64中 国 油 脂 2002年第27卷第4期
文章编号:1003—7969(2002) 04—0064—04 中图分类号:TQ64519+6 文献标识码:A
磷脂含量及组成的分析检测方法
汪 勇, 王兴国, 胡学烟
(江南大学食品学院,214036江苏省无锡市惠河路170号)
摘要:综述了定量分析磷脂组成及含量的分析方法, 重点介绍了T LC 和HP LC 方法, 并列举了
HP LC 分析方法的不同类型检测器。
、中的应用。
关键词:磷脂; 分析;T LC ;HP 1 2 磷脂组成分析和检测211 T LC 法
T LC 可分为单向和双向两种。一般单向展开可
混合物, 浓缩磷脂经丙酮脱油可制得粉末磷脂。商
品化的磷脂经常要测定其中的磷脂含量, 惯用的方法是丙酮不溶物(AI ) 法。磷脂一般不溶于丙酮, 当有油脂存在时, 磷脂在丙酮中有一定的溶解度。丙酮不溶物的测定可以参照AOCS O fficial Method Ja4-46[1], 方法中先用粉末磷脂饱和丙酮, 操作时要保
以很好地分离磷脂的一些主要成分, 但是仍有一些成分的保留值(R f ) 接近, 这时就需要选择另一种展开剂再一次的展开分开这些成分, 做进一步的成分分析。
AOCS O fficial Method Ja7-86[4]是一种双向展开
持丙酮低温, 使丙酮对测定样品中磷脂不溶解, 保证结果的准确性。美国的浓缩磷脂产品一般要求AI ≥62%, 粉末磷脂AI ≥96%。其中丙酮不溶物中包括非磷脂成分的糖和糖酯, 严格意义上讲, 丙酮不溶物含量只能较粗略的反应磷脂含量。 磷脂的总磷含量是反应磷脂纯度的另一个指标。对于不同的磷脂产品, 相应的标准也做出了规定, 一般浓缩磷脂磷含量在210%左右, 粉末磷脂磷含量约为3%。AOCS O fficial Method Ja5-55[2]是标准的测定磷脂总磷含量的方法, 其原理是磷脂样品经皂化、灰化后与硝酸反应, 再与钼酸铵溶液形成黄色的磷钼酸盐沉淀。用定量的氢氧化钠标准溶液溶解沉淀物, 并用硝酸标准溶液滴定过量的氢氧化钠。这个方法耗时费事, 分析一次要4h -5h 。廖学辉等[3]用络合光度法测定磷脂的总磷量, 待测的磷脂用浓硫酸先消化至出现硫酸环, 再加高氯酸消化至无色。用水定容后加入钒钼酸盐形成络合物, 在317nm 下测定吸光度, 用标准曲线法得出待测样品的磷含量, 改进的方法较为快速。
收稿日期:2001—10—13
) , 男, 助教/硕士; 主要从事油作者简介:汪 勇(1977—
的方法, 用的展开剂A 为氯仿-甲醇-7m ol/l 氨水
(65∶30∶4,v/v/v ) , 和展开剂B 氯仿-甲醇-醋酸-水(170∶25∶25∶6,v/v/v/v ) 。展开后用碘显色, 再刮下各显色部分, 用高氯酸和硝酸分别消化至无色, 在310nm 下比色, 得到的结果用标准曲线定量。
用二异丁基甲酮-醋酸-水(40∶25∶317,v/v/v ) 可以较好地分离动物磷脂的各个组分[5], 但是当
应用于植物磷脂时, 由于糖酯的干扰,PC 和糖酯的R f 值接近, 很难得到满意的结果。用双向的T LC 法可以很好地分离植物磷脂的各个部分, 展开剂A 为氯仿-甲醇-水(65∶25∶4,v/v/v ) , 展开剂B 为正丁醇-醋酸-水(60∶20∶20,v/v/v ) 。马辰等[6]用氯仿-甲醇-冰醋酸-丙酮-水(45∶25∶7∶4∶2,v/v/v/v/v ) 配制展开剂, 对磷脂进行展开, 不仅可以很好地分开7种主要磷脂, 而且PS 、PI 在薄层上也较好地分离了。再用钼酸和硫酸肼喷涂, 挥干溶剂后用硫酸甲醇(10%) 显色, 在700nm 下扫描测定各组成含量。徐桂云[7]等用展开剂A 氯仿-甲醇-冰醋酸-丙酮-水(35∶25∶5∶14∶2,v/v/v/v/v ) 和B 正己烷-乙醚(4∶1,v/v ) 对大豆磷脂进行双向展开, 用磷钼酸乙醇溶液(5%-10%,w/v ) 和Dittmer 试剂显色,
在检测波长650nm 参比波长400nm 下扫描, 测定各组分含量。
脂副产品的开发利用的研究工作。
2002年第27卷第4期 中 国 油 脂65
G 1Lendrath 等[8]研究了植物磷脂在薄层色谱上
的特性, 并优化了展开剂及检测条件。他研究发现, 当用氯仿-甲醇-水做展开剂时, 水在展开剂中含量微小的变化都会对T LC 的分离效果产生较大影响, 用醋酸缓冲液(pH =410) 代替水可以获得更好的分离效果。用015%的磷酸预先饱和硅胶薄板也可以提高各组分的分离效果。J. M. Nzai [9]等用T LC -显影光密度分析法, 测定大豆油中磷脂的组成。他先用2%的水水化大豆油, 离心分离油脚, 再用丙酮去除油脚中的水分和油脂。干燥后得到的粗磷脂再通过硅胶柱用氯仿洗脱中性油, 其中的磷脂。-水(∶3,v/v/v ) , , 。R. Przybylskl [10]等用T LC 和火焰电离检测器(FI D ) 测定Canola 油的磷脂组成。他用展开剂A 氯仿-甲醇-醋酸-水(80∶14∶14∶3,v/v/v/v ) , 分离PC 、PA 和LPC , 用展开剂氯仿-甲醇-氨水(65∶25∶2,v/v/v ) , 分离PE 和PI 。样品点在石英棒上, 石英棒放在专用的框架上展开, 再放入FI D 中检测。王兴国等[11]也用T LC/FI D 测定了大豆磷脂的组成, 并把结果同液相色谱做了比较。212 HP LC 法
