中南民族大学工商学院
酶工程技术实验论文
系专业年级题目学生学号指导教师20010年12月5日
目录
摘
要………………………………………………………………………………Y……………………2关键词………………………………………………………………………………Y……………………2Abstract………………………………………………………………………………………………….2Key wards…………………………………………………………………………………………………2前言………………………………………………………………………………………………………31.材料设备方法………………………………………………………………………………………….3
1.1材料设备………………………………………………………………………………………..31.2实验方案…………………………………………………………………………………………3
1.2.1AD 活性……………………………………………………………………………………3
1.2.2取工艺流程………………………………………………………………………………41.2.3单因素实验………………………………………………………………………………..41．2．4ADH 提取工艺的正交试验…………………………………………………………….4
2. 单因素…………………………………………………………………………………………………42．1不同因素对ADH提取效果的影响………………………………………………………………….42．1．1料液比………………………………………………………………………………….42．1．2样品处理量…………………………………………………………………………….42．1．3pH值对ADH提取效果的影响……………………………………………………………52．1．4超声波功率对ADH 提取效果的影响………………………………………………….52．1．5超声全程时问对ADH提取效果的影响……………………………………………….52．1．6提取液浓度对ADH提取效果的影响……………………………………………………5
3. 正交试验……………………………………………………………………………………………….53.1验证………………………………………………………………………………………………64.最终结论……………………………………………………………………………………………..65.误差分析…………………………………………………………………………….………………….76.参考文献…………………………………………………………………………………………………7
超声波破碎法提取啤酒废酵母中乙醇脱氢酶
肖威，张浩
中南民族大学工商学院环生系08412班
摘要：本实验以啤酒废酵母原料
【1】
，用超声波破碎法提取其中的（乙醇脱氢酶）ADH，探讨了单因素
（料液比，PH，超声功率P ，超声时间T，等）对ADH 提取效果的影响，确定最适单因素，以正交试验得到最佳提取条件，结果表明，PH值8.5，超声功率为320w 超声时间10min 为最适组合。在此条件下所得的ADH 活力值可达1634U/ml。
【3】
关键词：啤酒废酵母
【4】
；ADH；活力值；单因素；正交。
Ultrasonic fragmentation in the extraction of waste beer yeast alcohol
dehydrogenase
Xiao Wei ，Zhang Hao
Abstract:In this experiment, beer yeast as raw material, ultrasonic fragmentation method to
