鸭胚成纤维细胞培养、鸭胚成纤维细胞培养、传代∗
及保存方法的研究
许
2
静1，，李进军1∗∗，熊胜1，陈黎1，杨
倩2，卢立志1
（1. 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州310021；
2. 南京农业大学动物医学院，江苏南京210095）
Culture ，Subculture and Cryopreservation of Embryo Fibroblast of Duck ∗
2
XU Jing 1，，LI Jinjun 1∗∗，XIONG Sheng 1，CHEN Li 1，YANG Qian 2，LU Lizhi 1
2.College of Veterinary Medicine ，Nanjing Agricultural University ，Nanjing ，Jiangsu 210095）
was established which would lay the foundation for culture of embryo or germ stem cells. The duck embryonal tissue was digested with trypsin-EDTA to obtain primary cells and passage cells ，which were cultured with 10%FBS+DEME.cells. The methods could be used for isolation and pure culture of duck embryo fibroblast in vitro ，and could be subcultured to the third generation. The results indicated that the cell viability in F 1and F 2came up to 90%，but no different cryoprotectants. DMSO was the most effective reagent for cryopreservation of duck embryo fibroblast.
Key words ：duck embryo fibroblast ；culture in vitro ；cryopreservation ；cell viability
Use the DMSO ，glycerin ，ethylene glycol as cryoprotectants to freeze F 1cells ，and observe the cell viability of anabiotic significant difference was observed. The cell viability of all anabiotic cells decreased （
Abstract ：Effective methods for isolation ，culture ，subculture and cryopreservation of duck embryo fibroblast in vitro
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences ，Hangzhou ，Zhejiang 310021；
（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine ，
收稿日期：2012-01-04
修回日期：2012-02-20∗基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（NY ⁃CYTX-45-02）；浙江省农科院科技创新能力提升工程
∗∗通讯作者，E-mail ：[email protected]
我国是养鸭大国，饲养量居世界第一位。联合国粮食及农业组织（FAO ）最新统计数据显示，当前我国鸭存栏量超过7.25亿只，占世界总存栏量的72%左右，可见养鸭业在我国国民经济中占有重要的地位。同时，我国也是世界鸭种资源最为丰富的国家，一些地方品种拥有如体型小、产蛋多、耗料省、成熟早、适应性强等优点［1］。若能利用转基因技术将各品种种质优势拓展到其它鸭种中，必将大大加快鸭的育种进程。近年来利用动物胚胎或生殖干细胞培育转基因动物已成为国内外动物转基因研究工作的热点。研究表明，实现动物胚胎或生殖干细胞离体培养的关键是在保证细胞具备无限增殖能力的同时维持其未分化状态，而且采用同一物种来源的饲养层细胞来培养胚胎或生
