２００５；２５（４）
第一军医大学学报（ＪＦｉｒｓｔＭｉｌＭｅｄＵｎｉｖ）・４０３・
骨组织结构显微形态分析
陈斌，裴国献，刘晓霞，秦煜，汪群立（南方医科大学南方医院创伤骨科，广东广州５１０５１５）
摘要：目的应用原子力显微镜和扫描电镜观察分析人长管状骨组织中的微观结构，以了解骨组织的超微结构以及胶原和矿物质的构成和形态。方法取新鲜人尸体肱骨标本，固定脱水，分别制作骨磨片和切成薄片，分别在光学显微镜、原子力显微镜和扫描电镜分析骨组织矿化区的结构。结果在光学显微镜下，骨陷窝呈环状排列在哈佛管周围，骨小管沟通骨陷窝与哈佛管和骨陷窝之间的联系。在原子力显微镜的观察下，大胶原蛋白的形态清楚显示；在矿化区胶原蛋白纤维增厚．呈小盘叠加形态，钙一磷晶体呈椭圆柱形状；可清晰观察到骨小管和骨陷窝的大小和形态及骨小管和骨陷窝的关系。在扫描电镜下，骨基质呈环形沿哈佛系统排列，钙一磷晶体之间相互呈规则排列。结论原子力显微镜可分析胶原蛋白和基质中钙一磷晶体的三维结构形态、骨小管和骨陷窝的三维构成及大小；骨小管是交流营养物质和分子信号到骨陷窝中骨细胞的通道。
关键词：骨小管；骨陷窝；原子力显微镜；扫描电镜；骨组织；形态学中图分类号：Ｒ３２２．７：Ｑ一３３６
文献标识码：Ａ
文章编号：１０００．２５８８（２００５）０４—０４０３—０４
Ｏｐｔｉｃａｌ，ｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎａｎｄａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｈｕｍａｎｈｕｍｅｒａｌｂｏｎｅ
ＣＨＥＮＢｉｎ，ＰＥＩＧｕｏ—ｘｉａｎ，ＬＩＵ
．，、。，
Ԭ
Ｘｉａｏ—ｘｉａ，ＱＩＮＹｕ，ＷＡＮＧＱｕｎ—ｌｉ
。
．、
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓａｎｄＴｒａｕｍａｔｏｉｏｇｙ，ＮａｎｆａｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０５１５，
Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｔｏ
Ｔｏ
ｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｈｕｍａｎｌｏｎｇｂｏｎｅｗｉｔｈｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎａｎｄａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ
ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｕｌｔｒａｓｔｍｃｔｕｒａｌｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｂｏｎｅｃｏｌｌａｇｅｎａｎｄｍｉｎｅｒａｌｓ．
Ｆｒｅｓｈ
Ｍｅｔｈｏｄｈｕｍａｎｃａｄａｖｅｆｉｃｈｕｍｅｒａｌｂｏｎｅｗｅｒｅｆｉｘｅｄａｎｄｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ
ｏｂｓｅｒｖｅｄｆｏｒｂｏｎｅｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｕｓｉｎｇｏｐｔｉｃａｌ
ｔｏ
ｐｒｅｐａｒｅｔｈｅｇｒｏｕｎｄ
ｅｌｅｃｔｒｏｎａｎｄ
ｓｅｃｔｉｏｎｓ
ａｎｄｔｈｉｎｓｌｉｃｅｓ，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅ
ｓｃａｎｎｉｎｇａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＲｅｓｕｌｔｓＵｎｄｅｒｏｐｔｉｃａｌ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｔｈｅｂｏｎｅｌａｃｕｎａｅｗｅｒｅｉｎｃｉｒｃｕｌａｒｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎａｒｏｕｎｄｔｈｅＨａｖｅｒｓｉａｎｃａｎａｌ，
ｏｒ
ａｎｄｔｈｅｃａｎａｌｉｃｕｌｉｃｏｍｍｕｎｉｃｍｅｄｔｈｅｌａｃｕｎａｅａｎｄＨａｖｅｒｓｉａｎｃａｎａｌ
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄｄｉｓｔｉｎｃｔ
ｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｌａｃｕｎａｅ．
Ａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