extract the (alcoholdehydrogenase) ADH, of a single factor (solidto liquid ratio, PH, ultrasonic power P, ultrasonic time T, etc.) on the extraction of ADH effect, determine the best single factor to get the best extraction conditions orthogonal test results show that, PH value of 8.5, ultrasonic power for the 320w is the optimum combination of ultrasonic time of 10min. Under these conditions, ADH activity values obtained up to 1634U/ml。
Key words ：abandoned beer yeast ；
ADH ；Vitality value ；Single factor ；Orthogonal 。
超声波破碎法提取啤酒废酵母中乙醇脱氢酶是为了找到较为理想的提取方案乙前言：
ADH属氧化还原
酶第一亚类，作用于一CHOH基团，是以NAD、NADP或PQQ为辅酶，催化伯醇和醛之间可逆反应的一种
含锌金属酶，为胞内酶已广泛应用于化工、医药、食品等工业领域．目前商品ADH多来源于动物肝脏，提取纯化工艺比较成熟，但其资源有限且价格昂贵，远远不能满足市场的需要，而啤酒厂废弃的啤酒酵母中含有大量的ADH．本文主要研究了从啤酒废酵母中提取ADH的工艺，为拓宽ADH的来源、降低ADH的生产成本提供了新的途径，所以，很有意义。次试验，考虑了提取的ADH的各个因素，料液比，超声时间，超声波功率，样品处理量，当然，有些东西是查阅资料后参考得到（样品处理量和料液比），实验过程中，所用仪器大都用过，通过此次试验对这些仪器的使用也是一次很好的复习。此间重做过，也抱怨过，但终究完成了它。本实验主要是自主试验探索，在老师的老师的较少指导下，我们自己查阅资料，设计方案，花费两个星期，完成，通过本实验，大家独立思考，试验，不仅学到实验本身方面的知识，而且锻炼了自己的设计试验和动手能力。
1材料设备方法等1．1仪器
仪器名称精密电子天平可见分光光度计紫外分光光度计高速冷冻离心机超声波细胞粉碎机(摇床)振荡培养箱
数量水浴锅立式压力蒸汽灭菌器
仪器型号AUY120型721E 型752型GL-21M JY92-2D KYC-100B HH-2YXQ-LS-50SU
生产厂家
上海光谱仪器有限公司上海光谱仪器有限公司上海光谱仪器有限公司长沙湘麓离心机仪器有限公司宁波新芝生物科技股份有限公司上海福玛实验设备有限公司常州国华电器有限公司
上海博讯实业有限公司医疗设备厂
1．2试剂
1.2.1试剂
试剂名称还原型辅酶I(NADH) 氧化型辅酶I(NAD)牛血清白蛋白
乙醇三水醋酸钠磷酸二氢钾磷酸氢二钠山梨醇葡萄糖
AR AR AR AR AR AR
武汉贝壳生物有限公司天津市凯通化学试剂有限公司天津市河北区海晶精细化工厂天津市凯通化学试剂有限公司天津市凯通化学试剂有限公司天津市凯通化学试剂有限公司天津市凯通化学试剂有限公司
试剂规格
生产厂家
武汉华顺生物科技有限公司
1.2.2试剂的配制
1．1材料与设备
(1)啤酒废酵母：中南民族大学工商学院环生系实验中心提供。
(2)药品试剂：辅酶I(NAD)，磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙醇等均为分析纯试剂。实验中所提到的水都是去离子水。
1.2实验方法
1.2.1ADH 活性
ADH 活性测定采用Vallec-Hoch5法将0.1mlADH酶液与3mlPH8.5的磷酸缓冲液混合，于37℃水浴预热5min，然后加入0.4ml2M乙醇（12.26ml乙醇溶于100ml水）和0．1ml 的4．5mlNAD(配方:精密称取0.032223克NAD溶于10ml去离子水中)溶液，37℃水浴反应5min，立即置于沸水中灭活，于340nm波长处检测吸光度值。空白对照用蒸馏水代替加NAD，其余均相同．
ADH酶活力(U／ml)定义：将ADH在37℃每分钟氧化乙醇脱氢生成乙醛，即还原NAD为NADH，在340nm 【5】【8】处测定的吸光度变化0．001作为一个活力单位(U)。
1.2.2取工艺流程
