不同地理种群小菜蛾的遗传多样性分析_王少丽

第22卷第10期2002年10月

生　　态　　学　　报V ol. 22, No. 10Oc t. , 2002

不同地理种群小菜蛾的遗传多样性分析

王少丽, 盛承发, 乔传令*

(中国科学院动物研究所农业虫鼠害综合治理研究国家重点实验室, 北京　100080)

摘要:采用水平切片淀粉凝胶电泳方法, 分析了北京、河北、云南和武汉4个不同地理种群的小菜蛾的等位酶, 得到了3个酶系统(甘油醛磷酸脱氢酶(GP D ) 、苹果酸酶(ME ) 和苹果酸脱氢酶(MD H -1, MD H -2和MD H -3) ) 5个基因位点的资料。用Bios ys 2. 0软件计算了不同地理种群的遗传变异指标(N 、A 、P 、H o 和H e ) , 结果表明小菜蛾各种群内的基因多样性大于各种群间的基因多样性(约15倍) , 武汉种群小菜蛾的遗传多样性最大。并计算了遗传距离D 和相似性系数, 并由此得出聚类图, 分析了小菜蛾不同地理种群间的遗传关系。关键词:等位酶; 小菜蛾; 淀粉凝胶电泳; Biosys 2. 0; 遗传多样性

:Plutellidae ) Genetic Variability of Plutella xylostella (Lepidoptera

Population From Different Geographies

W ANG Shao-Li, SHEN G Cheng -Fa, Q IAO Chua n-Ling 　(State

Ecolog ica Sinica , 2002, 22(10):1718～1723.

Key Laboratory of Integ rated

Manag ement of Pest Insects and Rodents , Institute of Zoology , Ch ines e Academy of Scienc es , Beijing 10080, China ). Acta

Abstract :The a na ly sis of a llo zy mes ha s many specific adva ntag es in ana ly zing g enetic v ariabilities and di-v er sities , so it has been widely used in the po pulatio n differ entiation , div er sity and differ entiatio n o f species . Some pr ev io us studies hav e been documented tha t allo zy me analy sis , g ene flo w a nd evo lutio n in-ter -population ar e clo sely rela ted. Diamo ndback mo th (DBM , Plutella x ylostella L. ) is a cosmo po litan in-sec t pest, which mainly feeds o n cr ucife rous v eg etables. Widespread use o f insecticides ha s led to the selec-tio n of r esistance in DBM . T he pr esent w or k w as underta ken to study the g enetic v ariability of DBM fro m differ ent g eog ra phies .

Four po pula tio ns o f DBM w ere co llected fro m Beijing , Hebei, Yunna n a nd W uhan in China in 1997. They we re r ea red in the la bo ra tor y until the 4th instar , and then deep-fr ozen for further analy sis. T he al-lo zymes w ere identified in sing le individua l homo ge nates analyzed by star ch electro pho resis with TM E 7. 4buffer sy stems accor ding to Pa steur et al and da ta fro m 5po ly mo rphic loci (GP D , ME , MD H -1, MD H -2and MD H -3) w ere analyzed. In genera l, iso zy mes w er e co nce rned w ith ide ntificatio n of allele f requencies at ev en the ba sic lev el st rains, th us the allele f requencies of each g ene lo cus in ea ch po pulatio n sho uld be calcula ted respectiv ely . The allele fr equency wa s analy zed acco rding to the fo rmula of N ei (1978). It w as demonstra ted tha t all of the allele frequencies wer e betw een 5～10and the big g est w as 10(the lo cus is ME and MD H -1). Ba sed o n the allele frequencies, 4index es mainly repr ese nting the g enetic div ersity of po pu-la tio n w ere obtained by a sof twa re Bio sys-2. 0:N , A , P , Ho a nd He , w hich mea ns sa mple size per lo cus, numbe r of alleles per locus , percentag e o f lo ci po ly mo rphic , observ ed het ero zyg o sity a nd expected het-ero zygo sity respectiv ely. The ca lcula ting fo rmula o f these index es w as fo llow ed Wa ng Z R. Finally, g enet-基金项目:中国科学院知识创新工程资助项目(KS CX2-01-02) 收稿日期:2001-05-23; 修订日期:2002-03-15