ｚｏｎｅ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｌａｒｇｅｃｌｕｓｔｅｒｓｏｆｃｏｌｌａｇｅｎ，ａｎｄｔｈｅｃｏｌｌａｇｅｎｆｉｂｅｒｓｔｈｉｃｋｅｎｅｄｉｎｔｈｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ
ａｎｄ
ａｐｐｅａｒｅｄｉｎｔｈｅｓｈａｐｅｏｆｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｄｉｓｃｓ，ｗｈｅｒｅａｓｔｈｅｃａｌｃｉｕｍ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｃｒｙｓｔａｌｄｉｓｐｌａｙｅｄｅｌｌｉｐｓｅｃｙｌｉｎｄｅｒｓ．Ｔｈｅｓｉｚｅ，
ｓｈａｐｅａｎｄｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃａｎａｌｉｃｕｌｉａｎｄｌａｃｕｎａｅｗｅｒｅ
ｏｂｓｅｒｖｅｄｃｌｅａｒｌｙ．Ｔｈｅｂｏｎｅｍａｔｒｉｘｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｃｉｒｃｕｌａｒａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ
ａｌｏｎｇｔｈｅＨａｖｅｒｓｉａｎｃａｎａｌａｎｄｔｈｅｃａｌｃｉｕｍ—ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｃｒｙｓｔａｌｗａｓｉｎｒｅｇｕｌａｒａｌｉｇｎｍｅｎｔｕｎｄｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
Ａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
ａｓ
ｃａｎ
ｈｅｌｐａｎａｌｙｚｅｔｈｅｔｈｒｅｅ・・ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｏｆｃａｌｃｉｕｍ－－ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｃｒｙｓｔａｌａｎｄ
ａｓ
ｂｏｎｅｃｏｌｌａｇｅｎ
ｓｉｇｎａｌｓ
ｗｅｌｌａｓｔｈｅｃａｎａｌｉｃｕｌｉａｎｄｌａｃｕｎａ．Ｔｈｅｃａｎａｌｉｃｕｌｉｓｅｒｖｅ
ｔｈｅｃｈａｎｎｅｌｓｍｅｄｉａｔｉｎｇａｌｉｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｉｎｔｏｔｈｅｌａｃｕｎａ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃａｎａｌｉｃｕｌｉ；ｌａｃｕｎａ；ａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ；ｂｏｎｅ
骨组织作为一种材料结构．是由多种坚硬单晶体及其基质构成。在骨基质中钙一磷矿物质和胶原占据绝大成分，钙一磷矿物质的形状和大小在骨组织内的离子平衡和骨的生物力学功能扮演重要的角色。测量骨组织的显微结构和骨矿物质密度是对临床整体评价骨折风险和决定骨科植入物生物材料的整体评估具有重大意义…２【。为提高测量骨组织的显微结构和骨矿物质密度的精确性，在疾病状态下评估骨的质
量．有必要对骨组织中的显微结构和矿物质的分子形态和大小进行测量＿３］。
１材料和方法
１．１原子力显微镜样品制备
取新鲜尸体的肱骨。清除软组织，在切取一小段骨组织，分别沿横切面和纵切面方向切成一５０斗ｍ厚的２ｍｍｘ２ｍｍ大小的片子，在２：１的氯仿和酒精中脱脂１２ｈ。ＰＢＳ液体冲洗，试样的底部或骨面待干燥
收稿１３期：２００４．０８—２９
基金项目：国家“８６３”计划（２００３ＡＡ２０５０１０）
ＳｕｐｐｏＳｅｄｂｙＮａｔｉｏｎａｌ８６３
后立即用快速干燥型氰基丙烯酸盐粘合剂（Ｍ２ｂｏｎｄ
２００ａｄｈｅｓｉｖｅ，ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｇｒｏｕｐＩＮＣ，ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ，
Ｐｒｏｇｒａｍ（２００３ＡＡ２０５０１０）
作者简介：陈斌（１９７２一），男．现为南方医科大学存读博士，电话：
０２０．６１６４ｌ１１４．８７２００
ＵＳＡ）粘贴于圆形盖玻片上（直径为１１５ｃｍ）。再用双面粘结条将盖玻片固定于原子力显微镜（ａｔｏｍｉｃ
ｆｏｒｃｅ
通讯作者：裴国献，博士生导师，教授，研究方向：创伤骨科和骨组织工程．电话：０２０—６１６４１７４１，Ｅ—ｍａｉｌ：ｎｆｐｅｎｙ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ＣＯＷｌ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＡＦＭ）的不锈钢圆盘。随后以磁力吸附、
万方数据
安放在删压电扫描器上以行ＡＦＭ扫描和成像…。
・４０４・
第一军医大学学报（Ｊ