3］
殖干细胞，是实现这一目标最有效的方法之一［2，。
头、四肢及内脏；将取得的胚体放入小烧杯中，用PBS 清洗3次，后转入另一带纱布的小烧杯中；用大剪刀剪碎胚体，再用PBS 清洗3次，去上层混液，洗去血污；加入胰酶，先润洗胚体一次以达到胰酶的浓度，再加入胚体体积的4~5倍量（6~7mL ）置入三角锥形瓶中，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养箱中消化10min ，待液体浑浊后收集上层细胞悬液置离心管中，冰浴；再次加入胰酶，37℃、5%CO2培养箱二次消化8min 取上层细胞液于离心管中；离心1000~1500r/min，3~5min 将细胞离心至管底，去上清；收集的细胞用PBS 清洗离心去上层液3次；加入含有10%胎牛血清的DMEM 生长培养基，吹打细胞，8层纱布过滤；细胞计数，加入DMEM 稀释细胞浓度为3×105~5×105个/mL为宜；将稀释好的细胞液加入到干净的培养瓶中进行培养，37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，及时观察细胞贴壁情况。细胞贴壁后大概6h 后进行换液，去除死细胞，细胞进入增殖期后可用维持液（含4%血清的DMEM 培养基）进行换液，进入静止期前需要传代；观察细胞生长情况，及时记录观察情况。1.2.2细胞传代
原代培养的细胞80%~90%铺满培养瓶底部时，即可进行传代；吸出原培养液，然后用PBS 清洗细胞1~2次，尽量除去残余的血清；加入适量的0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化液进行消化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度；加入适量的含血清的培养液，用移液管反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；收集细胞悬液，移入离心管中，1500r/min离心5min ，去上清，收集细胞沉淀；加入5mL 左右培养基进行吹打，吸取20~50μL 细胞液加入台盼蓝染色，在计数板上进行细胞计数；用含10%小牛血清的DMEM 培养液重新悬浮细胞并计算细胞密度，以3×105个/mL接种到培养瓶中，在37.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下的培养箱中培养。待细胞贴合度达到80%~90%时用同样的方法继续传代。1.2.3细胞冷冻
培养的细胞生长到对数生长期时即可进行
如有研究表明，由于鸡成纤维细胞与鸡胚胎干细胞具有同源性，因此鸡成纤维细胞可作为后者建系首选的饲养层细胞［4］。由此推理，建立成熟的鸭胚成纤维细胞培养体系将有助于高效培养鸭胚胎或生殖干细胞。现有文献［5］报道原代及继代鸭胚成纤维细胞制备的方法，但关于建立鸭胚成纤维细胞的原代培养、继代培养以及冷冻复苏体系的研究报道却比较少。鉴于此，本试验拟建立鸭胚成纤维细胞的体外培养和冷冻保存体系，旨在为后续鸭胚胎或生殖干细胞的体外培养奠定基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物
10~12日龄绍兴鸭鸭胚。1.1.2主要试剂
无支原体胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；青、链霉素混合液购自凯基生物有限公司；D-PBS （1×）、0.25%Trypsin &0.02%EDTA 、DMEM 高糖培养液（1×）均购自吉诺生物医药技术有限公司；DMSO 购自美国Sigma 公司；甘油购自上海德恒生物技术有限公司；乙二醇购自无锡市晶科化工有限公司。1.2试验方法
1.2.1原代鸭胚成纤维细胞制备
取10~12日龄鸭胚，照蛋挑选活胚，用碘酒、酒精消毒蛋壳；去壳取鸭胚，放入无菌平皿中，去