HP LC 是一种快速准确的检测磷脂各部分组成的方法。一般的柱固定相为硅胶, 流动相种类多为正己烷-异丙醇-水或者乙腈-甲醇-水, 但其中各自的比例不同研究者之间的差别很大。虽然脂质缺乏特征吸收, 但是由于不饱和基团和官能团如:碳碳双键、羰基、磷酸基团、氨基等存在。其在200nm -214nm 下有强吸收。所以较为广泛应用的检测器是紫外, 但是也有用荧光、离子火焰、折光指数和光散射等检测器的。
AOCS O fficial Method Ja7b -91[12]可以应用于浓缩磷脂、粉末磷脂、分提磷脂的组成分析。用Lichros orb Si -60硅胶色谱柱, 流动相为正己烷-异丙醇-醋酸盐缓冲液(pH =412) (8∶8∶1,v/v/v ) , 用UV 在206nm 检测。董晓渭等[13]用HP LC 测定了大
相, 紫外检测波长为205nm 。样品用甲醇配制成1
mg/ml 的溶液。杨玲等[15]分析大豆磷脂胶囊时, 用异丙醇-正己烷(4∶3,v/v ) 和异丙醇-正己烷-水(8∶6∶115,v/v/v ) 做流动相梯度洗脱, 在205nm 下检测, 可以完全分离磷脂胶囊中的各种磷脂成分, 但是基线有一定的漂移。T. L. M ounts 等[16]用HP LC 分析毛油中磷脂的组成用以评估大豆的变质情况, 用异丙醇-正己烷-水从42∶56∶2到51∶38∶11(v/v/v ) 梯度洗脱, 在206nm , 破坏的大豆制PC 、PI 、A. Careli 等[17]用固相萃取S olid Phase Extraction ) -HP LC 方法定量的分析了葵花籽油中的磷脂含量及成分。所谓固相萃取(SPE ) 就是用粘合了二醇相(固相) 微型萃取柱吸附油中的磷脂, 具体步骤如下:先用2ml 甲醇、2ml 氯仿,4ml 正己烷预处理柱体, 再用微量进样器吸毛油的氯仿溶液50mg -150mg 注射进萃取柱。用215ml 氯仿洗脱出绝大部分的中性油, 再用含有015%氨水(25%) 的甲醇7ml 洗脱出其中的磷脂部分, 洗脱液用氮气吹干, 用100μl 流动相溶解, 直接用HP LC 分析, 在206nm 下检测含量。
由于磷脂种类的繁多, 其脂肪酸组成也有很大差异, 磷脂必然在UV 的吸收较为复杂, 这给一些磷脂的定量造成了困难。一些学者试图用其他检测器来得到更好的分析结果。J. S. Rhee 等[18]用折光指数(RI ) 检测器替代惯用的紫外检测器分析大豆磷脂中的卵磷脂成分, 他用氯仿-甲醇-醋酸-水(14∶14∶1∶1,v/v/v/v ) 做流动相。Merlin D. G rieser 等[19]用梯度洗脱和火焰电离检测器测定了大豆和玉米磷脂的各组分含量, 得到的图谱基线平稳, 可以很好地检测PC 、PE 、PI 甚至脂肪酸和甘油三酯的含量。S. Shi 2Hua Chen 等[20]用荧光检测器在342nm (激发) 和500nm (发射) 波长下检测磷脂含量, 磷脂先要和Dns 2C1进行反应, 得到的衍生物用HP LC 分离检测, 流动相为A 二氯甲烷-甲醇-15m ol/l 氨水(91∶9∶1,v/v/v ) 、B 二氯甲烷
-甲醇-15m ol/l 氨水(70∶20∶5,v/v/v ) , 梯度洗脱。
在分析和检测磷脂各部分组成时, 用单一的流动相不能把所有的磷脂分离得很好, 较为合理的解决方案是用流动相梯度洗脱。但是当用UV 检测器时, 由于流动相的变化其基线势必漂移, 这就影响了分析结果的准确性。折光指数检测器同样不能用于有梯度洗脱的HP LC 分析。一种新的检测器就应运
豆磷脂中磷脂酰胆碱的含量, 采用Lichros orb Si -60硅胶色谱柱, 以正己烷-异丙醇-磷酸-水(45∶48∶0115∶715,v/v/v/v ) 为流动相。样品用正己烷-异丙醇(1∶1,v/v ) 溶解, 在紫外检测器206nm 下检测。他用磷酸代替了醋酸盐缓冲液, 得到的基线很稳定。何新霞等[14]用HP LC 分析大豆磷脂中的卵磷脂含量时, 用乙腈-甲醇-水(65∶21∶14,v/v/v ) 做流动
66中 国 油 脂 2002年第27卷第4期
而生了, 这就是(蒸发) 光散射检测器(ES LD ) 。它是