作者简介:王少丽(1975～) , 女, 河南人, 博士。主要从事昆虫生态和昆虫抗性分子遗传学方面的研究。致谢:中国科学院动物研究所叶镇清硕士在软件使用和结果处理方面给予极大帮助, 谨表衷心谢忱. *通讯作者:Au tho r for corres pondence

10期王少丽等:不同地理种群小菜蛾的遗传多样性分析1719　

ic distance (D ) and similarity co efficient w ere calculated and the dendr og rams w ere g enera ted fr om them .

As mentio ned abov e, w e hav e obtained the main conclusio n tha t the g enetic va ria bilities within po pu-la tio ns ar e la rg er than that of among popula tio ns (about 15times) and the g enetic v a riabilities in W uhan is the larg est amo ng the selec ted popula tio ns . It is likely that the insecticide -a pplying histo ries a re differ ent

in differ ent geo g raphic areas . The diamo ndback mo th mainly spr ea ds r elying on the transpo r t of c rucifer-ous v ege ta bles f rom o ne place to another , so the g enetic div ersities a mong populations a re sma ll. Com-pa red with it, the g enetic va ria bilities within po pula tio ns w er e much mor e la rg er, which sho wed tha t the specific -g ene of diamondback moth amo ng differ ent g eog raphies flo wed v ery f requently . Based on tho se o b-serva tio ns , so me manag ement strateg ies o n insecticides r esista nce w ere br ough t a bo ut .

Comparisons o f our r esults w ith the da ta repo r ted in the lite ratur es indicate the allozymes we re g ener-ally ev olving under habita t-differentia l selection, but the precise ba lance o f mig ration a nd selectio n that de-ter mines equilibrium allele f requencies v aries g r ea tly a cro ss China . Considering th e allo zymes lo ci obtained fr om star ch electro pho r esis a re v ery limited, fur th er studies to v erify and supply th e results w er e dis-cussed.

Key words :allo zy me; Plutella x ylostella ; starch eletro pho resis; Biosys2. 0; g ene tic v ariability

文章编号:1000-0933(2002) 10-1718-06　中图分类号:Q 963　文献标识码:A

物种的遗传多样性是物种进化的动力, 它可以通过形态特征、生理特征或DN A 序列特征来体现, 同工酶研究在研究群体的遗传变异和遗传分化的研究方面有着突出的优点[1], 因此在探讨昆虫种间的近缘关系、种或亚种的差异、种群结构、种下分化等方面有广泛的应用。姜仲雪等[2]用PA GE 法分析了秆野螟属(Ostrinia ) 5个近缘种的4种同工酶, 根据遗传距离法首次提出宁夏苍耳螟为欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis ) 的一个亚种的观点。M allet [3]用淀粉凝胶电泳测定了烟芽夜蛾(Helithis virescens ) 和美洲棉铃虫(Helicov erpa . zea ) 的自然种群的等位酶变异, 目的是研究基因流动、抗药性和类群内进化关系。

小菜蛾是十字花科蔬菜上的主要害虫。1953年就开始报道它对化学农药的抗药性[4], 截止目前为止, 它已对50多种杀虫剂均产生了不同程度的抗药性[5]。对不同地区小菜蛾的遗传分化和基因流动研究较少, 不同地区因为施药历史的不同, 其对各种不同杀虫剂的抗药性也会有所不同。对不同地区小菜蛾的遗传分化程度大小和基因流动的研究较少, 故研究不同地理种群小菜蛾体内等位酶的变化可有助于了解不同地区的小菜蛾抗性发展规律和基因流动在不同地理种群的抗性发展中的作用。1　材料与方法1. 1　材料