细胞冷冻；吸出原培养液，然后用PBS 清洗细胞1~2次，尽量除去残余的血清；加入适量的0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA ）消化液进行消化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度；加入适量的含血清的培养液，用吸管反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；收集细胞悬液，移入离心管中，1500r/min离心5min ，去上清，收集细胞沉淀；分别用3种不同的冷冻液（10%DMSO/甘油/乙二醇+20%血清+70%DMEM ）重悬细胞，反复吹打，吹打成单个细胞，保持细胞密度为1×106~2×106个/mL装入冷冻管中；4℃保存2h ，冰水中保存30min ，-20℃保存1h ，-30℃保存1h ，-70℃过夜，第2天放入液氮保存。1.2.4细胞复苏
液氮中冻存7d 后，取出冷冻管，立即投入37℃水浴中，并迅速在水浴中晃动，约2/3融解时即可从水浴中取出，并继续晃动使其完全融解；细胞融解后，用含10%血清的DMEM 培养液将细胞稀释至原体积的4倍，这个过程完成要迅速，控制在5min 之内；低速离心：300r/min离心5min ；500r/min离心3min 。去上清，加培养液；用0.5%的台盼蓝染色液于倒置显微镜下观察计数。透亮而不着色的为活细胞，染成蓝色的为死细胞；稀释细胞至3×105~5×105个/mL加入培养瓶中进行培养。
1.2.5细胞活力检测
每两天传代一次，每次传代3个25cm 2细胞瓶；用台盼蓝试剂染色观察活细胞和死细胞数量，计算细胞活率。1.3统计分析方法
运用SPSS 16.0软件进行数据处理和差异显著性（P
鸭胚原代成纤维细胞培养的生长情况和形采用酶消化法获得原代细胞，接种置25cm 2
培养瓶，1~2h 后90%以上细胞已经贴壁，且贴壁牢靠，12h 后活的成纤维细胞均能正常贴壁并进行伸展，部分没有触及细胞瓶底部的细胞24h 后态特征
死亡，游离于培养液上，呈球形颗粒状。在倒置显微镜下观察发现细胞呈长梭形向两侧伸展，有两个触角，细胞透亮有立体感，但杂细胞比较多（见图1A 、1B ）。一般混有上皮细胞，呈不规则状生长，有多个触角，需进行纯化。由于成纤维细胞在消化时首先脱落，传代后贴壁速度快，而上皮细胞由于在短时间内不能贴壁或者附着不稳，轻微振动即脱落，由此可以达到传代纯化的目的。原代细胞的活力为82.90%，在24h 之内细胞活性较好，可进行传代。
2.2传代细胞培养的生长情况和形态特征
用0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化贴壁细胞，将细胞瓶放置于显微镜下观察，发现细胞逐渐变圆回缩，表明细胞开始从瓶壁脱落。接种培养，刚接种的，为小圆球形，呈悬浮状态。1h 后即可贴壁，细胞伸展，形状由圆形变成长梭形，向四周伸展。12h 后，贴壁的细胞不断生长，成纤维细胞排列成单层，细胞生长形状变得不规则，相互之间排列较紧密，铺满培养瓶底部
（见图1C 、1D
），此时就可传代，
此后每隔2~3d 就可传代1次。
A B C
D E F
G H I
A. 原代鸭胚成纤维细胞24h 培养（100×）；B. 原代鸭胚成纤维细胞
48h 培养（100×）；C.F 1代鸭胚成纤维细胞24h 培养（100×）；D.F 2代鸭胚成纤维细胞24h 培养（100×）；E. 衰老的鸭胚成纤维细胞（100×）；F. 衰老的鸭胚成纤维细胞（200×）；G. 复苏后的鸭胚成纤维细胞（DMSO 作为冷冻保护剂）（100×）；H. 复苏后的鸭胚成纤维细胞（甘油作为冷冻保护剂）（100×）；I. 复苏后的鸭胚成纤维细胞（乙二醇作为冷冻保护剂）（100×）。
图1鸭胚原代成纤维细胞生长情况
将每次传代的细胞进行细胞活力测算，结果表明，原代的鸭胚成纤维细胞与第一代和第二代细胞活力差异显著（P 0.05）。由于原代细胞中混有一些杂细胞而影响了细胞的活力，第二代和第三代细胞活力差异不显著，而且活力都达到了90%以上，结合细胞显微图片可知第二代和第三代细胞生长较好，胞质均匀而透亮，透明度大，折光性好，可用于鸭胚胎或生殖干细胞的共培养。第三代细胞虽然能正常传代，但是老化的速度比较快，经过48h 后细胞质就产生了空泡（见图1E 、1F ），经过3d 后细胞的纤维化程度已经很大，不能用于实验。
2.3复苏细胞培养的生长情况和形态特征