把流动相喷入有热气流的检测器中, 流动相蒸发而不挥发性的脂质形成微小液滴。这些液滴散射照向光电倍增器的光, 引起电流的变化, 根据脂质的量不同电流的大小也不同, 从而达到检测的目的。从发展的眼光来看, 光散射检测器大有取代传统的UV 检测器的态势。Paul Van Der Meeren 等[21]较早使用这种检测器分析大豆磷脂, 他用正己烷-异丙醇-水从5718∶39∶312到5216∶42∶514(v/v/v ) 梯度洗脱大豆磷脂, 可以很好地分析N L (中性脂质) 、PE 、PI 、PA 和PC 。T ong Wang 等[22]用(蒸发) 分析了23种大豆磷脂的含量, 酸组成。-(153175,v/v/v/v ) , 化, 这些变化可能会影响大豆磷脂的物理特性, 也将改变其在生物膜中的生理功能。T. L M ounts 等[23]用HP LC 和ES LD 分析了储存不同时间大豆制得的大豆油中磷脂的组成, 以及这些磷脂的脂肪酸的变化。高水分含量(14%) 大豆储存10天磷脂将被破坏40%。
有时我们要分析不同食品中磷脂含量, 对于一个复杂的食品体系而言, 分析其中的磷脂含量是一个相对难度较大的工作。M. N. Vaghela 等[24]用HP LC 和(蒸发) 光散射检测器分析了浓缩乳清蛋白中的磷脂含量及组成。先加2倍质量的水于乳清浓缩蛋白中, 磁力搅拌15min , 再加入10倍质量的氯仿-甲醇(1∶1,v/v ) 在6000r/min 下均质1min , 在2800r/min 下离心5min 。得到的上清液留用, 再用相同体积的氯仿-甲醇((2∶1,v/v ) 溶液二次萃取乳清浓缩蛋白, 得到的上清液和第一次的上清液合并, 蒸发脱除溶剂得到粗脂质, 用凝胶过滤除去粗脂质中的非脂部分。得到的脂质用固相萃取(SPE ) 分离脂质中的中性脂质得到磷脂, 磷脂用HP LC 和(蒸发) 光散射检测器(E LS D ) 分析组成。流动相用A 氯仿-甲醇(8∶2,v/v ) 和B 氯仿-甲醇-水-20%的氨水(60∶34∶6∶0125,v/v/v/v ) 梯度洗脱。Maria Fiorenza Caboni 等[25]用不同的SPE 柱分析了鸡蛋、鸡肉、熟
-30%氨水(80∶1915∶015,v/v/v ) 和B 氯仿-甲醇-水-30%氨水(60∶34∶515∶015,v/v/v/v ) 梯度洗脱。
在用HP LC 分析磷脂时再配备质谱仪可以分析大豆磷脂的分子量分布, 以及各种磷脂的分子种类。J. A. Singleton 等[26]用HP LC 和快速原子轰击质谱仪(FAB MS ) 分析了花生磷脂的分子种类。花生中的
脂质用氯仿-甲醇萃取后, 用硅胶柱在HP LC 上分离中性脂质, 得到磷脂。磷脂再用HP LC 硅胶柱梯
。得到的各C 8, 用和PI 有六种分子。Jos F. H. M. Brouwers 等[27]用HP LC 和E LS D 分析了无病猪的
心、肝、皮等部位的PC 的分子种类。213 其他分析方法
核磁共振(NMR ) 技术用于磷脂的分析是20世纪90年代才发展成熟的新技术, 它利用磷原子的
31
P 的核磁共振效应来分析各种磷脂的组成和含量。
Thomas G lonek [28]用核磁共振分析了乙醇分提富集PC 的磷脂的各组分含量, 磷脂用甲醇-氯仿溶解,
再用E DT A 溶液沉淀其中的高价的金属离子, 消除其对31P NMR 的干扰,
核磁共振在20214MH z 下对磷脂进行分析。不同类型的磷脂由于化学环境不同, 31P 的化学位移也不同, 由此来确定各种不同磷脂的种类。各种磷脂的含量由核磁响应信号的积分确定。施邑屏等[29]用31P 核磁共振分析了针剂大豆卵磷脂的组分含量, 他用90MH z 的核磁共振光谱分析, 用85%的磷酸和氘代氯仿做参比。
红外光谱一般用于分子结构鉴定。常用的红外波数范围是400cm -1-4000cm -1, 但也有学者用它来确定一些成分的含量。J. M. Nzai 等[30]用傅立叶转换红外光谱(FTIR ) 分析了大豆中磷脂的组成, 他先用标准磷脂混合样品(含39%PC 、22%PI 、27%PE ) 溶解在氯仿中, 配成各种浓度的标准溶液用于确定磷脂的各种化学键振动的波数, 并绘制标准曲线。再用标准曲线确定大豆磷脂的含量。Vladimir A. Ery omin 等[31]利用染料Victoria 蓝R 、B 和磷脂(除了PC 、溶血磷脂和神经酰鞘磷脂) 显色的原理测定了磷脂的含量。
参 考 文 献
[1] AOCS O ffical Method Ja4-461[2] AOCS O fficial Method Ja5-551
[3] 廖学辉1络合光度法测定卵磷脂的总磷量[J]1广东药
干酪、意大利腊肠中磷脂的组成, 他用Floch 方法得
到鸡蛋中的全部脂质, 再用硅胶、氨丙基、C 18、C 8四种SPE 除去中性脂质, 富集磷脂, 得到的磷脂含量和推荐的M orris on 方法进行比较, 发现C 8柱的回收率达9713%, 而其他柱的回收率较低。得到的磷脂用HP LC 和E LS D 进行检测, 用流动相A 氯仿-甲醇
学,1999,9(4) :22-23.