啤酒废酵母经反复冻融后离心浓缩，与一定体积的磷酸盐缓冲液混合，于于4℃的条件下采用超声波辅助的方法进行细胞破碎，每超声1S间歇3S，10000r／min离心15min，上清液在340nm波长处测定吸光度值，计算ADH活力。1.2.3单因素实验
在ADH提取实验中，固定其他条件，以提取液中ADH活力为指标，分别对料液比、样品处理量、提取液pH、超声波功率、超声全程时间和提取液浓度进行考察，以确定各影响因素的适宜水平。1．2．4ADH 提取工艺的正交试验
在单因素实验的基础上，选择对ADH提取效果影响较大的因素，以提取液中ADH活力为指标，按照正交试验原理进行正交设计，每个水平设3个重复，对正交试验结果进行直观分析和极差分析，以确定啤酒废酵母中ADH提取的最优方案。
2.0单因素
2．1不同因素对ADH提取效果的影响
2．1．1料液比
查阅资料可知在细胞超声破碎工艺中，提取液用量一般为样品处理量的3～5倍。但本实验通过对不同料液比下所得ADH活力进行比较，而且废酵母成分复杂不单一最终确定以啤酒废酵母量(w)：提取液(v)为1：2。
2．1．2样品处理量
分别取10
g 和20g 啤酒废酵母，按照1：2的比例用pH
为8．5的0．01mol／L磷酸盐缓冲液（配方：）
对ADH进行超声辅助提取，超声波功率250W，超声全程时问10min．ADH活力的测定结果见表一。
表一样品处理量对ADH活力的影响
酵母质量/g10
20
缓冲液/ml
2040
ADH活力（单位）
283410
由表1结果可知，采用10g和20g啤酒废酵母在相同条件下进行超声辅助提取时，ADH活力分别为283U／ml和410U／ml，后者不仅提取出的ADH活性高，而且一次可以获得较多的粗酶液，故后续实验中均采用20g的样品处理量。
2．1．3pH值对ADH提取效果的影响
取20g啤酒废酵母，用不同pH（8.5、9.0、9.5）的磷酸盐缓冲液对ADH进行提取，其他条件同2．1．2．提取液中ADH活性测定结果如表二所示．
表二．pH值对ADH提取效果的影响缓冲液PH
ADH活力/（U/ml）
8.5372
9.0353
9.5328
由表二结果可知，啤酒废酵母中ADH提取的适宜缓冲液pH为8.5。2．1．4超声波功率对ADH提取效果的影响
将20g啤酒废酵母用pH为8．5的磷酸盐缓冲液（配方：）在不同功率的超声波下进行提取，其他条件同2．1．2．提取液中ADH活性测定结果如表三由实验结果可知，适宜于啤酒废酵母中ADH提取的超声功率在320W 左右（注意：超声时金属探头一定要插入提取液，不然可能损坏超声仪，超声效果也大打折扣）。
表三.超声波功率对ADH提取效果的影响超声功率/（w）ADH 活力/（U/ml）
280380
320623
360462
2．1．5超声全程时问对ADH提取效果的影响
将20g啤酒废酵母采用功率为320W 的超声波按不同处理时间进行提取，其他条件同2．1．2．提取。液中ADH活力的测定结果如表四所示．
表四.超声全程时问对ADH提取效果的影响全程时间/（min）ADH活力/（U/ml）
10595
15481
20453
由上表可见，比较适宜的超声全程时间在10min左右。实验过程中，超声处理全程时问不同时ADH的提取结果也有所不同，处理时问过短不利于酵母细胞完全破碎，处理时间过长则会产热升温而使ADH活性降低，在后续的ADH提取工艺中，采用功率为320W 的超声波在全程时间10min下进行实验。2．1．6超声全程时问对ADH提取效果的影响选
用不同浓度的缓冲液，在功率为320W 的超声波下全程处理10min对20g啤酒废酵母进行提取，其他条件同2．1．2，ADH活性测定结果如表五所示。
表五.超声全程时问对ADH提取效果的影响浓度/（mol/L）ADH活力/（U/ml）
0.041005
0.061365
0.081617
由表五可知，最终确定提取液浓度以0．08mol／L较为适宜．考虑到温度较高时ADH活力下降较快，故整个提取过程是在冰浴状态下进行的，以维持提取液温度在4℃以下．由于0．08mol／L磷酸盐缓冲液在4℃以下时已接近饱和，因此继续提高提取液浓度没必要。
3.正交试验
啤酒废酵母中ADH提取工艺条件的优化根据单因素实验结果，以提取液pH、超声波功率和超声全程时间为影响因素，提取液中ADH活力为考察指标，设计了如下正交试验，实验结果见表六。