Ｆｉｒｓｔ
ＭｉｌＭｅｄＵｎｉｖ）第２５卷
１．２扫描电镜样品的制作
取新鲜尸体的肱骨，清除软组织，在切取一小段骨组织．分别沿横切面和纵切面方向切成一５０
ｉ．ｚｍ
２４～３６
ｈ，分别在干骺端、骨干切取骨组织，分别在横
切面和纵切面切取小片骨组织，做磨片至１０－２０¨ｍ厚．氯化金增色，普通光学显微镜下观察。２结果
２．１骨磨片观察
哈佛管呈规则排列。骨陷窝呈环形排列在哈佛管的周围．一个哈佛管有３－９层骨陷窝环形排列，骨陷窝和哈佛管及骨陷窝之间有骨小管连接（图１－３）。哈佛管直径为３４．６～１２１．４（７２．２±１３．６）Ｉｘｍ。
厚的２ｍｍｘ２ｍｍ大小的片子，将标本沿矢状面劈开，固定于３％戊二醛溶液２４
ｈ，０．１
ｍｏｌ／Ｌ二甲砷酸钠缓
冲液冲洗．１０％次氯酸钠溶液处理６ｈ，逐级乙醇脱水，乙醚浸泡。临界点干燥，真空喷金，在日产Ｓ－４５０型扫描电镜观察［５］。１．３骨磨片的制作
取新鲜成人尸体肱骨标本，中性福尔马林固定
图ｌ骨组织磨片。可见哈佛管周围骨陷窝环形排列，骨小管呈细丝样排列，沟通骨陷窝之间的联系（原放大倍数：ｘ２００）
Ｆｉｇ．１Ａ
ｂｏｎｅｇｒｏｕｎｄｓｅｃｔｉｏｎｓｈｏｗｉｎｇｃｉｒｃｕｌａｒｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂｏｎｅｌａｃｕｎａｅａｒｏｕｎｄｔｈｅＨａｖｅｒｓｉａｎｃａｎａｌａｎｄｔａｈｔｔｈｅｃａｎａｌｉｃｕｌｉ
ｌｉｎｅｕｐ
ａｓ
ｆｉｎｅｔｈｒｅａｄｓａｎｄｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｅ
ｔｈｅｌａｃｕｎａｅ（Ｏｒｉｇｉｎａｌｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：×２００）
图２骨组织磨片，见骨小管沟通骨陷窝之间的联系（原放大倍数：ｘ４００）
Ｆｉｇ．２
Ａｂｏｎｅｇｒｏｕｎｄ
ｓｅｃｔｉｏｎｓｈｏｗｉｎｇｔｈｅｌｉｎｋｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｃａｎａｌｉｃｕｌｉｌａｃｕｎａｅ（Ｏｒｉｇｉｎａｌｍａｇｎ湎ｃａｔｉｏｎ：×４００）
图３骨组织磨片。见骨小管沟通骨陷窝之间的联系（原放大倍数：×１ｏｏｏ）
Ｆｉｇ．３
Ａｂｏｎｅｇｒｏｕｎｄｓｅｃｔｉｏｎｓｈｏｗｉｎｇｎｕｍｅｒｏｕｓｃａｎａｌｉｃｕｌｉ
ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｌａｃｕｎａｅｆＯｒｉｇｉｎａｌｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｘｌ０００）
２．２原子力显微镜下
骨组织中钙一磷晶体呈柱状排列．骨小管沟通骨
佛系统为中心环形规则排列，相邻之间的骨陷窝间隔为１０～４０ｔｘｍ（图４、５）。钙．磷晶体排列呈小柱状，环绕着哈佛系统排列，单个晶体大小为８０－２００（１７４．６±５７．５）ａｍ，但仍有少数晶体的大小为４０ｎｍ。
陷窝，骨小管的直径为１００－３００（２００．２＋５１．８）ｍ，骨
陷窝为椭圆形结构，长轴直径为４．１～１０．５（７．４ｌ±１．８２）¨ｍ。每一个骨陷窝有２０－４０条骨小管与其交通，以哈
Ｆｉｇ．４
Ｆｉｇ．５
图４原子力显微镜镜下观察骨小管的形态和骨基质中钙一磷晶体的形态
Ｆｉｇ．４
Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
ｏｆｔｈｅｃａｎａｌｉｃｕｌｉａｎｄ
ｃａｌｃｉｕｍ—ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｃｒｙｓｔａｌｓｉｎｂｏｎｅｍａｔｒｉｘｓｈｏｗ，Ｉｌｂｙａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
图５原子力显微镜下骨陷窝的形态以及骨小管和骨陷窝之间的关系
万方数据 Ｆｉｇ．５Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
ｏｆｔｈｅｌａｃｕｎａｅａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｃａｎａｌｉｃｎｉｉｓｈｏｗｎｂｙａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
第４期陈斌．等．骨组织结构显微形态分析
・４０５・
２．３扫描电镜观察
骨组织中的矿物质晶体呈同心圆包绕着哈佛系统，钙一磷晶体排列呈规则状，胶原纤维的呈环状排
列，胶原纤维的排列方向和骨陷窝的排列方向一致（图６、７）。
图６扫描电镜观察哈佛管，可见哈佛系统内胶原呈环形规则排列（原放大倍数：ｘｌ０００）
Ｆｉｇ．６ＣｉｒｃｕｌａｒａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅｃｏｌｌａｇｅｎｉｎｔｈｅＨａｖｅｒｓｉａｎｓｙｓｔｅｍｓｈｏｗｎｂｙｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
（Ｏｒｉｇｉｎａｌｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｘ１ｏｏｏ）
图７扫描电镜观察可见胶原形态（原放大倍数：ｘ２０００）
Ｆｉｇ．７
Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｃｏｌｌａｇｅｎｓｈｏｗｎｂｙｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Ｏｒｉｇｉｎａｌｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｘ２０００）
３讨论
骨组织的显微结构和骨组织的功能有密切关系．骨组织的显微结构的改变对骨的生物力学有着显著的影响。骨组织中的晶体是在初始的矿物质沉积的基础上，通过吸附钙磷形成。当钙磷晶体吸附成一定的体积后达到一个动态的平衡。骨组织的显微结构在骨的病理状态下如骨质疏松．骨的矿化区晶体的结构发生明显的变化，从而在更小的外力作用下导致骨折。在生物植入材料时如同种异体骨，通过爬行替代的时候，矿物质的沉积．形成晶体结构，这些晶体机构和骨组织的生物力学有密切相关。
ＡＦＭ是一种新的工具．它是一种能显示物体表面超微结构的高精密度观测仪，主要使用一根极尖锐的探针接触物体表面．通过激光的会聚与反射，将物
物质的功能。骨小管的直径为５０—１２０ｎｌＴｌ，平均为（７０±２６）ａｍ，骨小管在骨组织中的功能是运送营养物质、交换离子和传递分子信号到骨陷窝中的骨细胞。骨陷窝呈椭圆形，其大小为２．ｏ￣５．０肛ｍ，骨陷窝内有骨细胞、成骨细胞和破骨细胞，骨细胞调节矿物质
的代谢。在本实验观察到每个骨陷窝内有２０－－４０条
骨小管与其沟通。胶原纤维沿骨小管排列，其方向和骨小管排列方向基本一致。陷窝小管系统这样的结构为骨组织中流体力学和分子的传输到骨细胞具有重要的意义［１１，１２］。骨细胞通过骨小管传递分子信号，调节骨基质中游离矿物质的形态和大小。
骨组织的力学和化学的性能主要取决于其构成物．胶原和钙一磷晶体的特性，但不是胶原和钙一磷晶体特性的简单叠加．而是取决于其构成的分子结构及构成［】３Ｊ。主要有三个因素．胶原的分子结构、钙一磷矿物质的结构形态以及他们之间相互连接的关系。骨基质是人体中钙．磷的主要储存库。骨矿物质大部分以无定形的磷酸钙和结晶的羟基磷灰石的形式分布于有机质中。在实验中证实了骨组织中的大多数矿物质晶体的形成都和胶原纤维有密切相关。无定形磷酸钙以沉积的无机盐存在，属非晶体形态，无定形磷酸钙构成结晶的羟基磷灰石。扫描电镜观察下，羟基磷灰石结晶呈柱状．长４０～５０ｌｌｍ，宽４～６ａｍ。结晶体体积小，但密度大，故表面积大。这种结构有利于骨组织中的钙磷交换。
骨的坚硬程度取决于骨基质的钙一磷晶体排列，而骨的韧性和弹性则有赖于它的胶原纤维的排列。胶
原纤维在钙．磷晶体排列之间走行。胶原是骨组织中
体表面的形态信息传递至监视器，然后由相连的计算
机处理成像。在多功能ＡＦＭ中有一种特殊的“接触”模式，测量时仪器上的探针处于振荡状态，ＡＦＭ的这种模式能提高显微镜对表面起伏中侧面形态的解析度，同时对标本的损害也减少到最小程度，ＡＦＭ对一些标本的纳米级结构成像很清晰，它的纳米级测量也很精确。我们应用原子力显微镜结合扫描电镜检测骨组织表面的显微结构，统计骨陷窝和骨小管的直径，以及各个结构的关系舯］。
我们使用ＡＦＭ得到直接的三维证据骨内的游
离矿物质的形状和大小。大约有９８％的矿物质是小
于６０ａｍ厚，矿物质大小呈柱壮结构．底部宽厚为
４０～５０ｎｍ。陷窝小管系统的排列是骨内的流体力学和
分子传输的基础［９．ｍ］，为骨陷窝中的骨细胞传递营养
万方数据
・４０６・第一军医大学学报（ＪＦｉｒｓｔＭｉｌＭｅｄＵｎｉｖ）第２５卷
最重要的结构．胶原纤维的结构和排列决定钙一磷晶体的大小和位置［１４］。骨的胶原纤维与结缔组织胶原纤维形态基本相同，胶原纤维的直径为５０～７０ｎｌｉｌ。胶原纤维由胶原蛋白排列呈圆柱形的交叉排列，其中有两个特征区域存在，一个缺口在沿长轴排列的胶原分子羧基终点和邻近分子的氨基终点之间形成；胶原分子呈环形排列中间形成一个孔状结构ｎｓ－。ＡＦＭ证实胶原纤维和矿物质之间的关系是密切的，胶原蛋白的分子结构的改变可导致钙．磷晶体的结构发生变化。骨的胶原原纤维和其他胶原蛋白最大不同是它在稀酸液中不膨胀．也不溶解于可溶解其他胶原的溶剂中．如中性盐和稀酸溶液等。骨的胶原蛋白分子之间有较多的分子交联，在骨代谢的同时，胶原蛋白也不断的降解和合成。无机质和有机质结合，使骨组织具有坚强的支持能力．并能适应物质代谢的要求。
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ｌａｃｕｎｏｃａｎａｌｉｃｕｌａｒ
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２００５；２５（４）