2002年第27卷第4期 中 国 油
脂[4] AOCS O fficial Method Ja7-861[5] William W Christie. Lipid Analysis[M]1New Y ork :Pergamon
Press ,19821[6] 马 辰, 段宏瑾1大豆磷脂中磷脂类成分的含量测定
[J]1中国中药杂志,1999,24(11) :671-6721[7] 徐桂云, 常理文1大豆磷脂组成的薄层色谱分析[J]1
分析化学,1998,26(1) :81-841
[8] G. Lendrath . Behavior of Vegetable Phospholipids in Thin 2
Layer Chromatography :Optimization of M obile Phase , Detec tion and Direct Evaluation [J ]1Journal of Chromatography , 1990,502:3851[9] J. M. Nzai ,A. Proctor. Phospholipids Determination in Veg 2
etable Oil by Thin -Layer Chromatography and Imaging Den 2sitometry[J]1F ood Chemistry ,1998,63(4) 5761[10] R. Przybylskl ;N. Canola the easured by T Detector [J ]1JAOCS , 1991,68(4) -2451[11] 王兴国, 裘爱泳1棒薄层色谱氢火焰定量测定磷脂组
成[J]1无锡轻工大学学报,1995,14(1) :31-371[12] AOCS O fficial Method Ja7b -911[13] 董晓渭, 冯学伟1高效液相色谱测定大豆磷脂中的磷
脂酰胆碱[J]1华东理工大学学报,2000,26(3) :315-3171[14] 何新霞, 郑孝华1HP LC 法测定大豆磷脂中卵磷脂含量
[J]1食品科学,2000,21(2) :57-591[15] 杨 玲, 何新霞1HP LC 分析大豆脂胶囊的磷脂成分
[J]1食品科学,2000,21(2) :53-541
[16] T. L. M ounts. HP LC Analysis of Phospholipids in Crude Oil
for Evaluation of S oybean Deterioration[J]1JAOCS ,1990,67(11) :757-7601[17] Amalia A. Careli ,Marta I. V. Brevedan , et al. Quantitative
Determination of Phospholipids in Sun flower Oil [J]1JAOCS ,1997,74(5) :511-5141[18] J . S. Rhee ,M. G. Shin. Analysisof Phosphatidylcholine in
S oy Lecithins by HP LC[J]1JAOCS ,1982,59(2) :98-991[19] Merlin D. G rieser ,Jereme N. G reske. Higy Performance Liq 2
uid Chromatogralphy of Phospholipids with Flame I onization Detection[J]1JAOCS ,1989,66(10) :1484-14871[20] S. Shi 2Hua Chen , Anne Y. K ou , et al . Measurement of
E thanolamine 2and Serine 2C ontaining Phospholipids by High 2Performance Liquid Chromatography with Fluorescence
67
Detection of Their Dns Derivatives [J ]1Journal of Chrom 2atography ,1981,208:339-3461[21] Paul Van Der Meeren ,Jan Vanderdeelen , et al . S imple and
Rapid Method for High 2Performance Liquid Chromatographic Separation and Quantification of S oybean Phospholipids [J]1Journal of Chromatography ,1988,447:436-4421[22] T ong Wang , Earl G. Hamm ond . Fractionation of S oybean
Phospholipids by High 2Performance Liquid Chromatography with Evaporative Light 2Scattering Detector [J ]1JAOCS , 1999,76(11) :1313-13211[23] T. L. M ounts ,S. L. Abldl. HP LC of Phospholipids by
Detection [J]1JAOCS , ) -] ilara. Analysis of Phospho 2
Whey Protein C oncentrates by High 2Performance Liquid Chromatography With a Narrow 2Bore C olumn and an Evaporative Light 2Scattering Detector [J]1JAOCS ,1995,72(6) :729-7331
[25] Maria Fiorenza Caboni , Ciovanni Lercker . Separation and
Analysis of Phospholipids in Different F oods With a Light 2ScatteringDetector [J ]1JAOCS , 1996, 73(11) :1561-15661[26] J. A. S ingleton ,M. Ruan. Separation and Characterization of
Peanut Phospholipid M olecular S pecies Using High 2Perfor 2mance Liquid Chromatography and Fast Atom Bombardment Mass S pectrometry[J]1JAOCS ,1999,76(1) :49-551[27] Jos F. H. M. Brouwers , BarendM. G adella. Quantitative
Analysis of Phosphatidycholine M olecular S pecies Using HP LC and Light Scattering Detection [J ]1Journal of Lipid Research ,1998,39:344-3531[28] Thomas G lonek. 31P Nuclear Magnetic Res onance Phospho 2
lipid Analysis of Anionic 2Enriched Lecithin [J ]1JAOCS , 1998,75(5) :569-5731[29] 施邑屏, 黎燕斌131P 核磁共振光谱及薄层色谱分析针
剂大豆卵磷脂[J]1分析化学,1991,19(7) :733-7361[30] J. M. Nzai ,A. Proctor. S oy Lecithin Phospholipid Determina 2
tion by F ourier T rans form In frared S pectroscopy and the Acid Digest/Arseno 2M olybdate Method :A C omparative S tudy [J]1JAOCS ,1999,76(1) :61-661[31] Vladimir A. Ery omin ,Sergei P. P oznyakov. Quatitative Deter 2
mination of Phospholipids Using the Dyes Victoria Blue R and B[J]1Analytical Biochemistry ,1989,180:186-1911
Methods for Determination and Analysis of Phospholipids C omposition and C ontent
WANG Y ong ,WANG X ing 2guo ,HU Xue 2yan
(School of F ood Science and T echnology ,S outhern Y angtze University ,214036JiangsuWuxi ,P. R. C )
Abstract :The quantitative analysis method of phospholipids was reviewed ,especially the T LC and HP LC was intro 2
duced to determinate the com position and concentration of phospholopids. In addition ,s ome kinds of detectors of HP LC were stated. Furtherm ore ,nuclear magnetic res onance and F ourier trans form in frared technique was als o mentioned.