表六.正交试验
序号（a）PH值（b）超声波功
率/W
（c）超声全程时间
/min
10(1)15(2)20(3)10(2)15(3)20(1)10(3)15(1)20(2)[**************](R3)
ADH 活力（U/ml）
[***********][**************]4
123456789K1K2K3R
8.5(1)8.5(1)8.5(1)9.0(2)9.0(2)9.0(2)9.5(3)9.5(3)9.5(3)[**************]9(R1)
280(1)320(2)360(3)280(1)320(2)360(3)280(1)320(2)380(3)[**************]2(R2)
T=K1+K2+K3
由表六可见，由R1＞R2＞R3（3069＞1102＞584）可看出三个因素中影响大小为：PH＞超声功率＞超声全程时间，由正交试验结果可知最佳提取方案为a 1b 2c 1
3.1验证实验
按照上述正交试验结果得到的最佳方案，取20g啤酒废酵母，加入pH为8．5的0．06ol／L磷酸盐缓冲液4Oml，超声波功率为320W，每超声1s间歇3s，超声全程时间10rain，操作温度控制在4℃以下．经3次重复实验，测得提取液中ADH活力平均值为1634U／m，高于正交表中的最高值1620U／ml，可见极差分析得到的提取方案可以作为啤酒废酵母中ADH提取的最优方案。
4.结果与讨论
(1)运用超声辅助的方法对啤酒废酵母中的ADH进行提取，得到的最优工艺条件为：20g啤酒废酵母中加入pH为8．5的0.08mol／L磷酸盐缓冲液40ml（料液比1:2），采用的超声波功率为320W，每超声1S间歇3S，超声全程时间为10min，操作温度控制在4℃以下。在此条件下，获得的提取液中ADH活性最高，可以达到1652U／ml。
(2)研究表明，ADH在温度较高时活力容易损失，故ADH提取过程宜在低温下进行。将细胞冻融破碎法与超声辅助提取工艺相结合用于啤酒废酵母中ADH的提取，既可减少高温对ADH活性的影响，又能促进啤酒酵母细胞破碎，提高ADH的提取效果。
【4】
(3)目前，国内外市场中的ADH多来源于动物肝脏，资源有限，价格昂贵．由于本研究从废弃的啤酒
酵母中提取ADH，既可省略复杂的微生物发酵过程，大大减少人力、物力和财力投入，降低生产成本，又能充分利用工业废弃物，减少工业废弃物所造成的环境污染，因此是拓宽ADH来源的一条好途径。【6】
5.误差分析
5.1本实验结果误差无可避免，分析影响因素：5.2啤酒废酵母本身遭到污染；
5.3试剂配制不是很精确（例：4.5mMNAD溶液的配制：取0.03223克NAD溶于10Ml去离子水，而电子天平只能称到小数点后4位）
5.4未能及时测定提取液的吸光度，导致部分失活，结果出现偏差5.5，由于温度对其活力影响较大但本次试验每次准备数个离心管去超声室，在超声一个的时候，其他的离心管温度不能保持在4摄氏度5.6心得
通过6天的探索试验，我知道做好一个实验要有耐心（比如重做过），责任心，认真负责的心态必不可少，很多时候看似简单的问题却很容易出错。许多实验药品非常昂贵，自己配制就知道了不能浪费。本次试验锻炼了我们的合作能力和自主动手能力。
参考文献
[1]吴士筠,周岿,张凡.酶工程技术[M]，华中师范大学出版社. P17-19
[2]张云茹.乙醇脱氢酶菌株的选育及其动力学特性研究[D]．重庆：重庆大学，2004．
[3]毛跟年，张晓霞.乙醇脱氢酶提取工艺的研究[J]维普资讯2007
[4]李成伟.王莉,周庆峰.啤酒废酵母综合利用的研究进展[J].商丘师范学院学报.第23卷第9期.河
南商丘:商丘师范学院生命科学系2007年9月[5]朱明华，胡坪. 仪器分析[M]，高等教育出版社
[6]动物医学进展陕西科技大学生命科学与工程学院2007年12期
[7]李夏兰, 蔡婀娜. 从微生物细胞提取ADH 的探讨[J].华侨大学学报（自然科学版）,1997,18（2）:189-192[8]施特尔马赫. 钱嘉渊译. 酶的测定方法. 上海; 上海科学技术出版社.1983.49-50