第一军医大学学报（ＪＦｉｒｓｔＭｉｌＭｅｄＵｎｉｖ）・４０３・
骨组织结构显微形态分析
陈斌，裴国献，刘晓霞，秦煜，汪群立（南方医科大学南方医院创伤骨科，广东广州５１０５１５）
摘要：目的应用原子力显微镜和扫描电镜观察分析人长管状骨组织中的微观结构，以了解骨组织的超微结构以及胶原和矿物质的构成和形态。方法取新鲜人尸体肱骨标本，固定脱水，分别制作骨磨片和切成薄片，分别在光学显微镜、原子力显微镜和扫描电镜分析骨组织矿化区的结构。结果在光学显微镜下，骨陷窝呈环状排列在哈佛管周围，骨小管沟通骨陷窝与哈佛管和骨陷窝之间的联系。在原子力显微镜的观察下，大胶原蛋白的形态清楚显示；在矿化区胶原蛋白纤维增厚．呈小盘叠加形态，钙一磷晶体呈椭圆柱形状；可清晰观察到骨小管和骨陷窝的大小和形态及骨小管和骨陷窝的关系。在扫描电镜下，骨基质呈环形沿哈佛系统排列，钙一磷晶体之间相互呈规则排列。结论原子力显微镜可分析胶原蛋白和基质中钙一磷晶体的三维结构形态、骨小管和骨陷窝的三维构成及大小；骨小管是交流营养物质和分子信号到骨陷窝中骨细胞的通道。
关键词：骨小管；骨陷窝；原子力显微镜；扫描电镜；骨组织；形态学中图分类号：Ｒ３２２．７：Ｑ一３３６
文献标识码：Ａ
文章编号：１０００．２５８８（２００５）０４—０４０３—０４
Ｏｐｔｉｃａｌ，ｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎａｎｄａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｈｕｍａｎｈｕｍｅｒａｌｂｏｎｅ
ＣＨＥＮＢｉｎ，ＰＥＩＧｕｏ—ｘｉａｎ，ＬＩＵ
．，、。，
Ԭ
Ｘｉａｏ—ｘｉａ，ＱＩＮＹｕ，ＷＡＮＧＱｕｎ—ｌｉ
。
．、
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓａｎｄＴｒａｕｍａｔｏｉｏｇｙ，ＮａｎｆａｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，ＳｏｕｔｈｅｒｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０５１５，
Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｔｏ
Ｔｏ
ｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｈｕｍａｎｌｏｎｇｂｏｎｅｗｉｔｈｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎａｎｄａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ
ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｔｈｅｕｌｔｒａｓｔｍｃｔｕｒａｌｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｂｏｎｅｃｏｌｌａｇｅｎａｎｄｍｉｎｅｒａｌｓ．
Ｆｒｅｓｈ
Ｍｅｔｈｏｄｈｕｍａｎｃａｄａｖｅｆｉｃｈｕｍｅｒａｌｂｏｎｅｗｅｒｅｆｉｘｅｄａｎｄｄｅｈｙｄｒａｔｅｄ
ｏｂｓｅｒｖｅｄｆｏｒｂｏｎｅｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｕｓｉｎｇｏｐｔｉｃａｌ
ｔｏ
ｐｒｅｐａｒｅｔｈｅｇｒｏｕｎｄ
ｅｌｅｃｔｒｏｎａｎｄ
ｓｅｃｔｉｏｎｓ
ａｎｄｔｈｉｎｓｌｉｃｅｓ，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｃｈｗｅｒｅ
ｓｃａｎｎｉｎｇａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＲｅｓｕｌｔｓＵｎｄｅｒｏｐｔｉｃａｌ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｔｈｅｂｏｎｅｌａｃｕｎａｅｗｅｒｅｉｎｃｉｒｃｕｌａｒｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎａｒｏｕｎｄｔｈｅＨａｖｅｒｓｉａｎｃａｎａｌ，
ｏｒ
ａｎｄｔｈｅｃａｎａｌｉｃｕｌｉｃｏｍｍｕｎｉｃｍｅｄｔｈｅｌａｃｕｎａｅａｎｄＨａｖｅｒｓｉａｎｃａｎａｌ
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｄｄｉｓｔｉｎｃｔ
ｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｌａｃｕｎａｅ．
Ａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