K ey w ords :phospholipids ;analysis ;T LC ;HP LC
64中 国 油 脂 2002年第27卷第4期
文章编号:1003—7969(2002) 04—0064—04 中图分类号:TQ64519+6 文献标识码:A
磷脂含量及组成的分析检测方法
汪 勇, 王兴国, 胡学烟
(江南大学食品学院,214036江苏省无锡市惠河路170号)
摘要:综述了定量分析磷脂组成及含量的分析方法, 重点介绍了T LC 和HP LC 方法, 并列举了
HP LC 分析方法的不同类型检测器。
、中的应用。
关键词:磷脂; 分析;T LC ;HP 1 2 磷脂组成分析和检测211 T LC 法
T LC 可分为单向和双向两种。一般单向展开可
混合物, 浓缩磷脂经丙酮脱油可制得粉末磷脂。商
品化的磷脂经常要测定其中的磷脂含量, 惯用的方法是丙酮不溶物(AI ) 法。磷脂一般不溶于丙酮, 当有油脂存在时, 磷脂在丙酮中有一定的溶解度。丙酮不溶物的测定可以参照AOCS O fficial Method Ja4-46[1], 方法中先用粉末磷脂饱和丙酮, 操作时要保
以很好地分离磷脂的一些主要成分, 但是仍有一些成分的保留值(R f ) 接近, 这时就需要选择另一种展开剂再一次的展开分开这些成分, 做进一步的成分分析。
AOCS O fficial Method Ja7-86[4]是一种双向展开
持丙酮低温, 使丙酮对测定样品中磷脂不溶解, 保证结果的准确性。美国的浓缩磷脂产品一般要求AI ≥62%, 粉末磷脂AI ≥96%。其中丙酮不溶物中包括非磷脂成分的糖和糖酯, 严格意义上讲, 丙酮不溶物含量只能较粗略的反应磷脂含量。 磷脂的总磷含量是反应磷脂纯度的另一个指标。对于不同的磷脂产品, 相应的标准也做出了规定, 一般浓缩磷脂磷含量在210%左右, 粉末磷脂磷含量约为3%。AOCS O fficial Method Ja5-55[2]是标准的测定磷脂总磷含量的方法, 其原理是磷脂样品经皂化、灰化后与硝酸反应, 再与钼酸铵溶液形成黄色的磷钼酸盐沉淀。用定量的氢氧化钠标准溶液溶解沉淀物, 并用硝酸标准溶液滴定过量的氢氧化钠。这个方法耗时费事, 分析一次要4h -5h 。廖学辉等[3]用络合光度法测定磷脂的总磷量, 待测的磷脂用浓硫酸先消化至出现硫酸环, 再加高氯酸消化至无色。用水定容后加入钒钼酸盐形成络合物, 在317nm 下测定吸光度, 用标准曲线法得出待测样品的磷含量, 改进的方法较为快速。
收稿日期:2001—10—13
) , 男, 助教/硕士; 主要从事油作者简介:汪 勇(1977—
的方法, 用的展开剂A 为氯仿-甲醇-7m ol/l 氨水
(65∶30∶4,v/v/v ) , 和展开剂B 氯仿-甲醇-醋酸-水(170∶25∶25∶6,v/v/v/v ) 。展开后用碘显色, 再刮下各显色部分, 用高氯酸和硝酸分别消化至无色, 在310nm 下比色, 得到的结果用标准曲线定量。
用二异丁基甲酮-醋酸-水(40∶25∶317,v/v/v ) 可以较好地分离动物磷脂的各个组分[5], 但是当
应用于植物磷脂时, 由于糖酯的干扰,PC 和糖酯的R f 值接近, 很难得到满意的结果。用双向的T LC 法可以很好地分离植物磷脂的各个部分, 展开剂A 为氯仿-甲醇-水(65∶25∶4,v/v/v ) , 展开剂B 为正丁醇-醋酸-水(60∶20∶20,v/v/v ) 。马辰等[6]用氯仿-甲醇-冰醋酸-丙酮-水(45∶25∶7∶4∶2,v/v/v/v/v ) 配制展开剂, 对磷脂进行展开, 不仅可以很好地分开7种主要磷脂, 而且PS 、PI 在薄层上也较好地分离了。再用钼酸和硫酸肼喷涂, 挥干溶剂后用硫酸甲醇(10%) 显色, 在700nm 下扫描测定各组成含量。徐桂云[7]等用展开剂A 氯仿-甲醇-冰醋酸-丙酮-水(35∶25∶5∶14∶2,v/v/v/v/v ) 和B 正己烷-乙醚(4∶1,v/v ) 对大豆磷脂进行双向展开, 用磷钼酸乙醇溶液(5%-10%,w/v ) 和Dittmer 试剂显色,
在检测波长650nm 参比波长400nm 下扫描, 测定各组分含量。
脂副产品的开发利用的研究工作。
2002年第27卷第4期 中 国 油 脂65
G 1Lendrath 等[8]研究了植物磷脂在薄层色谱上
的特性, 并优化了展开剂及检测条件。他研究发现, 当用氯仿-甲醇-水做展开剂时, 水在展开剂中含量微小的变化都会对T LC 的分离效果产生较大影响, 用醋酸缓冲液(pH =410) 代替水可以获得更好的分离效果。用015%的磷酸预先饱和硅胶薄板也可以提高各组分的分离效果。J. M. Nzai [9]等用T LC -显影光密度分析法, 测定大豆油中磷脂的组成。他先用2%的水水化大豆油, 离心分离油脚, 再用丙酮去除油脚中的水分和油脂。干燥后得到的粗磷脂再通过硅胶柱用氯仿洗脱中性油, 其中的磷脂。-水(∶3,v/v/v ) , , 。R. Przybylskl [10]等用T LC 和火焰电离检测器(FI D ) 测定Canola 油的磷脂组成。他用展开剂A 氯仿-甲醇-醋酸-水(80∶14∶14∶3,v/v/v/v ) , 分离PC 、PA 和LPC , 用展开剂氯仿-甲醇-氨水(65∶25∶2,v/v/v ) , 分离PE 和PI 。样品点在石英棒上, 石英棒放在专用的框架上展开, 再放入FI D 中检测。王兴国等[11]也用T LC/FI D 测定了大豆磷脂的组成, 并把结果同液相色谱做了比较。212 HP LC 法