1. 1. 1　供试小菜蛾　各供试的小菜蛾种群的采集情况见下表。其中北京种群是由动物所有害生物研究中心抗性分子遗传学组采集, 另外3个种群由中国农业大学的高希武教授提供。

各小菜蛾种群采集之后在室内饲养, 挑选4龄的小菜蛾幼虫; 对照品系是致倦库蚊Selex 品系, 采自美国加州野外, 对有机磷杀虫剂有一定的抗性。各种群经液氮速冻后, 在-70℃冰箱中保存待用。1. 1. 2　供试试剂　水解淀粉(star ch hydro lized ) , 法国科学家科学与进化研究所产品, 苹果酸(M alic acid ) 德国M erch 公司产品, 固蓝RR 盐(fast blue RR salt ) Fluka 公司, 辅酶I (N AD ) 、辅酶II (N A DP ) 、吩嗪甲硫酸(Phenazine methosulfa te , PM S) 、氮兰四唑(T etr azo lium nit ro blue, N BT ) 、噻唑表1　本研究中所用的不同的小菜蛾种群

　The diff erent populations of diamondback moth Table 1

included in the study

种群代号种群名称Population Name of No . population

云南种群

Yunnan population 北京种群

B J

Beijing popu lation 河北种群

Heb ei population 武汉种群

W H

采集地点Location 云南Yu nnan

北京郊区菜田Beijing 河北宣化

Xuanhua, Hebei 武汉菜田

　1720生　态　学　报22卷

乙酸萘酯为分Glyce rophosphate ) 、琼脂糖(Ⅱ型) 均为Sig ma 公司产品, T ris , 加拿大Sa ng on 公司产品, α, β-析纯。1. 2　方法

1. 2. 1　水平切片淀粉凝胶电泳　电泳方法参照Pasteur 等[6]的方法进行。采用T M E (Tris -M alate -。用ED T A ) (T ris 0. 1mol /L , M alic anhy dride [苹果酸酐]0. 1mo l /L , ED T A 0. 01mo l /L , M g Cl 20. 01mol /L N aO H 调p H 值到7. 4) 作为电极缓冲液。选取单个小菜蛾4龄幼虫作为样品, 加10μl 双蒸水研磨, 用Wha tman-3号滤纸作成的纸沁子吸取研磨液, 上样, 使用“SG-ZW ”型250ml 水平切片电泳槽在4℃冰箱中进行电泳, 稳压在200V , 4～6h 。1. 2. 2　谱带的分析与数据处理　参照标准品系Selex 的谱带, 确定不同种群小菜蛾的酶谱及其基因型。对每个位点的不同等位基因, 按从阴极到阳极的次序用1, 2, …表示。

通过对电泳结果的酶谱分析与记录, 按Biosys2. 0[7]要求的格式编制输入文件, 运行程序并获得了二倍体基因型频率进而计算得到基因频率以及下列种群遗传学参数:(1) 多态位点百分数P ; (2) 平均每个位点等位基因数A ; (3) 杂合度观测值H o ; (4) 杂合度期望值H e ; (5) 遗传距离和相似性系数; (6) F -统计量(F -Statistic) (7) 种群内和种群间的基因多样性指标(Dst , Gst , Ht 和Hs ) 。2　结果与分析

实验获得了3个酶系统5个基因位点的资料。各位点的等位基因频率的计算方法参见N ei [8]的公式中, 以基因位点A 的指定的等位基因(i ) 的频率(q i ) 为例:q i =(2n ii +n ij ) /(2N ) (i ≠j ) , 其中, n ii =具有

∑

纯合a i a i 基因型的个体数, n ij =具有杂合a i a j 基因型的个体数, N =个体总数, 结果见表2。

由表1可以看出, 各种群中都表现为多态位点, 等位基因数在5～10之间, 最大的等位基因数为10(位点为ME 和MD H -1) 。2. 1　种群内的遗传多样性分析