ｚｏｎｅ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｌａｒｇｅｃｌｕｓｔｅｒｓｏｆｃｏｌｌａｇｅｎ，ａｎｄｔｈｅｃｏｌｌａｇｅｎｆｉｂｅｒｓｔｈｉｃｋｅｎｅｄｉｎｔｈｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ
ａｎｄ
ａｐｐｅａｒｅｄｉｎｔｈｅｓｈａｐｅｏｆｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇｄｉｓｃｓ，ｗｈｅｒｅａｓｔｈｅｃａｌｃｉｕｍ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｃｒｙｓｔａｌｄｉｓｐｌａｙｅｄｅｌｌｉｐｓｅｃｙｌｉｎｄｅｒｓ．Ｔｈｅｓｉｚｅ，
ｓｈａｐｅａｎｄｒｅｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃａｎａｌｉｃｕｌｉａｎｄｌａｃｕｎａｅｗｅｒｅ
ｏｂｓｅｒｖｅｄｃｌｅａｒｌｙ．Ｔｈｅｂｏｎｅｍａｔｒｉｘｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｉｎｃｉｒｃｕｌａｒａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ
ａｌｏｎｇｔｈｅＨａｖｅｒｓｉａｎｃａｎａｌａｎｄｔｈｅｃａｌｃｉｕｍ—ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｃｒｙｓｔａｌｗａｓｉｎｒｅｇｕｌａｒａｌｉｇｎｍｅｎｔｕｎｄｅｒｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ
Ａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
ａｓ
ｃａｎ
ｈｅｌｐａｎａｌｙｚｅｔｈｅｔｈｒｅｅ・・ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｏｆｃａｌｃｉｕｍ－－ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｃｒｙｓｔａｌａｎｄ
ａｓ
ｂｏｎｅｃｏｌｌａｇｅｎ
ｓｉｇｎａｌｓ
ｗｅｌｌａｓｔｈｅｃａｎａｌｉｃｕｌｉａｎｄｌａｃｕｎａ．Ｔｈｅｃａｎａｌｉｃｕｌｉｓｅｒｖｅ
ｔｈｅｃｈａｎｎｅｌｓｍｅｄｉａｔｉｎｇａｌｉｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｉｎｔｏｔｈｅｌａｃｕｎａ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃａｎａｌｉｃｕｌｉ；ｌａｃｕｎａ；ａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ；ｂｏｎｅ
骨组织作为一种材料结构．是由多种坚硬单晶体及其基质构成。在骨基质中钙一磷矿物质和胶原占据绝大成分，钙一磷矿物质的形状和大小在骨组织内的离子平衡和骨的生物力学功能扮演重要的角色。测量骨组织的显微结构和骨矿物质密度是对临床整体评价骨折风险和决定骨科植入物生物材料的整体评估具有重大意义…２【。为提高测量骨组织的显微结构和骨矿物质密度的精确性，在疾病状态下评估骨的质
量．有必要对骨组织中的显微结构和矿物质的分子形态和大小进行测量＿３］。
１材料和方法
１．１原子力显微镜样品制备
取新鲜尸体的肱骨。清除软组织，在切取一小段骨组织，分别沿横切面和纵切面方向切成一５０斗ｍ厚的２ｍｍｘ２ｍｍ大小的片子，在２：１的氯仿和酒精中脱脂１２ｈ。ＰＢＳ液体冲洗，试样的底部或骨面待干燥
收稿１３期：２００４．０８—２９
基金项目：国家“８６３”计划（２００３ＡＡ２０５０１０）
ＳｕｐｐｏＳｅｄｂｙＮａｔｉｏｎａｌ８６３
后立即用快速干燥型氰基丙烯酸盐粘合剂（Ｍ２ｂｏｎｄ
２００ａｄｈｅｓｉｖｅ，ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｇｒｏｕｐＩＮＣ，ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ，
Ｐｒｏｇｒａｍ（２００３ＡＡ２０５０１０）
作者简介：陈斌（１９７２一），男．现为南方医科大学存读博士，电话：
０２０．６１６４ｌ１１４．８７２００
ＵＳＡ）粘贴于圆形盖玻片上（直径为１１５ｃｍ）。再用双面粘结条将盖玻片固定于原子力显微镜（ａｔｏｍｉｃ
ｆｏｒｃｅ
通讯作者：裴国献，博士生导师，教授，研究方向：创伤骨科和骨组织工程．电话：０２０—６１６４１７４１，Ｅ—ｍａｉｌ：ｎｆｐｅｎｙ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ＣＯＷｌ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＡＦＭ）的不锈钢圆盘。随后以磁力吸附、
