一．RNA 反转录cDNA
试剂盒：Takara PrimeScript RT reagent Kit 操作步骤：
提前调水浴锅至42℃；
按下列组份配制 RT 反应液(反应液配制请在冰上进行) 。
5×PrimeScript Buffer(for Real Time) PrimeScript RT Enzyme Mix I Oligo dT Primer(50 μM) Random 6 mers(100 μM) Total RNA
2 μl 0.5 μl 0.5 μl 0.5 μl 360ng up to 10 μl
RNase Free dH2O total
10μl
轻柔吹打均匀； 室温放置10min ； 42℃水浴锅中放置1h ；
冰中冷却2min ；
上述反应可根据条件在PCR 仪中进行。
当需要使用的基因编码的RNA 二级结构较为复杂时, 反转录前, 将 RNA 溶液于 65°C加热 5 分钟后迅速置于冰中, 利用这种办法可以减弱二级结构的影响, 提高逆转录反应效率。
二．目的基因扩增引物设计原则：
a) 特异性：在cDNA 中能且只能扩增出目的序列，不会扩增出其他序列；（通过blast
检验）
b) 在引物5’端添加酶切位点及3个保护碱基； c) 酶切位点使用所选载体中有的位点，尽量避免使用载体中相邻的位点，尽量避免使
用平末端位点；所选位点在扩增目的片段中不能出现，可以使用primer premier对序列中的酶切位点进行分析。
三．PCR 反应：
4k 以下的片段使用KOD Plus DNA 聚合酶，4k 以上选择KOD FX DNA聚合酶，按说明书操作；
四．PCR 产物回收：
配制1%琼脂糖凝胶：称取一克琼脂糖，加入100ml TAE 溶液中，煮沸至凝胶完全溶解。待温度降至60°C左右时(刚好不烫手) 加入8μl Goodview，摇匀，将凝胶溶液倒入槽内，冷凝后备用。
将反转录样品与Loading Buffer混匀，加入凝胶孔内，最右端加Marker ，固定电压120V ，跑半小时左右。此时调水浴锅60°C .
胶回收：
参考意见：500bp 以下的片段使用2%琼脂糖凝胶；500bp 以上使用1%琼脂糖凝胶。标
准并不绝对，可以根据个人经验进行调整。
在紫外灯下切下相应大小的DNA 片段，加入EP 管内，按照0.1g 凝胶加入100μl 的比例加入buffer xp ，放入60°C 水浴锅中至胶完全融化。这段时间组装收集管与吸附柱，并在吸附柱上做好标记。
紫外照射时间不宜过长，避免DNA 形成TT 二聚体。
用大枪将EP 管内溶液吹匀，吸入吸附柱中，12000rpm 离心1min ；
倒掉收集管中废液，向吸附柱中加入300μl buffer XP ，最高速（12000rpm ）离心1min ；
倒掉收集管中废液，向吸附柱中加入700μl wash buffer，最高速（12000rpm ）离心1min ； 重复上一步骤。
最高速（＞12000rpm ）空转2min ；
取出吸附柱，放入新离心管中，70℃加热2min ，待乙醇挥发；
向吸附柱中加入50μl 超纯水，70℃加热2min ，12000rpm 离心1min ，离心管内液体即所需回收的DNA 溶液。
试剂盒使用OMEGA 的胶回收试剂盒； 四．PCR 产物与载体的酶切 使用takara quick cut限制酶，酶切体系及条件见相应酶的说明书。 Buffer 5μl Buffer 5μl 酶1 1μl 酶1 1μl 酶2 1μl 酶2 1μl 载体 1μg 外源片段 1μg 水 补至50μl 水 补至50μl 五．连接： 体系中外源片段与载体的分子数比例控制在1:1~1：10之间。对于长约5K 的载体，一般加入100ng ，对于长度为nKb 的外源片段，加入（20n~200n）ng 。体系中其余成分参考相应酶的说明书。 六．转化：
超净台内放入小枪，小枪头，大枪，大枪头，1.5mlEP 管，固体LB 培养基，无抗性的液体LB 培养基，紫外照射超净台30min ，同时调水浴锅至42℃，同时制冰。以下操作如无特别说明，建议均在冰上进行；
从-80℃冰箱内取出感受态细菌，室温融化（可以在手中捂化，不推荐），融化后立即将感受态分装至EP 管中，每管约30-50μl ，置于冰上；
吸取5-10μl 转化体系，放入感受态中吹打数次，做好标记； 将EP 管置于冰上30min ；
将EP 管置于42℃水浴锅中加热60s （45s-90s 之间，自由发挥），期间尽量不要扰动EP 管；
取出EP 管，置于冰上2min ；
向EP 管中加入400~800μl 无抗性LB 液态培养基，摇床内100rpm ，37℃摇45min ； 将EP 管内培养基倒到固体LB 培养基上，晃动培养基，使菌液在平皿表面分布均匀；
也可采用涂布法和划线法。三种方法各有优势，但以第一种方法最简便； 固体培养基有抗性，抗性的选择根据质粒情况而定； 培养箱内37℃倒置培养过夜；
12-16h 后，即可看到固体培养基表面长出单个菌落。