用第一代细胞进行冷冻保存，在液氮中存放一周后对其进行复苏。先进行细胞活力测定再稀释后进行培养，24h 培养后镜检发现用DMSO 冷冻保存的细胞活力最强，生长密度保持较好，且生长饱满通透，细胞轮廓清晰可见，死细胞较少，此时大部分细胞都已贴壁生长，细胞贴壁率可达85%，且细胞更纯；而用甘油和乙二醇冷冻复苏的细胞则生长状态不佳，密度较稀，贴壁率仅为30%，24h 后便有大量死细胞产生，48h 后部分细胞崩解、死亡。用甘油做冷冻液冷冻复苏的细胞还有一个奇怪的现象：贴壁的细胞上黏附了很多的细胞颗粒，并形成长串，一段黏附在贴壁细胞上，另一段浮游于培养基中（图1G 、1H 、1I ）。
结果表明，3种冷冻剂保存的细胞复苏后均与第一代细胞的活力相比存在明显差异（P
3.1胰酶和EDTA 的消化作用
动物细胞常用的培养方法有2种：组织块贴壁培养法和酶消化分离单细胞接种培养法。胰蛋白酶可以特异性地水解精氨酸与赖氨酸羧基所形成的肽键，导致细胞间质水解而使细胞块
离散成单个细胞，EDTA 是一种钙离子螯合剂，与胰蛋白酶结合使用可增强胰蛋白酶的消化效
7］
果［6，。在细胞传代培养中，0.25%胰蛋白酶作用
时间的长短十分关键。酶作用时间过长时对细胞有损伤；而消化时间过短则难以打破细胞之间的粘连，致使有些细胞消化不下来［8］。本试验运用酶消化分离单细胞接种培养法培养鸭胚成纤维细胞，在分离原代细胞时通过二次消化获得细胞，每次消化10min ，一共不超过25min ，以免对细胞产生毒性。传代时由于细胞呈单层贴于细胞瓶底部，所以消化时间比较短，只需1~2min 即可。本试验形态学观察发现，上皮细胞和成纤维细胞同时出现在原代培养及早期传代培养中，混入的上皮细胞一定程度上侵占了成纤维细胞的生存空间。在消化培养细胞时，由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶耐受性不同，一般情况下成纤维细胞先脱壁，而且传代后贴壁快，附着快，多数能在10~30min 完成附着。但是大部分上皮细胞在短时间内不能附着或附着不稳定，稍振动即浮起，需要生长基质如胶原或其它细胞外基质成分等的支持，因此，用酶法和反复贴壁法处理3~4代后，成纤维细胞便能纯化［9~11］。因此，利用这个差别，经酶消化法和反复贴壁法处理1~2代后，能够相应地纯化成纤维细胞。
3.2血清浓度对细胞的影响
血清中含有促细胞贴壁的成份，有助于成纤维细胞贴壁生长［12］。一般说来，不同细胞对营养液中的血清浓度要求不同。就同一种细胞来说，不同血清浓度对细胞生长与维持的影响也不尽相同。本试验采用8%~10%FBS 的培养基培养细胞，生长速度快，一般12~16h 即可长成致密的单层细胞，当细胞已处于生长期时采用4%FBS进行维持培养。
细胞在生长时，最低血清浓度在5%、pH 值为6.8~7.2时，生长状态较佳；维持细胞时，血清浓度在2%~4%、pH 值在7.4~7.6时较好，添加L-谷氨酰胺后，细胞的贴壁性增强。这可能是由于L-谷氨酰胺为细胞生长提供碳源及生长因子的缘故。8%~10%FBS 在用于原代细胞和次代细胞的培养中，因其血清含量高，细胞生长速度较
快，但一旦长满后若不及时更换维持液，则细胞会很快老化。4%~6%FBS 同样可作为原代细胞和次代细胞的生长液，其虽不如8%~10%FBS 的生长速度快，但血清用量减少，利用率提高，细胞生长也比较均匀一致，且老化速度较慢［5］。本试验中也出现了这些现象，当血清浓度过高时，在48h 内就能发现细胞老化现象，而且随着细胞继代的次数增多，细胞老化的速度也越来越快，这就更加需要控制好血清的浓度，延缓细胞的衰老。
3.3冷冻保护剂的作用
细胞冷冻打破了细胞的正常生理过程，冷冻时会在细胞内部形成冰晶，破坏细胞的正常结构，从而对细胞造成一定的损伤，在冷冻过程中添加一定浓度的冷冻保护剂可以在一定程度上降低冷冻所造成的损伤。
本试验用3种不同的冷冻保护剂冷冻保存了同一批细胞，采用10%DMSO/甘油/乙二醇+20%FBS+70%DMEM 作为冷冻液，分装好的细胞先在4℃冰箱中平衡2h ，再移入-20℃或者-30℃冰箱平衡30min ，再在-70℃过夜，第2天投入液氮中保存。常温时冷冻剂对细胞的毒害作用较大。而在4℃时，毒害作用减弱，所以在细胞冻存时应尽量缩短冷冻剂与成纤维细胞在4℃以上的接触时间。降温和复温速度是影响细胞存活的关键因素。为保持细胞最大存活率，采用慢冻快融的方法，冻存液中加入保护剂后，可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，使细胞内水分在冻结前透出细胞外，从而减少细胞内冰晶的形成。细胞复苏时采用37℃水浴快速复温法，使之迅速通过细胞最易受损伤的-5~0℃。