中南民族大学工商学院
酶工程技术实验论文
系专业年级题目学生学号指导教师20010年12月5日
目录
摘
要………………………………………………………………………………Y……………………2关键词………………………………………………………………………………Y……………………2Abstract………………………………………………………………………………………………….2Key wards…………………………………………………………………………………………………2前言………………………………………………………………………………………………………31.材料设备方法………………………………………………………………………………………….3
1.1材料设备………………………………………………………………………………………..31.2实验方案…………………………………………………………………………………………3
1.2.1AD 活性……………………………………………………………………………………3
1.2.2取工艺流程………………………………………………………………………………41.2.3单因素实验………………………………………………………………………………..41．2．4ADH 提取工艺的正交试验…………………………………………………………….4
2. 单因素…………………………………………………………………………………………………42．1不同因素对ADH提取效果的影响………………………………………………………………….42．1．1料液比………………………………………………………………………………….42．1．2样品处理量…………………………………………………………………………….42．1．3pH值对ADH提取效果的影响……………………………………………………………52．1．4超声波功率对ADH 提取效果的影响………………………………………………….52．1．5超声全程时问对ADH提取效果的影响……………………………………………….52．1．6提取液浓度对ADH提取效果的影响……………………………………………………5
3. 正交试验……………………………………………………………………………………………….53.1验证………………………………………………………………………………………………64.最终结论……………………………………………………………………………………………..65.误差分析…………………………………………………………………………….………………….76.参考文献…………………………………………………………………………………………………7
超声波破碎法提取啤酒废酵母中乙醇脱氢酶
肖威，张浩
中南民族大学工商学院环生系08412班
摘要：本实验以啤酒废酵母原料
【1】
，用超声波破碎法提取其中的（乙醇脱氢酶）ADH，探讨了单因素
（料液比，PH，超声功率P ，超声时间T，等）对ADH 提取效果的影响，确定最适单因素，以正交试验得到最佳提取条件，结果表明，PH值8.5，超声功率为320w 超声时间10min 为最适组合。在此条件下所得的ADH 活力值可达1634U/ml。
【3】
关键词：啤酒废酵母
【4】
；ADH；活力值；单因素；正交。
Ultrasonic fragmentation in the extraction of waste beer yeast alcohol
dehydrogenase
Xiao Wei ，Zhang Hao
Abstract:In this experiment, beer yeast as raw material, ultrasonic fragmentation method to