万方数据
安放在删压电扫描器上以行ＡＦＭ扫描和成像…。
・４０４・
第一军医大学学报（Ｊ
Ｆｉｒｓｔ
ＭｉｌＭｅｄＵｎｉｖ）第２５卷
１．２扫描电镜样品的制作
取新鲜尸体的肱骨，清除软组织，在切取一小段骨组织．分别沿横切面和纵切面方向切成一５０
ｉ．ｚｍ
２４～３６
ｈ，分别在干骺端、骨干切取骨组织，分别在横
切面和纵切面切取小片骨组织，做磨片至１０－２０¨ｍ厚．氯化金增色，普通光学显微镜下观察。２结果
２．１骨磨片观察
哈佛管呈规则排列。骨陷窝呈环形排列在哈佛管的周围．一个哈佛管有３－９层骨陷窝环形排列，骨陷窝和哈佛管及骨陷窝之间有骨小管连接（图１－３）。哈佛管直径为３４．６～１２１．４（７２．２±１３．６）Ｉｘｍ。
厚的２ｍｍｘ２ｍｍ大小的片子，将标本沿矢状面劈开，固定于３％戊二醛溶液２４
ｈ，０．１
ｍｏｌ／Ｌ二甲砷酸钠缓
冲液冲洗．１０％次氯酸钠溶液处理６ｈ，逐级乙醇脱水，乙醚浸泡。临界点干燥，真空喷金，在日产Ｓ－４５０型扫描电镜观察［５］。１．３骨磨片的制作
取新鲜成人尸体肱骨标本，中性福尔马林固定
图ｌ骨组织磨片。可见哈佛管周围骨陷窝环形排列，骨小管呈细丝样排列，沟通骨陷窝之间的联系（原放大倍数：ｘ２００）
Ｆｉｇ．１Ａ
ｂｏｎｅｇｒｏｕｎｄｓｅｃｔｉｏｎｓｈｏｗｉｎｇｃｉｒｃｕｌａｒｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｂｏｎｅｌａｃｕｎａｅａｒｏｕｎｄｔｈｅＨａｖｅｒｓｉａｎｃａｎａｌａｎｄｔａｈｔｔｈｅｃａｎａｌｉｃｕｌｉ
ｌｉｎｅｕｐ
ａｓ
ｆｉｎｅｔｈｒｅａｄｓａｎｄｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｅ
ｔｈｅｌａｃｕｎａｅ（Ｏｒｉｇｉｎａｌｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：×２００）
图２骨组织磨片，见骨小管沟通骨陷窝之间的联系（原放大倍数：ｘ４００）
Ｆｉｇ．２
Ａｂｏｎｅｇｒｏｕｎｄ
ｓｅｃｔｉｏｎｓｈｏｗｉｎｇｔｈｅｌｉｎｋｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｃａｎａｌｉｃｕｌｉｌａｃｕｎａｅ（Ｏｒｉｇｉｎａｌｍａｇｎ湎ｃａｔｉｏｎ：×４００）
图３骨组织磨片。见骨小管沟通骨陷窝之间的联系（原放大倍数：×１ｏｏｏ）
Ｆｉｇ．３
Ａｂｏｎｅｇｒｏｕｎｄｓｅｃｔｉｏｎｓｈｏｗｉｎｇｎｕｍｅｒｏｕｓｃａｎａｌｉｃｕｌｉ
ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｌａｃｕｎａｅｆＯｒｉｇｉｎａｌｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｘｌ０００）
２．２原子力显微镜下
骨组织中钙一磷晶体呈柱状排列．骨小管沟通骨
佛系统为中心环形规则排列，相邻之间的骨陷窝间隔为１０～４０ｔｘｍ（图４、５）。钙．磷晶体排列呈小柱状，环绕着哈佛系统排列，单个晶体大小为８０－２００（１７４．６±５７．５）ａｍ，但仍有少数晶体的大小为４０ｎｍ。
陷窝，骨小管的直径为１００－３００（２００．２＋５１．８）ｍ，骨
陷窝为椭圆形结构，长轴直径为４．１～１０．５（７．４ｌ±１．８２）¨ｍ。每一个骨陷窝有２０－４０条骨小管与其交通，以哈
Ｆｉｇ．４
Ｆｉｇ．５
图４原子力显微镜镜下观察骨小管的形态和骨基质中钙一磷晶体的形态
Ｆｉｇ．４
Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
ｏｆｔｈｅｃａｎａｌｉｃｕｌｉａｎｄ
ｃａｌｃｉｕｍ—ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｃｒｙｓｔａｌｓｉｎｂｏｎｅｍａｔｒｉｘｓｈｏｗ，Ｉｌｂｙａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
图５原子力显微镜下骨陷窝的形态以及骨小管和骨陷窝之间的关系
万方数据 Ｆｉｇ．５Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ
ｏｆｔｈｅｌａｃｕｎａｅａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｃａｎａｌｉｃｎｉｉｓｈｏｗｎｂｙａｔｏｍｉｃｆｏｒｃｅ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
第４期陈斌．等．骨组织结构显微形态分析
・４０５・
２．３扫描电镜观察
骨组织中的矿物质晶体呈同心圆包绕着哈佛系统，钙一磷晶体排列呈规则状，胶原纤维的呈环状排
列，胶原纤维的排列方向和骨陷窝的排列方向一致（图６、７）。
图６扫描电镜观察哈佛管，可见哈佛系统内胶原呈环形规则排列（原放大倍数：ｘｌ０００）
