的不同基因位点往往只在不同的亚细胞分室、不同器官、不同发育阶段或不同生理状态下才表达。这种不同分子形式执行同一种功能是对不同环境条件的一种适应性反应，它强调了外部环境因素的作用。在逆境胁迫下，不是所有的同工酶都可诱导产生的，不同的逆境会产生不同的同工酶。刘鸿先
46．
［2］宋良图，郭书普．酯酶同工酶和过氧化物酶同工酶与
油菜抗寒性的关系［J ］．安徽农业科学，1995，23（4）：
333－335．
［3］韩龙植，张三元．水稻耐冷性鉴定评价方法［J ］．植物遗
传资源学报，2004，5（1）：75－80．
［4］夏明，刘亚学，阿拉木期，等．苜蓿叶片过氧化物酶同
功酶与抗冷性的关系［J ］．中国草地，2003，25（4）：41－
45.