extract the (alcoholdehydrogenase) ADH, of a single factor (solidto liquid ratio, PH, ultrasonic power P, ultrasonic time T, etc.) on the extraction of ADH effect, determine the best single factor to get the best extraction conditions orthogonal test results show that, PH value of 8.5, ultrasonic power for the 320w is the optimum combination of ultrasonic time of 10min. Under these conditions, ADH activity values obtained up to 1634U/ml。
Key words ：abandoned beer yeast ；
ADH ；Vitality value ；Single factor ；Orthogonal 。
超声波破碎法提取啤酒废酵母中乙醇脱氢酶是为了找到较为理想的提取方案乙前言：
ADH属氧化还原
酶第一亚类，作用于一CHOH基团，是以NAD、NADP或PQQ为辅酶，催化伯醇和醛之间可逆反应的一种
含锌金属酶，为胞内酶已广泛应用于化工、医药、食品等工业领域．目前商品ADH多来源于动物肝脏，提取纯化工艺比较成熟，但其资源有限且价格昂贵，远远不能满足市场的需要，而啤酒厂废弃的啤酒酵母中含有大量的ADH．本文主要研究了从啤酒废酵母中提取ADH的工艺，为拓宽ADH的来源、降低ADH的生产成本提供了新的途径，所以，很有意义。次试验，考虑了提取的ADH的各个因素，料液比，超声时间，超声波功率，样品处理量，当然，有些东西是查阅资料后参考得到（样品处理量和料液比），实验过程中，所用仪器大都用过，通过此次试验对这些仪器的使用也是一次很好的复习。此间重做过，也抱怨过，但终究完成了它。本实验主要是自主试验探索，在老师的老师的较少指导下，我们自己查阅资料，设计方案，花费两个星期，完成，通过本实验，大家独立思考，试验，不仅学到实验本身方面的知识，而且锻炼了自己的设计试验和动手能力。
1材料设备方法等1．1仪器
仪器名称精密电子天平可见分光光度计紫外分光光度计高速冷冻离心机超声波细胞粉碎机(摇床)振荡培养箱
数量水浴锅立式压力蒸汽灭菌器
仪器型号AUY120型721E 型752型GL-21M JY92-2D KYC-100B HH-2YXQ-LS-50SU
生产厂家
上海光谱仪器有限公司上海光谱仪器有限公司上海光谱仪器有限公司长沙湘麓离心机仪器有限公司宁波新芝生物科技股份有限公司上海福玛实验设备有限公司常州国华电器有限公司
上海博讯实业有限公司医疗设备厂
1．2试剂
1.2.1试剂
试剂名称还原型辅酶I(NADH) 氧化型辅酶I(NAD)牛血清白蛋白
乙醇三水醋酸钠磷酸二氢钾磷酸氢二钠山梨醇葡萄糖
AR AR AR AR AR AR
武汉贝壳生物有限公司天津市凯通化学试剂有限公司天津市河北区海晶精细化工厂天津市凯通化学试剂有限公司天津市凯通化学试剂有限公司天津市凯通化学试剂有限公司天津市凯通化学试剂有限公司
试剂规格
生产厂家
武汉华顺生物科技有限公司
1.2.2试剂的配制
1．1材料与设备
(1)啤酒废酵母：中南民族大学工商学院环生系实验中心提供。
(2)药品试剂：辅酶I(NAD)，磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙醇等均为分析纯试剂。实验中所提到的水都是去离子水。
1.2实验方法
1.2.1ADH 活性
ADH 活性测定采用Vallec-Hoch5法将0.1mlADH酶液与3mlPH8.5的磷酸缓冲液混合，于37℃水浴预热5min，然后加入0.4ml2M乙醇（12.26ml乙醇溶于100ml水）和0．1ml 的4．5mlNAD(配方:精密称取0.032223克NAD溶于10ml去离子水中)溶液，37℃水浴反应5min，立即置于沸水中灭活，于340nm波长处检测吸光度值。空白对照用蒸馏水代替加NAD，其余均相同．
ADH酶活力(U／ml)定义：将ADH在37℃每分钟氧化乙醇脱氢生成乙醛，即还原NAD为NADH，在340nm 【5】【8】处测定的吸光度变化0．001作为一个活力单位(U)。
1.2.2取工艺流程