［13］
的大力帮助。感谢卢立志研究员、杨倩教授、李进军博士、邓晓辉试验过程中给予的帮助，谨以致谢。
参考文献：
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本研究表明，采用10%的冷冻保护剂，可对成纤维细胞起到较好的冷冻保护效果，这与以往的
12］
一些研究结果基本一致［11，。DMSO 的冷冻保护
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效果最为明显，而甘油和乙二醇在低温下对细胞有一定的保护效果，但是效率很低，复苏后的细胞并不能用于实验。细胞冻存前后存活率的下降表明细胞在冷冻和复苏的过程中可能受到一些损伤，亦或冷冻保护剂对细胞产生了毒性作用。
致谢：
本试验得到浙江省农业科学院畜牧研究所
研究［D ］. 内蒙古：内蒙古农业大学，2006：23-24．13
王嘉博，刘娣，马红，等
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鸭胚成纤维细胞培养、鸭胚成纤维细胞培养、传代∗
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静1，，李进军1∗∗，熊胜1，陈黎1，杨
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（1. 浙江省农业科学院畜牧兽医研究所，浙江杭州310021；
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Key words ：duck embryo fibroblast ；culture in vitro ；cryopreservation ；cell viability
Use the DMSO ，glycerin ，ethylene glycol as cryoprotectants to freeze F 1cells ，and observe the cell viability of anabiotic significant difference was observed. The cell viability of all anabiotic cells decreased （
Abstract ：Effective methods for isolation ，culture ，subculture and cryopreservation of duck embryo fibroblast in vitro
Zhejiang Academy of Agricultural Sciences ，Hangzhou ，Zhejiang 310021；
（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine ，
收稿日期：2012-01-04
修回日期：2012-02-20∗基金项目：现代农业产业技术体系建设专项资金（NY ⁃CYTX-45-02）；浙江省农科院科技创新能力提升工程
∗∗通讯作者，E-mail ：[email protected]
我国是养鸭大国，饲养量居世界第一位。联合国粮食及农业组织（FAO ）最新统计数据显示，当前我国鸭存栏量超过7.25亿只，占世界总存栏量的72%左右，可见养鸭业在我国国民经济中占有重要的地位。同时，我国也是世界鸭种资源最为丰富的国家，一些地方品种拥有如体型小、产蛋多、耗料省、成熟早、适应性强等优点［1］。若能利用转基因技术将各品种种质优势拓展到其它鸭种中，必将大大加快鸭的育种进程。近年来利用动物胚胎或生殖干细胞培育转基因动物已成为国内外动物转基因研究工作的热点。研究表明，实现动物胚胎或生殖干细胞离体培养的关键是在保证细胞具备无限增殖能力的同时维持其未分化状态，而且采用同一物种来源的饲养层细胞来培养胚胎或生
3］
殖干细胞，是实现这一目标最有效的方法之一［2，。