Ｆｉｇ．６ＣｉｒｃｕｌａｒａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅｃｏｌｌａｇｅｎｉｎｔｈｅＨａｖｅｒｓｉａｎｓｙｓｔｅｍｓｈｏｗｎｂｙｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ
（Ｏｒｉｇｉｎａｌｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｘ１ｏｏｏ）
图７扫描电镜观察可见胶原形态（原放大倍数：ｘ２０００）
Ｆｉｇ．７
Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｔｈｅｃｏｌｌａｇｅｎｓｈｏｗｎｂｙｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Ｏｒｉｇｉｎａｌｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｘ２０００）
３讨论
骨组织的显微结构和骨组织的功能有密切关系．骨组织的显微结构的改变对骨的生物力学有着显著的影响。骨组织中的晶体是在初始的矿物质沉积的基础上，通过吸附钙磷形成。当钙磷晶体吸附成一定的体积后达到一个动态的平衡。骨组织的显微结构在骨的病理状态下如骨质疏松．骨的矿化区晶体的结构发生明显的变化，从而在更小的外力作用下导致骨折。在生物植入材料时如同种异体骨，通过爬行替代的时候，矿物质的沉积．形成晶体结构，这些晶体机构和骨组织的生物力学有密切相关。
ＡＦＭ是一种新的工具．它是一种能显示物体表面超微结构的高精密度观测仪，主要使用一根极尖锐的探针接触物体表面．通过激光的会聚与反射，将物
物质的功能。骨小管的直径为５０—１２０ｎｌＴｌ，平均为（７０±２６）ａｍ，骨小管在骨组织中的功能是运送营养物质、交换离子和传递分子信号到骨陷窝中的骨细胞。骨陷窝呈椭圆形，其大小为２．ｏ￣５．０肛ｍ，骨陷窝内有骨细胞、成骨细胞和破骨细胞，骨细胞调节矿物质
的代谢。在本实验观察到每个骨陷窝内有２０－－４０条
骨小管与其沟通。胶原纤维沿骨小管排列，其方向和骨小管排列方向基本一致。陷窝小管系统这样的结构为骨组织中流体力学和分子的传输到骨细胞具有重要的意义［１１，１２］。骨细胞通过骨小管传递分子信号，调节骨基质中游离矿物质的形态和大小。
骨组织的力学和化学的性能主要取决于其构成物．胶原和钙一磷晶体的特性，但不是胶原和钙一磷晶体特性的简单叠加．而是取决于其构成的分子结构及构成［】３Ｊ。主要有三个因素．胶原的分子结构、钙一磷矿物质的结构形态以及他们之间相互连接的关系。骨基质是人体中钙．磷的主要储存库。骨矿物质大部分以无定形的磷酸钙和结晶的羟基磷灰石的形式分布于有机质中。在实验中证实了骨组织中的大多数矿物质晶体的形成都和胶原纤维有密切相关。无定形磷酸钙以沉积的无机盐存在，属非晶体形态，无定形磷酸钙构成结晶的羟基磷灰石。扫描电镜观察下，羟基磷灰石结晶呈柱状．长４０～５０ｌｌｍ，宽４～６ａｍ。结晶体体积小，但密度大，故表面积大。这种结构有利于骨组织中的钙磷交换。
骨的坚硬程度取决于骨基质的钙一磷晶体排列，而骨的韧性和弹性则有赖于它的胶原纤维的排列。胶
原纤维在钙．磷晶体排列之间走行。胶原是骨组织中
体表面的形态信息传递至监视器，然后由相连的计算
机处理成像。在多功能ＡＦＭ中有一种特殊的“接触”模式，测量时仪器上的探针处于振荡状态，ＡＦＭ的这种模式能提高显微镜对表面起伏中侧面形态的解析度，同时对标本的损害也减少到最小程度，ＡＦＭ对一些标本的纳米级结构成像很清晰，它的纳米级测量也很精确。我们应用原子力显微镜结合扫描电镜检测骨组织表面的显微结构，统计骨陷窝和骨小管的直径，以及各个结构的关系舯］。
我们使用ＡＦＭ得到直接的三维证据骨内的游
离矿物质的形状和大小。大约有９８％的矿物质是小
于６０ａｍ厚，矿物质大小呈柱壮结构．底部宽厚为
４０～５０ｎｍ。陷窝小管系统的排列是骨内的流体力学和
分子传输的基础［９．ｍ］，为骨陷窝中的骨细胞传递营养
万方数据
・４０６・第一军医大学学报（ＪＦｉｒｓｔＭｉｌＭｅｄＵｎｉｖ）第２５卷
最重要的结构．胶原纤维的结构和排列决定钙一磷晶体的大小和位置［１４］。骨的胶原纤维与结缔组织胶原纤维形态基本相同，胶原纤维的直径为５０～７０ｎｌｉｌ。胶原纤维由胶原蛋白排列呈圆柱形的交叉排列，其中有两个特征区域存在，一个缺口在沿长轴排列的胶原分子羧基终点和邻近分子的氨基终点之间形成；胶原分子呈环形排列中间形成一个孔状结构ｎｓ－。ＡＦＭ证实胶原纤维和矿物质之间的关系是密切的，胶原蛋白的分子结构的改变可导致钙．磷晶体的结构发生变化。骨的胶原原纤维和其他胶原蛋白最大不同是它在稀酸液中不膨胀．也不溶解于可溶解其他胶原的溶剂中．如中性盐和稀酸溶液等。骨的胶原蛋白分子之间有较多的分子交联，在骨代谢的同时，胶原蛋白也不断的降解和合成。无机质和有机质结合，使骨组织具有坚强的支持能力．并能适应物质代谢的要求。
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