啤酒废酵母经反复冻融后离心浓缩，与一定体积的磷酸盐缓冲液混合，于于4℃的条件下采用超声波辅助的方法进行细胞破碎，每超声1S间歇3S，10000r／min离心15min，上清液在340nm波长处测定吸光度值，计算ADH活力。1.2.3单因素实验
在ADH提取实验中，固定其他条件，以提取液中ADH活力为指标，分别对料液比、样品处理量、提取液pH、超声波功率、超声全程时间和提取液浓度进行考察，以确定各影响因素的适宜水平。1．2．4ADH 提取工艺的正交试验
在单因素实验的基础上，选择对ADH提取效果影响较大的因素，以提取液中ADH活力为指标，按照正交试验原理进行正交设计，每个水平设3个重复，对正交试验结果进行直观分析和极差分析，以确定啤酒废酵母中ADH提取的最优方案。
2.0单因素
2．1不同因素对ADH提取效果的影响
2．1．1料液比
查阅资料可知在细胞超声破碎工艺中，提取液用量一般为样品处理量的3～5倍。但本实验通过对不同料液比下所得ADH活力进行比较，而且废酵母成分复杂不单一最终确定以啤酒废酵母量(w)：提取液(v)为1：2。
2．1．2样品处理量
分别取10
g 和20g 啤酒废酵母，按照1：2的比例用pH
为8．5的0．01mol／L磷酸盐缓冲液（配方：）
对ADH进行超声辅助提取，超声波功率250W，超声全程时问10min．ADH活力的测定结果见表一。
表一样品处理量对ADH活力的影响
酵母质量/g10
20
缓冲液/ml
2040
ADH活力（单位）
283410
由表1结果可知，采用10g和20g啤酒废酵母在相同条件下进行超声辅助提取时，ADH活力分别为283U／ml和410U／ml，后者不仅提取出的ADH活性高，而且一次可以获得较多的粗酶液，故后续实验中均采用20g的样品处理量。
2．1．3pH值对ADH提取效果的影响
取20g啤酒废酵母，用不同pH（8.5、9.0、9.5）的磷酸盐缓冲液对ADH进行提取，其他条件同2．1．2．提取液中ADH活性测定结果如表二所示．
表二．pH值对ADH提取效果的影响缓冲液PH
ADH活力/（U/ml）
8.5372
9.0353
9.5328
由表二结果可知，啤酒废酵母中ADH提取的适宜缓冲液pH为8.5。2．1．4超声波功率对ADH提取效果的影响
将20g啤酒废酵母用pH为8．5的磷酸盐缓冲液（配方：）在不同功率的超声波下进行提取，其他条件同2．1．2．提取液中ADH活性测定结果如表三由实验结果可知，适宜于啤酒废酵母中ADH提取的超声功率在320W 左右（注意：超声时金属探头一定要插入提取液，不然可能损坏超声仪，超声效果也大打折扣）。
表三.超声波功率对ADH提取效果的影响超声功率/（w）ADH 活力/（U/ml）
280380
320623
360462
2．1．5超声全程时问对ADH提取效果的影响
将20g啤酒废酵母采用功率为320W 的超声波按不同处理时间进行提取，其他条件同2．1．2．提取。液中ADH活力的测定结果如表四所示．
表四.超声全程时问对ADH提取效果的影响全程时间/（min）ADH活力/（U/ml）
10595
15481
20453
由上表可见，比较适宜的超声全程时间在10min左右。实验过程中，超声处理全程时问不同时ADH的提取结果也有所不同，处理时问过短不利于酵母细胞完全破碎，处理时间过长则会产热升温而使ADH活性降低，在后续的ADH提取工艺中，采用功率为320W 的超声波在全程时间10min下进行实验。2．1．6超声全程时问对ADH提取效果的影响选
用不同浓度的缓冲液，在功率为320W 的超声波下全程处理10min对20g啤酒废酵母进行提取，其他条件同2．1．2，ADH活性测定结果如表五所示。
表五.超声全程时问对ADH提取效果的影响浓度/（mol/L）ADH活力/（U/ml）
0.041005
0.061365
0.081617
由表五可知，最终确定提取液浓度以0．08mol／L较为适宜．考虑到温度较高时ADH活力下降较快，故整个提取过程是在冰浴状态下进行的，以维持提取液温度在4℃以下．由于0．08mol／L磷酸盐缓冲液在4℃以下时已接近饱和，因此继续提高提取液浓度没必要。
3.正交试验
啤酒废酵母中ADH提取工艺条件的优化根据单因素实验结果，以提取液pH、超声波功率和超声全程时间为影响因素，提取液中ADH活力为考察指标，设计了如下正交试验，实验结果见表六。