头、四肢及内脏；将取得的胚体放入小烧杯中，用PBS 清洗3次，后转入另一带纱布的小烧杯中；用大剪刀剪碎胚体，再用PBS 清洗3次，去上层混液，洗去血污；加入胰酶，先润洗胚体一次以达到胰酶的浓度，再加入胚体体积的4~5倍量（6~7mL ）置入三角锥形瓶中，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养箱中消化10min ，待液体浑浊后收集上层细胞悬液置离心管中，冰浴；再次加入胰酶，37℃、5%CO2培养箱二次消化8min 取上层细胞液于离心管中；离心1000~1500r/min，3~5min 将细胞离心至管底，去上清；收集的细胞用PBS 清洗离心去上层液3次；加入含有10%胎牛血清的DMEM 生长培养基，吹打细胞，8层纱布过滤；细胞计数，加入DMEM 稀释细胞浓度为3×105~5×105个/mL为宜；将稀释好的细胞液加入到干净的培养瓶中进行培养，37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，及时观察细胞贴壁情况。细胞贴壁后大概6h 后进行换液，去除死细胞，细胞进入增殖期后可用维持液（含4%血清的DMEM 培养基）进行换液，进入静止期前需要传代；观察细胞生长情况，及时记录观察情况。1.2.2细胞传代
原代培养的细胞80%~90%铺满培养瓶底部时，即可进行传代；吸出原培养液，然后用PBS 清洗细胞1~2次，尽量除去残余的血清；加入适量的0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化液进行消化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度；加入适量的含血清的培养液，用移液管反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；收集细胞悬液，移入离心管中，1500r/min离心5min ，去上清，收集细胞沉淀；加入5mL 左右培养基进行吹打，吸取20~50μL 细胞液加入台盼蓝染色，在计数板上进行细胞计数；用含10%小牛血清的DMEM 培养液重新悬浮细胞并计算细胞密度，以3×105个/mL接种到培养瓶中，在37.5℃、5%CO2、饱和湿度条件下的培养箱中培养。待细胞贴合度达到80%~90%时用同样的方法继续传代。1.2.3细胞冷冻
培养的细胞生长到对数生长期时即可进行
如有研究表明，由于鸡成纤维细胞与鸡胚胎干细胞具有同源性，因此鸡成纤维细胞可作为后者建系首选的饲养层细胞［4］。由此推理，建立成熟的鸭胚成纤维细胞培养体系将有助于高效培养鸭胚胎或生殖干细胞。现有文献［5］报道原代及继代鸭胚成纤维细胞制备的方法，但关于建立鸭胚成纤维细胞的原代培养、继代培养以及冷冻复苏体系的研究报道却比较少。鉴于此，本试验拟建立鸭胚成纤维细胞的体外培养和冷冻保存体系，旨在为后续鸭胚胎或生殖干细胞的体外培养奠定基础。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物
10~12日龄绍兴鸭鸭胚。1.1.2主要试剂
无支原体胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司；青、链霉素混合液购自凯基生物有限公司；D-PBS （1×）、0.25%Trypsin &0.02%EDTA 、DMEM 高糖培养液（1×）均购自吉诺生物医药技术有限公司；DMSO 购自美国Sigma 公司；甘油购自上海德恒生物技术有限公司；乙二醇购自无锡市晶科化工有限公司。1.2试验方法
1.2.1原代鸭胚成纤维细胞制备
取10~12日龄鸭胚，照蛋挑选活胚，用碘酒、酒精消毒蛋壳；去壳取鸭胚，放入无菌平皿中，去
细胞冷冻；吸出原培养液，然后用PBS 清洗细胞1~2次，尽量除去残余的血清；加入适量的0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA ）消化液进行消化，消化程度可在倒置显微镜下观察，一般以细胞突起缩回、细胞间间隙增大、细胞近乎缩成圆形为度；加入适量的含血清的培养液，用吸管反复轻轻吹打培养瓶底部，使经消化的细胞脱离瓶底并分散为单个细胞；收集细胞悬液，移入离心管中，1500r/min离心5min ，去上清，收集细胞沉淀；分别用3种不同的冷冻液（10%DMSO/甘油/乙二醇+20%血清+70%DMEM ）重悬细胞，反复吹打，吹打成单个细胞，保持细胞密度为1×106~2×106个/mL装入冷冻管中；4℃保存2h ，冰水中保存30min ，-20℃保存1h ，-30℃保存1h ，-70℃过夜，第2天放入液氮保存。1.2.4细胞复苏