根据各位点的等位基因频率(表2) , 运行Bio sy s2. 0得出了反映群体遗传变异的4个指标(表3) 。其中多态位点的百分数P =(k /n ) ×100%, k 是多态位点的数目, n 是所测定位点的总数, 等位基因出现的频率不超过0. 95时可被看作多态位点; 每个位点的平均等位基因数A =(A 1+A 2+…+A n ) /n , A i 是第i 个位点的等位基因数, n 的意义同上; 这些参数以及下面各参数的具体计算方法可详见王中仁[1]的“遗传学计算”章节。

由表3可以看出, 小菜蛾各种群的多态位点百分数P 非常高, 均为100, 各种群的平均等位基因数也都比较大, 分别为4. 8、4. 6、5. 4和6. 0, 这表明各位点的等位基因数也呈现出较高的遗传多样性, 最大的是武汉种群(A =6. 0) 。平均杂合度期望值He 可以反映各种群的等位基因的多样性大小, 也就是“基因多样性指标”[8]。在所选的4个种群中, 最高的He (0. 532) 是武汉种群, 最低的是北京种群(0. 396) , 河北和云南种群介于二者之间, 表明北京种群的遗传变异程度较小, 武汉种群内的遗传多样性最大。从杂合度观测值Ho 可以看出, 武汉种群(0. 569) 远远大于云南种群(0. 070) , 这表明武汉种群小菜蛾中的基因最为丰富。2. 2　种群间的遗传多样性分析

由B io sy s 给出的各位点的F-sta tistics 的值(表4) , 根据Nei [9]的公式:F (I S ) =(Hs -Ho ) /Hs , F (I T ) =(Ht -Ho ) /Ht , F (S T )=(Ht -Hs ) /Ht , Dst =Ht -Hs , G st =(Ht -Hs ) /Ht 得出各种群的基因多样性指标(表5) 。其中Hs , Dst , Ht , G st 分别表示种群内基因多样度、种群间基因多样度、总基因多样度和种群间基因多样度占总基因多样度的比例。

分析上表得知, 各种群间的基因多样度很小, 最大的仅达0. 0833, 各种群内基因多样度约是种群间基因多样度的15倍(0. 5417/0.0358) 。从基因分化系数F (S T ) 来看, 各种群的基因分化程度也是群体内大于群体间的(≤0. 1123) , 最多的也仅有约10%的变异量存在于群体间, 而大部分变异则存在于群体内。就各种群内的基因多样度来说, 位点ME , MDH -2和MD H -1对各种群的遗传多样性贡献较大(大于50%) 。2. 2. 1　相似性系数和遗传距离　由各种群中等位基因的数目和等位基因频率, 得到不同地理种群小菜蛾(表6) 。

10期王少丽等:不同地理种群小菜蛾的遗传多样性分析

表2　4个小菜蛾种群中5个基因位点的等位基因频率

　Allele f requencies at 5polymorphic loci in 4populations of diamondback moth Table 2

群体Population

云南YN

1000. 0000. 0200. 0400. 7850. 1551380. 0360. 0720. 0510. 7030. 0800. 0580. 0000. 0000. 0000. 0001340. 0780. 0260. 0070. 6270. 0370. 2240. 0000. 0000. 0001050. 0570. 0000. 0290. 9140. 0000. 0000. 000920. 2010. 2500. 0110. 5160. 0000. 0000. 0220. 0000. 0000. 000

北京BJ 1340. 0000. 0000. 0370. 9250. 0371360. 1070. 1320. 1070. 5770. 0660. 0110. 0000. 0000. 0000. 000900. 3000. 0000. 0000. 5940. 0330. 0720. 0000. 0000. 000870. 1380. 0110. 0000. 8390. 0000. 0000. 011870. 0630. 0630. 0000. 7820. 0340. 0340. 0230. 0000. 0000. 000