一．RNA 反转录cDNA
试剂盒：Takara PrimeScript RT reagent Kit 操作步骤：
提前调水浴锅至42℃；
按下列组份配制 RT 反应液(反应液配制请在冰上进行) 。
5×PrimeScript Buffer(for Real Time) PrimeScript RT Enzyme Mix I Oligo dT Primer(50 μM) Random 6 mers(100 μM) Total RNA
2 μl 0.5 μl 0.5 μl 0.5 μl 360ng up to 10 μl
RNase Free dH2O total
10μl
轻柔吹打均匀； 室温放置10min ； 42℃水浴锅中放置1h ；
冰中冷却2min ；
上述反应可根据条件在PCR 仪中进行。
当需要使用的基因编码的RNA 二级结构较为复杂时, 反转录前, 将 RNA 溶液于 65°C加热 5 分钟后迅速置于冰中, 利用这种办法可以减弱二级结构的影响, 提高逆转录反应效率。
二．目的基因扩增引物设计原则：
a) 特异性：在cDNA 中能且只能扩增出目的序列，不会扩增出其他序列；（通过blast
检验）
b) 在引物5’端添加酶切位点及3个保护碱基； c) 酶切位点使用所选载体中有的位点，尽量避免使用载体中相邻的位点，尽量避免使
用平末端位点；所选位点在扩增目的片段中不能出现，可以使用primer premier对序列中的酶切位点进行分析。
三．PCR 反应：
4k 以下的片段使用KOD Plus DNA 聚合酶，4k 以上选择KOD FX DNA聚合酶，按说明书操作；
四．PCR 产物回收：
配制1%琼脂糖凝胶：称取一克琼脂糖，加入100ml TAE 溶液中，煮沸至凝胶完全溶解。待温度降至60°C左右时(刚好不烫手) 加入8μl Goodview，摇匀，将凝胶溶液倒入槽内，冷凝后备用。
将反转录样品与Loading Buffer混匀，加入凝胶孔内，最右端加Marker ，固定电压120V ，跑半小时左右。此时调水浴锅60°C .
胶回收：
参考意见：500bp 以下的片段使用2%琼脂糖凝胶；500bp 以上使用1%琼脂糖凝胶。标
准并不绝对，可以根据个人经验进行调整。
在紫外灯下切下相应大小的DNA 片段，加入EP 管内，按照0.1g 凝胶加入100μl 的比例加入buffer xp ，放入60°C 水浴锅中至胶完全融化。这段时间组装收集管与吸附柱，并在吸附柱上做好标记。
紫外照射时间不宜过长，避免DNA 形成TT 二聚体。
用大枪将EP 管内溶液吹匀，吸入吸附柱中，12000rpm 离心1min ；
倒掉收集管中废液，向吸附柱中加入300μl buffer XP ，最高速（12000rpm ）离心1min ；
倒掉收集管中废液，向吸附柱中加入700μl wash buffer，最高速（12000rpm ）离心1min ； 重复上一步骤。
最高速（＞12000rpm ）空转2min ；
取出吸附柱，放入新离心管中，70℃加热2min ，待乙醇挥发；
向吸附柱中加入50μl 超纯水，70℃加热2min ，12000rpm 离心1min ，离心管内液体即所需回收的DNA 溶液。
试剂盒使用OMEGA 的胶回收试剂盒； 四．PCR 产物与载体的酶切 使用takara quick cut限制酶，酶切体系及条件见相应酶的说明书。 Buffer 5μl Buffer 5μl 酶1 1μl 酶1 1μl 酶2 1μl 酶2 1μl 载体 1μg 外源片段 1μg 水 补至50μl 水 补至50μl 五．连接： 体系中外源片段与载体的分子数比例控制在1:1~1：10之间。对于长约5K 的载体，一般加入100ng ，对于长度为nKb 的外源片段，加入（20n~200n）ng 。体系中其余成分参考相应酶的说明书。 六．转化：
超净台内放入小枪，小枪头，大枪，大枪头，1.5mlEP 管，固体LB 培养基，无抗性的液体LB 培养基，紫外照射超净台30min ，同时调水浴锅至42℃，同时制冰。以下操作如无特别说明，建议均在冰上进行；
从-80℃冰箱内取出感受态细菌，室温融化（可以在手中捂化，不推荐），融化后立即将感受态分装至EP 管中，每管约30-50μl ，置于冰上；
吸取5-10μl 转化体系，放入感受态中吹打数次，做好标记； 将EP 管置于冰上30min ；
将EP 管置于42℃水浴锅中加热60s （45s-90s 之间，自由发挥），期间尽量不要扰动EP 管；
取出EP 管，置于冰上2min ；
向EP 管中加入400~800μl 无抗性LB 液态培养基，摇床内100rpm ，37℃摇45min ； 将EP 管内培养基倒到固体LB 培养基上，晃动培养基，使菌液在平皿表面分布均匀；
也可采用涂布法和划线法。三种方法各有优势，但以第一种方法最简便； 固体培养基有抗性，抗性的选择根据质粒情况而定； 培养箱内37℃倒置培养过夜；
12-16h 后，即可看到固体培养基表面长出单个菌落。