HP LC 是一种快速准确的检测磷脂各部分组成的方法。一般的柱固定相为硅胶, 流动相种类多为正己烷-异丙醇-水或者乙腈-甲醇-水, 但其中各自的比例不同研究者之间的差别很大。虽然脂质缺乏特征吸收, 但是由于不饱和基团和官能团如:碳碳双键、羰基、磷酸基团、氨基等存在。其在200nm -214nm 下有强吸收。所以较为广泛应用的检测器是紫外, 但是也有用荧光、离子火焰、折光指数和光散射等检测器的。
AOCS O fficial Method Ja7b -91[12]可以应用于浓缩磷脂、粉末磷脂、分提磷脂的组成分析。用Lichros orb Si -60硅胶色谱柱, 流动相为正己烷-异丙醇-醋酸盐缓冲液(pH =412) (8∶8∶1,v/v/v ) , 用UV 在206nm 检测。董晓渭等[13]用HP LC 测定了大
相, 紫外检测波长为205nm 。样品用甲醇配制成1
mg/ml 的溶液。杨玲等[15]分析大豆磷脂胶囊时, 用异丙醇-正己烷(4∶3,v/v ) 和异丙醇-正己烷-水(8∶6∶115,v/v/v ) 做流动相梯度洗脱, 在205nm 下检测, 可以完全分离磷脂胶囊中的各种磷脂成分, 但是基线有一定的漂移。T. L. M ounts 等[16]用HP LC 分析毛油中磷脂的组成用以评估大豆的变质情况, 用异丙醇-正己烷-水从42∶56∶2到51∶38∶11(v/v/v ) 梯度洗脱, 在206nm , 破坏的大豆制PC 、PI 、A. Careli 等[17]用固相萃取S olid Phase Extraction ) -HP LC 方法定量的分析了葵花籽油中的磷脂含量及成分。所谓固相萃取(SPE ) 就是用粘合了二醇相(固相) 微型萃取柱吸附油中的磷脂, 具体步骤如下:先用2ml 甲醇、2ml 氯仿,4ml 正己烷预处理柱体, 再用微量进样器吸毛油的氯仿溶液50mg -150mg 注射进萃取柱。用215ml 氯仿洗脱出绝大部分的中性油, 再用含有015%氨水(25%) 的甲醇7ml 洗脱出其中的磷脂部分, 洗脱液用氮气吹干, 用100μl 流动相溶解, 直接用HP LC 分析, 在206nm 下检测含量。
由于磷脂种类的繁多, 其脂肪酸组成也有很大差异, 磷脂必然在UV 的吸收较为复杂, 这给一些磷脂的定量造成了困难。一些学者试图用其他检测器来得到更好的分析结果。J. S. Rhee 等[18]用折光指数(RI ) 检测器替代惯用的紫外检测器分析大豆磷脂中的卵磷脂成分, 他用氯仿-甲醇-醋酸-水(14∶14∶1∶1,v/v/v/v ) 做流动相。Merlin D. G rieser 等[19]用梯度洗脱和火焰电离检测器测定了大豆和玉米磷脂的各组分含量, 得到的图谱基线平稳, 可以很好地检测PC 、PE 、PI 甚至脂肪酸和甘油三酯的含量。S. Shi 2Hua Chen 等[20]用荧光检测器在342nm (激发) 和500nm (发射) 波长下检测磷脂含量, 磷脂先要和Dns 2C1进行反应, 得到的衍生物用HP LC 分离检测, 流动相为A 二氯甲烷-甲醇-15m ol/l 氨水(91∶9∶1,v/v/v ) 、B 二氯甲烷
-甲醇-15m ol/l 氨水(70∶20∶5,v/v/v ) , 梯度洗脱。
在分析和检测磷脂各部分组成时, 用单一的流动相不能把所有的磷脂分离得很好, 较为合理的解决方案是用流动相梯度洗脱。但是当用UV 检测器时, 由于流动相的变化其基线势必漂移, 这就影响了分析结果的准确性。折光指数检测器同样不能用于有梯度洗脱的HP LC 分析。一种新的检测器就应运
豆磷脂中磷脂酰胆碱的含量, 采用Lichros orb Si -60硅胶色谱柱, 以正己烷-异丙醇-磷酸-水(45∶48∶0115∶715,v/v/v/v ) 为流动相。样品用正己烷-异丙醇(1∶1,v/v ) 溶解, 在紫外检测器206nm 下检测。他用磷酸代替了醋酸盐缓冲液, 得到的基线很稳定。何新霞等[14]用HP LC 分析大豆磷脂中的卵磷脂含量时, 用乙腈-甲醇-水(65∶21∶14,v/v/v ) 做流动
66中 国 油 脂 2002年第27卷第4期
而生了, 这就是(蒸发) 光散射检测器(ES LD ) 。它是