河北HB

790. 0000. 0000. 2030. 7910. 0061140. 0310. 0660. 1930. 3990. 0880. 1580. 0570. 0040. 0000. 0041030. 3540. 0000. 0000. 4560. 0000. 1840. 0050. 0000. 0001060. 0240. 0900. 0050. 8110. 0280. 0280. 014830. 1020. 0960. 0120. 7890. 0000. 0000. 0000. 0000. 0000. 000

1721　

基因位点Locus

GP D

位点数N (N )

12345(N ) [1**********](N ) 123456789(N ) 1234567(N ) [1**********]

MD H -2

MD H -3

MD H -1

武汉W H

770. 0970. 0450. 0520. 8050. 000780. 1860. 1540. 0510. 5640. 0260. 0060. 0000. 0000. 0130. 000760. 4740. 0200. 0000. 4410. 0000. 0390. 0130. 0070. 007760. 1840. 0130. 0070. 7830. 0000. 0130. 000560. 3130. 0270. 0000. 2770. 0000. 0000. 0980. 0090. 2500. 027

*等位基因按迁移率由小到大的顺序用数字编号, N 表示样本大小Alleles are cod ed b y a numeric letter as the Rf varied from low to high , N is th e number of samples

　　由表6可以看出, 小菜蛾BJ, HB 种群间的遗传距离(0. 026) 最小, 即北京和河北种群的基因交流比较广泛; 其次是云南与北京种群间(0. 045) , 遗传距离最大的是河北和武汉种群间(0. 122) , 说明这两个地区的小菜蛾基因交流较少。相似性系数反映两个种群间的遗传一致性, 由上表中相似性系数可得出与遗传距离一致的结论。

　1722生　态　学　报

表3　不同地理种群小菜蛾的遗传变异度量指标(括号内为标准误差)

22卷

　Statistics of genetic variation of diamondback moth in diff erent geographies (s tandard errors in paren th eses ) Table 3

群体Population

云南YN 北京BJ 河北HB 武汉W H

113. 8(9. 3) 106. 8(11. 5) 97. 0(6. 8) 72. 6(4. 2)

4. 4. 5. 6. A 8(0. 6(0. 4(1. 0(0.

6) 6) 1) 6)

P 100. 100. 100. 100.

0000

0. 070(0. 061) 0. 181(0. 118) 0. 250(0. 142) 0. 567(0. 139)

0. 0. 0. 0. He 439(0. 396(0. 486(0. 532(0.

083) 088) 090) 081)

*N , 每个位点的平均样本大小M ean s ample size per locus; A , 每个位点的平均等位基因数M ean number of alleles per locu s ; P , 多态位点的百分数Percentage of loci polymo rphic ; Ho , 平均杂合度观测值M ean ob serv ed heterozygosity ; He , 平均杂合度期望值M ean expected heterozygosity 表4　4个种群各个位点的Wright [10]F -统计量分析

Table 4　Summary of F -statistics at all loci Locus GPD 　ME 　MD H -2MD H -3MD H -1M ean

F (IS ) 0. 79430. 7980-0. 10690. 43580. 62490. 4826

F (S T ) 0. 04780. 03870. 05750. 02900. 11230. 0611

F (I T ) 0. 80410. 8058-0. 04330. 45220. 66700. 5142

表5　根井正利[8]的遗传多样性指标

　Nei ' s statistics of genetic divers ity T able 5Ho

0. 07060. 15700. 68530. 17430. 24730. 2669

Hs 0. 34390. 77720. 61910. 30890. 65930. 5417

Ht 0. 36120. 80840. 65690. 31820. 74260. 5775

Dst 0. 01730. 03120. 03780. 00930. 08330. 0358

Gst 0. 04790. 03860. 05750. 02920. 11220. 0571

2. 2. 2　聚类分析　由表6中的平均相似性系数和遗传距离, 利用U PGM A (unweig hted pair \|g ro up method w ith arithmetic av erag ing ) 得出小菜蛾4个种群的聚类图, 见图1和图2。