液氮中冻存7d 后，取出冷冻管，立即投入37℃水浴中，并迅速在水浴中晃动，约2/3融解时即可从水浴中取出，并继续晃动使其完全融解；细胞融解后，用含10%血清的DMEM 培养液将细胞稀释至原体积的4倍，这个过程完成要迅速，控制在5min 之内；低速离心：300r/min离心5min ；500r/min离心3min 。去上清，加培养液；用0.5%的台盼蓝染色液于倒置显微镜下观察计数。透亮而不着色的为活细胞，染成蓝色的为死细胞；稀释细胞至3×105~5×105个/mL加入培养瓶中进行培养。
1.2.5细胞活力检测
每两天传代一次，每次传代3个25cm 2细胞瓶；用台盼蓝试剂染色观察活细胞和死细胞数量，计算细胞活率。1.3统计分析方法
运用SPSS 16.0软件进行数据处理和差异显著性（P
鸭胚原代成纤维细胞培养的生长情况和形采用酶消化法获得原代细胞，接种置25cm 2
培养瓶，1~2h 后90%以上细胞已经贴壁，且贴壁牢靠，12h 后活的成纤维细胞均能正常贴壁并进行伸展，部分没有触及细胞瓶底部的细胞24h 后态特征
死亡，游离于培养液上，呈球形颗粒状。在倒置显微镜下观察发现细胞呈长梭形向两侧伸展，有两个触角，细胞透亮有立体感，但杂细胞比较多（见图1A 、1B ）。一般混有上皮细胞，呈不规则状生长，有多个触角，需进行纯化。由于成纤维细胞在消化时首先脱落，传代后贴壁速度快，而上皮细胞由于在短时间内不能贴壁或者附着不稳，轻微振动即脱落，由此可以达到传代纯化的目的。原代细胞的活力为82.90%，在24h 之内细胞活性较好，可进行传代。
2.2传代细胞培养的生长情况和形态特征
用0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化贴壁细胞，将细胞瓶放置于显微镜下观察，发现细胞逐渐变圆回缩，表明细胞开始从瓶壁脱落。接种培养，刚接种的，为小圆球形，呈悬浮状态。1h 后即可贴壁，细胞伸展，形状由圆形变成长梭形，向四周伸展。12h 后，贴壁的细胞不断生长，成纤维细胞排列成单层，细胞生长形状变得不规则，相互之间排列较紧密，铺满培养瓶底部
（见图1C 、1D
），此时就可传代，
此后每隔2~3d 就可传代1次。
A B C
D E F
G H I
A. 原代鸭胚成纤维细胞24h 培养（100×）；B. 原代鸭胚成纤维细胞
48h 培养（100×）；C.F 1代鸭胚成纤维细胞24h 培养（100×）；D.F 2代鸭胚成纤维细胞24h 培养（100×）；E. 衰老的鸭胚成纤维细胞（100×）；F. 衰老的鸭胚成纤维细胞（200×）；G. 复苏后的鸭胚成纤维细胞（DMSO 作为冷冻保护剂）（100×）；H. 复苏后的鸭胚成纤维细胞（甘油作为冷冻保护剂）（100×）；I. 复苏后的鸭胚成纤维细胞（乙二醇作为冷冻保护剂）（100×）。
图1鸭胚原代成纤维细胞生长情况
将每次传代的细胞进行细胞活力测算，结果表明，原代的鸭胚成纤维细胞与第一代和第二代细胞活力差异显著（P 0.05）。由于原代细胞中混有一些杂细胞而影响了细胞的活力，第二代和第三代细胞活力差异不显著，而且活力都达到了90%以上，结合细胞显微图片可知第二代和第三代细胞生长较好，胞质均匀而透亮，透明度大，折光性好，可用于鸭胚胎或生殖干细胞的共培养。第三代细胞虽然能正常传代，但是老化的速度比较快，经过48h 后细胞质就产生了空泡（见图1E 、1F ），经过3d 后细胞的纤维化程度已经很大，不能用于实验。
2.3复苏细胞培养的生长情况和形态特征
用第一代细胞进行冷冻保存，在液氮中存放一周后对其进行复苏。先进行细胞活力测定再稀释后进行培养，24h 培养后镜检发现用DMSO 冷冻保存的细胞活力最强，生长密度保持较好，且生长饱满通透，细胞轮廓清晰可见，死细胞较少，此时大部分细胞都已贴壁生长，细胞贴壁率可达85%，且细胞更纯；而用甘油和乙二醇冷冻复苏的细胞则生长状态不佳，密度较稀，贴壁率仅为30%，24h 后便有大量死细胞产生，48h 后部分细胞崩解、死亡。用甘油做冷冻液冷冻复苏的细胞还有一个奇怪的现象：贴壁的细胞上黏附了很多的细胞颗粒，并形成长串，一段黏附在贴壁细胞上，另一段浮游于培养基中（图1G 、1H 、1I ）。
结果表明，3种冷冻剂保存的细胞复苏后均与第一代细胞的活力相比存在明显差异（P
3.1胰酶和EDTA 的消化作用
动物细胞常用的培养方法有2种：组织块贴壁培养法和酶消化分离单细胞接种培养法。胰蛋白酶可以特异性地水解精氨酸与赖氨酸羧基所形成的肽键，导致细胞间质水解而使细胞块
离散成单个细胞，EDTA 是一种钙离子螯合剂，与胰蛋白酶结合使用可增强胰蛋白酶的消化效
7］
果［6，。在细胞传代培养中，0.25%胰蛋白酶作用