表六.正交试验
序号（a）PH值（b）超声波功
率/W
（c）超声全程时间
/min
10(1)15(2)20(3)10(2)15(3)20(1)10(3)15(1)20(2)[**************](R3)
ADH 活力（U/ml）
[***********][**************]4
123456789K1K2K3R
8.5(1)8.5(1)8.5(1)9.0(2)9.0(2)9.0(2)9.5(3)9.5(3)9.5(3)[**************]9(R1)
280(1)320(2)360(3)280(1)320(2)360(3)280(1)320(2)380(3)[**************]2(R2)
T=K1+K2+K3
由表六可见，由R1＞R2＞R3（3069＞1102＞584）可看出三个因素中影响大小为：PH＞超声功率＞超声全程时间，由正交试验结果可知最佳提取方案为a 1b 2c 1
3.1验证实验
按照上述正交试验结果得到的最佳方案，取20g啤酒废酵母，加入pH为8．5的0．06ol／L磷酸盐缓冲液4Oml，超声波功率为320W，每超声1s间歇3s，超声全程时间10rain，操作温度控制在4℃以下．经3次重复实验，测得提取液中ADH活力平均值为1634U／m，高于正交表中的最高值1620U／ml，可见极差分析得到的提取方案可以作为啤酒废酵母中ADH提取的最优方案。
4.结果与讨论
(1)运用超声辅助的方法对啤酒废酵母中的ADH进行提取，得到的最优工艺条件为：20g啤酒废酵母中加入pH为8．5的0.08mol／L磷酸盐缓冲液40ml（料液比1:2），采用的超声波功率为320W，每超声1S间歇3S，超声全程时间为10min，操作温度控制在4℃以下。在此条件下，获得的提取液中ADH活性最高，可以达到1652U／ml。
(2)研究表明，ADH在温度较高时活力容易损失，故ADH提取过程宜在低温下进行。将细胞冻融破碎法与超声辅助提取工艺相结合用于啤酒废酵母中ADH的提取，既可减少高温对ADH活性的影响，又能促进啤酒酵母细胞破碎，提高ADH的提取效果。
【4】
(3)目前，国内外市场中的ADH多来源于动物肝脏，资源有限，价格昂贵．由于本研究从废弃的啤酒
酵母中提取ADH，既可省略复杂的微生物发酵过程，大大减少人力、物力和财力投入，降低生产成本，又能充分利用工业废弃物，减少工业废弃物所造成的环境污染，因此是拓宽ADH来源的一条好途径。【6】
5.误差分析
5.1本实验结果误差无可避免，分析影响因素：5.2啤酒废酵母本身遭到污染；
5.3试剂配制不是很精确（例：4.5mMNAD溶液的配制：取0.03223克NAD溶于10Ml去离子水，而电子天平只能称到小数点后4位）
5.4未能及时测定提取液的吸光度，导致部分失活，结果出现偏差5.5，由于温度对其活力影响较大但本次试验每次准备数个离心管去超声室，在超声一个的时候，其他的离心管温度不能保持在4摄氏度5.6心得
通过6天的探索试验，我知道做好一个实验要有耐心（比如重做过），责任心，认真负责的心态必不可少，很多时候看似简单的问题却很容易出错。许多实验药品非常昂贵，自己配制就知道了不能浪费。本次试验锻炼了我们的合作能力和自主动手能力。
参考文献
[1]吴士筠,周岿,张凡.酶工程技术[M]，华中师范大学出版社. P17-19
[2]张云茹.乙醇脱氢酶菌株的选育及其动力学特性研究[D]．重庆：重庆大学，2004．
[3]毛跟年，张晓霞.乙醇脱氢酶提取工艺的研究[J]维普资讯2007
[4]李成伟.王莉,周庆峰.啤酒废酵母综合利用的研究进展[J].商丘师范学院学报.第23卷第9期.河
南商丘:商丘师范学院生命科学系2007年9月[5]朱明华，胡坪. 仪器分析[M]，高等教育出版社
[6]动物医学进展陕西科技大学生命科学与工程学院2007年12期
[7]李夏兰, 蔡婀娜. 从微生物细胞提取ADH 的探讨[J].华侨大学学报（自然科学版）,1997,18（2）:189-192[8]施特尔马赫. 钱嘉渊译. 酶的测定方法. 上海; 上海科学技术出版社.1983.49-50