　　利用相似性系数和遗传距离得出的聚类图(图1和图2) , 结果是一致的。北京和河北种群首先聚在一起, 可能与这两个地区相临有关; 然后与云南种群聚在一起, 最后与武汉种群聚在一起。云南在地理位置上来说, 距离这3个地区最远, 但并不是最后才与

表6　4个不同地理种群小菜蛾的相似性系数(下三角) 和遗传距离(上三角)

Table 6　Matrix of similarity coef ficient (below diago-nal ) and genetic distance (above diagonal )

群体

YN BJ HB

Population

*****0. 0450. 075YN B J 0. 956*****0. 026HB 0. 9280. 974*****W H 0. 9050. 9210. 886*

W H 0. 100

0. 0820. 122****

它们聚类, 可能由于蔬菜的运输加大了小菜蛾的基因交流, 也与杀虫药剂的抗性有关

。

图1　平均相似性系数聚类图

Fig. 1　Dend rog ram generated b y clus ter analysis of similarity

coefficient

图2　平均遗传距离聚类图

F ig. 2　Dend rog ram generated by clus ter analysis of ge-netic dis tance

3　讨论

有报道指出, 小菜蛾的扩散范围为3000km [11], 而不同种群的小菜蛾间的扩散与移动造成的后果是很明显的, 在小菜蛾药剂处理区和未处理区间的基因交流可以稀释其抗性基因, 从而延缓其抗性的发展。M ichal [12]曾对夏威夷的13个小菜蛾种群的基因流动进行研究, 发现各小菜蛾种群间的基因流动是高速进行的, 各种群内的基因多样性较大, 他分析种群内高度的基因多样性可能是由各农户之间用药不同所造成的[13]、、关,

10期王少丽等:不同地理种群小菜蛾的遗传多样性分析1723　

况将导致不同的抗性水平, 这在一定程度上导致了小菜蛾不同地理种群内的特异性。

本研究中, 所选小菜蛾种群内的基因多样性大于各种群间的基因多样性, 这与M ichal [12]的研究结果是一致的。从结果分析可以看出, 各种群内的基因多样度大约是种群间基因多样度的15倍, 各种群内表现极大的种群独特性, 而且具有丰富的种内遗传变异性, 而在不同的地理种群间, 基因交流是相当广泛的。小菜蛾不属于迁飞性害虫, 其基因的扩散很大程度上是依靠寄主的运输。各地理种群的施药历史是不同的, 造成了小菜蛾的不同的解毒酶活性, 这样各不同地理种群的小菜蛾就表现出独特的种内多样性。小菜蛾的寄主是十字花科蔬菜, 而十字花科蔬菜的分布十分广泛, 全国各地均有种植, 地理位置的连续性造成了相临地区间小菜蛾的基因交流的快速性和频繁性, 在大面积范围内也是如此, 所以很有可能形成种间的遗传多样性较小。

了解了不同地理种群的小菜蛾的种间遗传多样性性较小, 对于小菜蛾的抗药性治理来说很重要。抗药性监测时需了解相临地区的抗性对象及抗性程度, 然后有目的地施药。针对不同地区小菜蛾中存在丰富的种内遗传多样性, 在治理方面要坚持轮换施药, 降低小菜蛾抗性上升的速度, 但是在不同的地区间都需要注意间隔留下一部分敏感群体, 以期在抗性基因流动时能有所稀释。由于南北地区蔬菜的相互之间运输, 所以要特别注意施药的水平和次数, 否则极可能使大面积的小菜蛾抗性发展。

由于同工酶分析所获得的位点非常有限, 所以在小菜蛾的抗药性群体的分析上绝不仅仅是有限的几种酶起作用, 进一步的工作不仅是应增加检测的等位酶数目, 更应该用分子生物学手段取得更多的基因位点来进行分析, 求得更为确切的种群间进化关系和遗传关系。在群体分析上, 所采用的种群较少, 所以也不排除抗性等位基因较少时呈现出的一种随机事件, 故相关的研究还需进一步进行。参考文献

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