把流动相喷入有热气流的检测器中, 流动相蒸发而不挥发性的脂质形成微小液滴。这些液滴散射照向光电倍增器的光, 引起电流的变化, 根据脂质的量不同电流的大小也不同, 从而达到检测的目的。从发展的眼光来看, 光散射检测器大有取代传统的UV 检测器的态势。Paul Van Der Meeren 等[21]较早使用这种检测器分析大豆磷脂, 他用正己烷-异丙醇-水从5718∶39∶312到5216∶42∶514(v/v/v ) 梯度洗脱大豆磷脂, 可以很好地分析N L (中性脂质) 、PE 、PI 、PA 和PC 。T ong Wang 等[22]用(蒸发) 分析了23种大豆磷脂的含量, 酸组成。-(153175,v/v/v/v ) , 化, 这些变化可能会影响大豆磷脂的物理特性, 也将改变其在生物膜中的生理功能。T. L M ounts 等[23]用HP LC 和ES LD 分析了储存不同时间大豆制得的大豆油中磷脂的组成, 以及这些磷脂的脂肪酸的变化。高水分含量(14%) 大豆储存10天磷脂将被破坏40%。
有时我们要分析不同食品中磷脂含量, 对于一个复杂的食品体系而言, 分析其中的磷脂含量是一个相对难度较大的工作。M. N. Vaghela 等[24]用HP LC 和(蒸发) 光散射检测器分析了浓缩乳清蛋白中的磷脂含量及组成。先加2倍质量的水于乳清浓缩蛋白中, 磁力搅拌15min , 再加入10倍质量的氯仿-甲醇(1∶1,v/v ) 在6000r/min 下均质1min , 在2800r/min 下离心5min 。得到的上清液留用, 再用相同体积的氯仿-甲醇((2∶1,v/v ) 溶液二次萃取乳清浓缩蛋白, 得到的上清液和第一次的上清液合并, 蒸发脱除溶剂得到粗脂质, 用凝胶过滤除去粗脂质中的非脂部分。得到的脂质用固相萃取(SPE ) 分离脂质中的中性脂质得到磷脂, 磷脂用HP LC 和(蒸发) 光散射检测器(E LS D ) 分析组成。流动相用A 氯仿-甲醇(8∶2,v/v ) 和B 氯仿-甲醇-水-20%的氨水(60∶34∶6∶0125,v/v/v/v ) 梯度洗脱。Maria Fiorenza Caboni 等[25]用不同的SPE 柱分析了鸡蛋、鸡肉、熟
-30%氨水(80∶1915∶015,v/v/v ) 和B 氯仿-甲醇-水-30%氨水(60∶34∶515∶015,v/v/v/v ) 梯度洗脱。
在用HP LC 分析磷脂时再配备质谱仪可以分析大豆磷脂的分子量分布, 以及各种磷脂的分子种类。J. A. Singleton 等[26]用HP LC 和快速原子轰击质谱仪(FAB MS ) 分析了花生磷脂的分子种类。花生中的
脂质用氯仿-甲醇萃取后, 用硅胶柱在HP LC 上分离中性脂质, 得到磷脂。磷脂再用HP LC 硅胶柱梯
。得到的各C 8, 用和PI 有六种分子。Jos F. H. M. Brouwers 等[27]用HP LC 和E LS D 分析了无病猪的
心、肝、皮等部位的PC 的分子种类。213 其他分析方法
核磁共振(NMR ) 技术用于磷脂的分析是20世纪90年代才发展成熟的新技术, 它利用磷原子的
31
P 的核磁共振效应来分析各种磷脂的组成和含量。
Thomas G lonek [28]用核磁共振分析了乙醇分提富集PC 的磷脂的各组分含量, 磷脂用甲醇-氯仿溶解,
再用E DT A 溶液沉淀其中的高价的金属离子, 消除其对31P NMR 的干扰,
核磁共振在20214MH z 下对磷脂进行分析。不同类型的磷脂由于化学环境不同, 31P 的化学位移也不同, 由此来确定各种不同磷脂的种类。各种磷脂的含量由核磁响应信号的积分确定。施邑屏等[29]用31P 核磁共振分析了针剂大豆卵磷脂的组分含量, 他用90MH z 的核磁共振光谱分析, 用85%的磷酸和氘代氯仿做参比。
红外光谱一般用于分子结构鉴定。常用的红外波数范围是400cm -1-4000cm -1, 但也有学者用它来确定一些成分的含量。J. M. Nzai 等[30]用傅立叶转换红外光谱(FTIR ) 分析了大豆中磷脂的组成, 他先用标准磷脂混合样品(含39%PC 、22%PI 、27%PE ) 溶解在氯仿中, 配成各种浓度的标准溶液用于确定磷脂的各种化学键振动的波数, 并绘制标准曲线。再用标准曲线确定大豆磷脂的含量。Vladimir A. Ery omin 等[31]利用染料Victoria 蓝R 、B 和磷脂(除了PC 、溶血磷脂和神经酰鞘磷脂) 显色的原理测定了磷脂的含量。
参 考 文 献
[1] AOCS O ffical Method Ja4-461[2] AOCS O fficial Method Ja5-551
[3] 廖学辉1络合光度法测定卵磷脂的总磷量[J]1广东药
干酪、意大利腊肠中磷脂的组成, 他用Floch 方法得
到鸡蛋中的全部脂质, 再用硅胶、氨丙基、C 18、C 8四种SPE 除去中性脂质, 富集磷脂, 得到的磷脂含量和推荐的M orris on 方法进行比较, 发现C 8柱的回收率达9713%, 而其他柱的回收率较低。得到的磷脂用HP LC 和E LS D 进行检测, 用流动相A 氯仿-甲醇
学,1999,9(4) :22-23.