时间的长短十分关键。酶作用时间过长时对细胞有损伤；而消化时间过短则难以打破细胞之间的粘连，致使有些细胞消化不下来［8］。本试验运用酶消化分离单细胞接种培养法培养鸭胚成纤维细胞，在分离原代细胞时通过二次消化获得细胞，每次消化10min ，一共不超过25min ，以免对细胞产生毒性。传代时由于细胞呈单层贴于细胞瓶底部，所以消化时间比较短，只需1~2min 即可。本试验形态学观察发现，上皮细胞和成纤维细胞同时出现在原代培养及早期传代培养中，混入的上皮细胞一定程度上侵占了成纤维细胞的生存空间。在消化培养细胞时，由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶耐受性不同，一般情况下成纤维细胞先脱壁，而且传代后贴壁快，附着快，多数能在10~30min 完成附着。但是大部分上皮细胞在短时间内不能附着或附着不稳定，稍振动即浮起，需要生长基质如胶原或其它细胞外基质成分等的支持，因此，用酶法和反复贴壁法处理3~4代后，成纤维细胞便能纯化［9~11］。因此，利用这个差别，经酶消化法和反复贴壁法处理1~2代后，能够相应地纯化成纤维细胞。
3.2血清浓度对细胞的影响
血清中含有促细胞贴壁的成份，有助于成纤维细胞贴壁生长［12］。一般说来，不同细胞对营养液中的血清浓度要求不同。就同一种细胞来说，不同血清浓度对细胞生长与维持的影响也不尽相同。本试验采用8%~10%FBS 的培养基培养细胞，生长速度快，一般12~16h 即可长成致密的单层细胞，当细胞已处于生长期时采用4%FBS进行维持培养。
细胞在生长时，最低血清浓度在5%、pH 值为6.8~7.2时，生长状态较佳；维持细胞时，血清浓度在2%~4%、pH 值在7.4~7.6时较好，添加L-谷氨酰胺后，细胞的贴壁性增强。这可能是由于L-谷氨酰胺为细胞生长提供碳源及生长因子的缘故。8%~10%FBS 在用于原代细胞和次代细胞的培养中，因其血清含量高，细胞生长速度较
快，但一旦长满后若不及时更换维持液，则细胞会很快老化。4%~6%FBS 同样可作为原代细胞和次代细胞的生长液，其虽不如8%~10%FBS 的生长速度快，但血清用量减少，利用率提高，细胞生长也比较均匀一致，且老化速度较慢［5］。本试验中也出现了这些现象，当血清浓度过高时，在48h 内就能发现细胞老化现象，而且随着细胞继代的次数增多，细胞老化的速度也越来越快，这就更加需要控制好血清的浓度，延缓细胞的衰老。
3.3冷冻保护剂的作用
细胞冷冻打破了细胞的正常生理过程，冷冻时会在细胞内部形成冰晶，破坏细胞的正常结构，从而对细胞造成一定的损伤，在冷冻过程中添加一定浓度的冷冻保护剂可以在一定程度上降低冷冻所造成的损伤。
本试验用3种不同的冷冻保护剂冷冻保存了同一批细胞，采用10%DMSO/甘油/乙二醇+20%FBS+70%DMEM 作为冷冻液，分装好的细胞先在4℃冰箱中平衡2h ，再移入-20℃或者-30℃冰箱平衡30min ，再在-70℃过夜，第2天投入液氮中保存。常温时冷冻剂对细胞的毒害作用较大。而在4℃时，毒害作用减弱，所以在细胞冻存时应尽量缩短冷冻剂与成纤维细胞在4℃以上的接触时间。降温和复温速度是影响细胞存活的关键因素。为保持细胞最大存活率，采用慢冻快融的方法，冻存液中加入保护剂后，可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，使细胞内水分在冻结前透出细胞外，从而减少细胞内冰晶的形成。细胞复苏时采用37℃水浴快速复温法，使之迅速通过细胞最易受损伤的-5~0℃。
［13］
的大力帮助。感谢卢立志研究员、杨倩教授、李进军博士、邓晓辉试验过程中给予的帮助，谨以致谢。
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本研究表明，采用10%的冷冻保护剂，可对成纤维细胞起到较好的冷冻保护效果，这与以往的
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效果最为明显，而甘油和乙二醇在低温下对细胞有一定的保护效果，但是效率很低，复苏后的细胞并不能用于实验。细胞冻存前后存活率的下降表明细胞在冷冻和复苏的过程中可能受到一些损伤，亦或冷冻保护剂对细胞产生了毒性作用。
致谢：
本试验得到浙江省农业科学院畜牧研究所
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