2002年第27卷第4期 中 国 油
脂[4] AOCS O fficial Method Ja7-861[5] William W Christie. Lipid Analysis[M]1New Y ork :Pergamon
Press ,19821[6] 马 辰, 段宏瑾1大豆磷脂中磷脂类成分的含量测定
[J]1中国中药杂志,1999,24(11) :671-6721[7] 徐桂云, 常理文1大豆磷脂组成的薄层色谱分析[J]1
分析化学,1998,26(1) :81-841
[8] G. Lendrath . Behavior of Vegetable Phospholipids in Thin 2
Layer Chromatography :Optimization of M obile Phase , Detec tion and Direct Evaluation [J ]1Journal of Chromatography , 1990,502:3851[9] J. M. Nzai ,A. Proctor. Phospholipids Determination in Veg 2
etable Oil by Thin -Layer Chromatography and Imaging Den 2sitometry[J]1F ood Chemistry ,1998,63(4) 5761[10] R. Przybylskl ;N. Canola the easured by T Detector [J ]1JAOCS , 1991,68(4) -2451[11] 王兴国, 裘爱泳1棒薄层色谱氢火焰定量测定磷脂组
成[J]1无锡轻工大学学报,1995,14(1) :31-371[12] AOCS O fficial Method Ja7b -911[13] 董晓渭, 冯学伟1高效液相色谱测定大豆磷脂中的磷
脂酰胆碱[J]1华东理工大学学报,2000,26(3) :315-3171[14] 何新霞, 郑孝华1HP LC 法测定大豆磷脂中卵磷脂含量
[J]1食品科学,2000,21(2) :57-591[15] 杨 玲, 何新霞1HP LC 分析大豆脂胶囊的磷脂成分
[J]1食品科学,2000,21(2) :53-541
[16] T. L. M ounts. HP LC Analysis of Phospholipids in Crude Oil
for Evaluation of S oybean Deterioration[J]1JAOCS ,1990,67(11) :757-7601[17] Amalia A. Careli ,Marta I. V. Brevedan , et al. Quantitative
Determination of Phospholipids in Sun flower Oil [J]1JAOCS ,1997,74(5) :511-5141[18] J . S. Rhee ,M. G. Shin. Analysisof Phosphatidylcholine in
S oy Lecithins by HP LC[J]1JAOCS ,1982,59(2) :98-991[19] Merlin D. G rieser ,Jereme N. G reske. Higy Performance Liq 2
uid Chromatogralphy of Phospholipids with Flame I onization Detection[J]1JAOCS ,1989,66(10) :1484-14871[20] S. Shi 2Hua Chen , Anne Y. K ou , et al . Measurement of
E thanolamine 2and Serine 2C ontaining Phospholipids by High 2Performance Liquid Chromatography with Fluorescence
67
Detection of Their Dns Derivatives [J ]1Journal of Chrom 2atography ,1981,208:339-3461[21] Paul Van Der Meeren ,Jan Vanderdeelen , et al . S imple and
Rapid Method for High 2Performance Liquid Chromatographic Separation and Quantification of S oybean Phospholipids [J]1Journal of Chromatography ,1988,447:436-4421[22] T ong Wang , Earl G. Hamm ond . Fractionation of S oybean
Phospholipids by High 2Performance Liquid Chromatography with Evaporative Light 2Scattering Detector [J ]1JAOCS , 1999,76(11) :1313-13211[23] T. L. M ounts ,S. L. Abldl. HP LC of Phospholipids by
Detection [J]1JAOCS , ) -] ilara. Analysis of Phospho 2
Whey Protein C oncentrates by High 2Performance Liquid Chromatography With a Narrow 2Bore C olumn and an Evaporative Light 2Scattering Detector [J]1JAOCS ,1995,72(6) :729-7331
[25] Maria Fiorenza Caboni , Ciovanni Lercker . Separation and
Analysis of Phospholipids in Different F oods With a Light 2ScatteringDetector [J ]1JAOCS , 1996, 73(11) :1561-15661[26] J. A. S ingleton ,M. Ruan. Separation and Characterization of
Peanut Phospholipid M olecular S pecies Using High 2Perfor 2mance Liquid Chromatography and Fast Atom Bombardment Mass S pectrometry[J]1JAOCS ,1999,76(1) :49-551[27] Jos F. H. M. Brouwers , BarendM. G adella. Quantitative
Analysis of Phosphatidycholine M olecular S pecies Using HP LC and Light Scattering Detection [J ]1Journal of Lipid Research ,1998,39:344-3531[28] Thomas G lonek. 31P Nuclear Magnetic Res onance Phospho 2
lipid Analysis of Anionic 2Enriched Lecithin [J ]1JAOCS , 1998,75(5) :569-5731[29] 施邑屏, 黎燕斌131P 核磁共振光谱及薄层色谱分析针
剂大豆卵磷脂[J]1分析化学,1991,19(7) :733-7361[30] J. M. Nzai ,A. Proctor. S oy Lecithin Phospholipid Determina 2
tion by F ourier T rans form In frared S pectroscopy and the Acid Digest/Arseno 2M olybdate Method :A C omparative S tudy [J]1JAOCS ,1999,76(1) :61-661[31] Vladimir A. Ery omin ,Sergei P. P oznyakov. Quatitative Deter 2
mination of Phospholipids Using the Dyes Victoria Blue R and B[J]1Analytical Biochemistry ,1989,180:186-1911
Methods for Determination and Analysis of Phospholipids C omposition and C ontent
WANG Y ong ,WANG X ing 2guo ,HU Xue 2yan
(School of F ood Science and T echnology ,S outhern Y angtze University ,214036JiangsuWuxi ,P. R. C )
Abstract :The quantitative analysis method of phospholipids was reviewed ,especially the T LC and HP LC was intro 2
duced to determinate the com position and concentration of phospholopids. In addition ,s ome kinds of detectors of HP LC were stated. Furtherm ore ,nuclear magnetic res onance and F ourier trans form in frared technique was als o mentioned.
K ey w ords :phospholipids ;analysis ;T LC ;HP LC